全 文 ：基模势对 luxAB标记的快生型大豆
根瘤菌在土壤中存活的影响*
崔明学 张成刚 靳素英 李明祺
(中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 110015)
摘要 经接合转移将 luxAB 基因插入快生型大豆根瘤菌( Rhiz obium f redii )染色体, 取
可高效结瘤固氮的 R . f redii lux3 菌株用于分子生态学研究. 在不同基模势下, 研究了
lux3在土壤中的存活,基模势为- 30 和- 750 kPa 时, lux3 在灭菌土中的生存能力明显( P
< 0. 05)高于未灭菌土, 当基模势为- 1500 kPa时, 土壤是否灭菌对 lux3 的存活影响没有
差异.不同基模势对 lux3 活性影响显著, 在- 1500 kPa的未灭菌土中, 随着饥饿时间延
长,可恢复活性的细菌数量显著下降. 同时比较了测定微生物活性的 3 种方法(即生物发
光、脱氢酶活性和微生物呼吸) ,发光值变化与活细胞密度变化一致, PLf值(即潜在发光,
Potential luminescence)反映了可恢复活性的饥饿种群密度. luxAB 基因是一种比较简便而
实用的标记.
关键词 快生型大豆根瘤菌 基模势 存活 luxAB 基因
Effect of matric potential on the survival of luxAB marked Rhizobium f redii in soil. Cui
M ingxue, Zhang Chenggang, Jin Suy ing , Li M ingqi( I nstitute of Applied Ecology , A cademia
Sinica, Shenyang 110015) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 1997, 8( 5) : 519~ 526.
The luxAB gene w ere inser ted into the chromosome of R hiz obium f r edii by conjugation. R .
f r edii lux3 which could nodulate soybean and fix nitrogen efficiently w as used in study ing on
molecular ecology of R . f r edii. The surviv al and activity o f R. f r edii lux3 were studied fol
lowing inoculation into soil microcosms at different matric potentials. Sur vival were significantly
( P< 0. 05) greater in ster ile so il at - 30 and - 750 kPa than that in nonsterile so il. Sur vival at
- 1500 kPa w as not affected by auto claving of soil. The activity of R . f r edii lux3 in soil were
influenced significantly by different matr ic potentials. Reactiv ation decreased greately w ith pro
lo nged starvation. Population activity w as measured by liquid scillinat ion, dehydrogenase activit y
and respiration. Metabolic activity measur ed by luminescence decreased significantly with time
( P< 0. 05) . Luminescence follow ing amendment w ith substrates ( potential luminescence, PLf)
demonstr ated the time required for activation of the starv ed inoculum. Therefore, luxAB gene
was a convenient and useful marker for R. f redii.
Key words Rhiz obium f r edii, Matr ic potential, Survival, luxAB gene.
* 国家自然科学基金 ( 39570027) 和中国科学院陆
地生态系统痕量物质生态过程开放实验室基金资助项
目.
1997年 7月 14日收稿, 8月 27日接受.
1 引 言
尽管转基因微生物在实验室研究中已
经表现出良好的应用前景, 其有利特性能
否在自然环境中表达仍需进一步研究[ 9] ,
对于大多数土壤微生物来讲, 其作用的发
挥依赖于其在土壤中的生长和存活. 土壤
是一种不连续的、高度异质的环境,影响细
菌存活的因素很多, 大致可分为生物因素
和非生物因素两大类. 非生物因素包括土
壤类型、温度、有效碳、土壤含水量、土壤
pH 等; 生物因素包括接种细菌的生理状
应 用 生 态 学 报 1997 年 10 月 第 8 卷 第 5 期
CH INESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Oct. 1997, 8( 5)!519~ 526
态、植物根际、接种细菌的竞争能力、土著
微生物和原生生物的取食等, 各种酶和抗
生素也会影响物种的存活[ 3, 6, 11] . 其中土
壤水含量的影响较大.
快生型大豆根瘤菌( Rhiz obium f redi
i )是我国的特有资源,具有生长速度快、耐
高 pH 值,可高效结瘤固氮等特点,有强大
的农业应用潜力,因而对该菌进行生态学
研究十分必要.
为了有效监测引入环境的微生物, 目
前已经开发的监测标记包括抗性基因、发
光标记和发色标记基因等,相比之下,发光
标记基因是一种比较灵敏、简便和快速的
方法。本文选择 luxAB 基因作 R . f redii
监测标记, 但是 Lux 基因及其表型能在多
大程度上反映被标记细菌在土壤中的活性
和活细胞数量,在比较干燥的土壤中基模
势如何影响 R . f redii 的存活和 luxAB 基
因的表达和稳定性, luxAB 标记菌在土壤
的竞争能力如何,对 luxAB标记细菌的发
光检测是否优越于传统的测定微生物活性
的方法等问题还是一个未知数, 对 R .
f redii 来讲, luxAB 基因是外源基因,
luxAB标记菌同样是转基因微生物, 在土
壤微宇宙中对其进行安全性评价是十分重
要的.本文针对以上问题进行了研究,为未
来以 R . f redii 为宿主的转基因根瘤菌的
大田应用提供基础生态学资料.
2 材料与方法
2. 1 菌株与质粒
所用菌株有 E . coli S171 ( pUTLux ) , 质粒
pUTlux 携带 mini- Tn5- luxAB 基因和 tnp 基
因; R . f redii QB1130( Strr) ,系中国科学院沈阳应
用生态研究所保藏菌株. 细菌的培养条件、细菌
接合程序、R . f r edii 结瘤和固氮能力的测定方法
见文献[ 2, 3] .
2. 2 根瘤菌总 DNA提取
将根瘤菌接种于 TY 培养基, 在 28∀ 条件下
摇床培养 16~ 24 h,每个 EP 管中加入 1. 5 ml菌
液, 离心收集菌体.将沉淀物悬浮于 200l裂解缓
冲液中 ( 快速吹打使其裂解) . 加入 66l 5 mol
NaCl溶液, 混匀 , 12000 rpm 离心 10~ 15 min. 将
上清液转移另一新 EP 管中, 加入等体积氯仿, 轻
轻倒转至少 50 次直至形成一种奶状溶液, 10000
rpm 离心 6~ 10 min将上清液转移到另一 EP管,
用等体积无水乙醇或 0. 6 体积异丙醇沉淀.用钩
钩出或离心收集白色絮状沉淀,用 70%乙醇洗两
次,自然吹干或在冷冻真空干燥器中抽干. 最后
溶于 50l TE 缓冲液备用.
质粒 DNA 制备、Southern 杂交和其它 DNA
操作方法参考文献[ 11] .
2. 3 土壤微宇宙
供试土壤采自中国科学院沈阳生态站无污
染实验小区表层 ( 0~ 20 cm) ,其基本理化性质见
表 1,土壤水分特征曲线见图 1.
图 1 土壤水分特征曲线(基模势均为负值)
Fig. 1 Soil moisture characteristics curve.
表 1 供试土壤基本理化性状
Table 1 Properties of experimental soil
有机碳
Organ ic
carbon
( % )
pH
(H 2O)
CEC
( mval#
( 100 g- 1
soil)
质地 Texture( % )
砂
Sand
粉砂
Silty
san d
粘粒
Clay
含水量
Moisture
content
( % )
1. 47 6. 3 16. 9 27. 5 57. 9 14. 6 15. 7
在 50 ml烧杯中装入 50 g 灭菌或未灭菌土壤
(干重) ,加入 Ca( OH) 2调节 pH 值为 7. 0.将接种
后细菌终浓度调节为 108cells#g - 1干土. 细菌培
养、收集和菌悬液的制备参考前文[ 3] . 通过添加
无菌蒸馏水将接种后土壤水势调节为 - 30、-
750 和- 1500 kPa (对应含水量分别为23. 4、20. 1
和 18. 5% ) ,根据已往实验结果, - 30 kPa适宜于
微生物生长和活性, - 1500 kPa为植物萎焉点.
520 应 用 生 态 学 报 8 卷
接种后,将土壤微宇宙置于培养箱培养 2 个月,
间隔一定时间取样, 分别测定细菌数量、生物发
光、脱氢酶活性和呼吸作用. 用喷洒器小心加水
弥补流失的水, 以保持土壤水恒定. 烧杯置于一
个塑料盒,在盒底保存一层水, 以保持 100%的相
对湿度.
2. 4 发光标记细菌检测
将待测细菌培养液与 1l癸醛在 1. 5 ml塑
料离心管内混合均匀后, 立即置于闪烁瓶内, 置
于液体闪烁仪,记录 cpm 值, 并以 cpm 值表示细
菌发光的相对活性值. 平板培养计数时, 在平皿
盖内面滴加 1滴癸醛, 在室温下放置 5 min, 在暗
室观察和计数发光菌落数, 同时可用 kodak T
Max ( ASA800)直接拍摄 ( 曝光时间约为 3 h, 显
影时间约为 1 h) .
最终潜在发光值( PL f, final po tential lumines
cence)测定,将 1 g 土壤置于 9 ml磷酸缓冲溶液
( 1. 2 mo l KH2PO4 , pH 7. 2) , 振荡 10 min 得到土
壤悬浮液, 0. 5 ml土壤悬浮液和 1 ml培养基混
合,一定时间内每隔 15 min 测定一次发光值. 确
定潜在发光动力学和最终潜在发光值.
2. 5 统计分析
按照完全随机化设计方法设计实验, 每一实
验方案均设 3 个重复, 方差分析后, 确定土壤灭
菌与否以及不同的基模势对细菌存活之间是否
存在显著性差异.
3 结果与讨论
3. 1 luxAB标记的 R . f r edi i菌株构建
E . coli S 171 染色体上含有 T ra 基
因,可转移携带 Mob 基因的质粒. 当 R .
f redii QB1130 与携带 pUTLux 质粒 E .
coli S171接合时,质粒在 S171细菌的帮
助下, 可转移至 QB1130中.由于该质粒为
自杀型质粒, 在肠杆菌以外的细菌中不能
复制, 在接合子的子代细胞中将丢失, 但
miniTn5luxAB在 tnp基因编码的转座酶
作用下,可转座插入到 QB1130染色体. 这
种转座是随机的,选择接合子时,使用基本
培养基, 排除了生化代谢损伤的接合子.
lux 标记菌株可经发光监测初步筛选(见图
版) , 随机挑选 6 株 LuxAB 标记菌株, 经
Southern杂交证明 LuxAB已插入 QB1130
的染色体(见图版) . 标记菌的主要特征列
于表 2.
表 2 标记菌株主要特征
Table 2 Main characteristics of marked strains
菌 株
St rains
标记基因
Marker
gene
结 瘤
Nodulation
固 氮
Nit rogen
f ixat ion
代 时
Doubling
t ime
QB1130 + + 2. 3
LUX1 lux + + 2. 9
LUX2 lux + + 2. 3
LUX3 lux + + 2. 1
LUX4 lux + + 3. 3
LUX5 lux + + 3. 0
LUX6 lux + + 2. 7
3. 2 土壤中潜在发光值测定的最佳条件
由于培养基类型较多, 仅比较了 N 源
丰富的 LB 和 TY 培养基及 C 源丰富的
YM 培养基, 以检验不同培养基对细菌潜
在发光的影响, 结果表明, 以 TY 为最好
(未列出数据 ) . Meikle等[ 4]曾报道柠檬酸
钠的浓度对 luxAB 基因标记的 Pseu
domonas f lur ecens 的发光影响较大, 因此
本实验采用了 4 种不同含量柠檬酸钠的
TY液体.图 2中 a~ d分别表示在灭菌土
壤中加入含 10、25、50、100 mg #L - 1柠檬
酸钠的 TY 培养基后 luxAB标记菌株的潜
在发光动力学. 加入含 10 mg#L - 1柠檬酸
钠的 TY培养基 0. 6 h后得到最大发光值
(图 2a) , 柠檬酸钠加入 25mg#L - 1时, 最大
发光值降低 (图 2b) , 加入 50、100mg#L - 1
时,发光受到抑制(图 2c、d) .
理论上,加入基质后,发光量立即增加
到一个常数值,在整个培养期间保持不变,
但从图 2可以看出, 发光达到最大值存在
延迟期,其原因在于种群活力恢复延迟.经
过几次重复培养实验,选择 2. 5 h培养测
定种群活力和发光动力学比较适宜,在此
期间可以达到最大发光值, 如果延长培养
时间,细菌进入指数生长期,测定的发光值
5215 期 崔明学等:基模势对 luxAB标记的快生型大豆根瘤菌在土壤中存活的影响
图版说明
Explanation of Plate
1.细菌接合 24 h后,在选择性平板上长出的 luxAB基因标记的 R . f redi i 接合子单菌落.对菌落在( a)自然光和( b )暗
室内用 Kodak TMax ASA800 拍摄.
T he plate shows growth of colonies f rom transconjugant suspension wh ich made 24 h after conjugat ion experiments. Pho
t ographs of the plate w ere taken ( a) in the light , and ( b) in the dark w ith Kodak T - Max ASA800.
2. luxAB标记的 R . f redii 总DNA 经 EcoR∃酶切后电泳图谱( A) ,及 Southern转移后32P标记的 luxAB探针杂交放射
自显影图( B) .
E coR ∃ rest rict ion pattern of luxAB mark ed st rains (A) , and the corresponding autoradiogram of 32P- labeled probe DNA.
A.由左%右: 1: DNA/ Hind& ; 2: pUT- lux; 3和 11: QB1130; 4% 10: luxAB标记菌; 2% 11均经 EcoR∃酶切.
From left side to right side: Lane 1: DNA/ Hind& ; Lane 2: pUT - lux/ EcoR ∃; Lane3 and 11: QB1130/ EcoR∃ ; Lane
4% 10: luxAB marked R . f red ii / EcoR∃ .
B.由左%右: a% j与 A中 2% 11相对应. From left side to right side: a% j is the same as 2% 11 ( A) .
就不是潜在发光值了.
综合以上结果, 测定土壤中潜在发光
的最佳条件是向土壤微宇宙中加入含
10mg#L - 1柠檬酸钠的 T Y( 2 ∋ )培养基,
培养时间约为 2. 5 h, 在 2. 5 h时得到的细
菌发光值即为最终潜在发光值( PLf ) .
3. 3 不同基模势土壤中活细胞浓度和
PLf值的变化
522 应 用 生 态 学 报 8 卷
前文[ 3] 报道土壤灭菌与否对 R .
f redii T n5 突变株存活的影响较大, 因而
本实验分别在灭菌和未灭菌土壤中进行了
研究. 水活度( water availabity ) 是影响细
菌存活一个重要因素. 土壤水含量表达方
式较多,土壤水重量百分含量( W/ W)等表
图 2 接种 R . f redi i lux3 的灭菌和未灭菌土壤中加入
T Y液体培养基后 2h培养期间发光值的变化( T Y 中分
别含有 ( a) 10、( b) 25、( c) 50、( d) 100 mg#L- 1柠檬酸
钠)
Fig. 2 Changes in luminescence in samples of sterile and
nonsterile soil inoculated w ith lux3. Sample amended with
T Y supplemented with ( a) 10, ( b ) 25, ( c) 50, ( d) 100
mg#L- 1 sodium citrate and incubated for 2 h. ∃ .灭菌土
壤 Sterile soil, ( .未灭菌土壤 Nonsterile soil .
达方式难于表明不同土壤的田间持水量.
为了解决这一矛盾, 多以 kPa 或 bar 表示
的水势表达土壤有效水含量.
在一定的水压力 (基模势或渗透势)
下,微生物需消耗能量以维持细胞的完整
性,当基模势下降时(水压力升高) ,充水的
土壤孔数量和直径减小, 细菌和其它的单
细胞生物会由于缺乏联结空气空间的丝状
结构而受水膜厚度和充水孔径大小的限
制,在较高的基模势压力下物质扩散也受
到限制,从生态物理学意义上讲,基模势压
力比相同的渗透势压力强大得多.
由图 3可见,随基模势降低,细菌的存
活能力下降. 在- 30 kPa 时, lux3 菌株经
历了较长时间的饥饿以后, 活细胞种群密
度仍较大,在第 60天时, 活细胞浓度仅下
降了 2个数量级.在- 750 kPa时, lux3菌
株的活细胞浓度未经历增殖阶段即呈下降
趋势,在第 21天时活细胞浓度下降 2个数
量级(图 3b) . 在- 1500 kPa 时, 活细胞浓
度和 PLf 值变化均比基模势为- 30 kPa
和- 750 kPa 时大得多(图 3c) , 第 7天时
PLf值比基模势为- 30 kPa 和- 750 kPa
时的 PLf值低 3个数量级,在第 40天时检
测值与本底值相近,无法检测其确切值(图
3c) .在 3 种基模势下, PL f 值与细菌存活
趋势一致,添加营养物质有利于细菌存活,
延缓了 PLf值的下降速率.
由图 4可以看出,未灭菌土壤中,基模
势对 R . f r edi i lux3 菌株的影响与灭菌土
壤中的结果表现了类似的趋势,但在未灭
菌土壤中土著微生物明显不利于细菌的长
期存活,特别是在较高的两种基模势( - 30
和- 750 kPa)下, 这一现象最为明显. 在较
低的基模势( - 1500kPa)下, 细菌存活能
力与灭菌土壤中同一基模势下的结果没有
显著差异( P< 0. 05) , 接种后立即测得的
PLf值与同一基模势下灭菌土壤 PLf值相
5235 期 崔明学等:基模势对 luxAB标记的快生型大豆根瘤菌在土壤中存活的影响
图 3 不同基模势下灭菌土壤中 R . f r ed ii lux3活细胞
浓度和 PLf值变化
( a) - 30 kPa, ( b) - 750 kPa, ( c) - 1500 kPa. 实线表示
未添加营养物质( - N) ,虚线表示添加营养物质( + N) .
Fig. 3 Changes in viable cell concent rat ion and PLf in sterile
soil inoculated with R . f r ed ii lux3 at dif ferent matric po
t ent ial. SEs for viable cell concent rat ion and PLf w ere <
25% of the mean.∃ . Cell conc. ( + N) , ( . Cell conc. ( - N ) , & . PLf ( +
N) , ). PLf( - N) .下同 The same below .
近,但低于- 30和- 750kPa 未灭菌土, 与
灭菌土壤中的活细胞浓度和PLf值变化一
致(图 4c) . 添加营养物质有利于细菌存
活.
本实验结果表明, 不同基模势对细菌
存活的影响之间差异不显著, 这与 Ratt ray
等[ 6]的研究结果不一致, 他们发现较高的
基模势压力十分不利于 E . col i 存活, 与
Meikle等的研究结果一致. 3个实验结果
图 4 不同基模势下未灭菌土壤中 R . f r ed ii lux3活细
胞浓度和 PLf 值变化
( a) - 30 kPa, ( b) - 750 kPa, ( c) - 1500 kPa.实线表示
未添加营养物质( - N) ,虚线表示添加营养物质( + N) .
Fig. 4 Changes in viable cell concentrat ion and PL f in non
- sterile soil inoculated with R . f redii lux3 at diff erent
mat ric potential. SEs for viable cell concent ration and PLf
w ere < 25% of the mean.
之间的差异, 是由于所用土壤性质不同造
出的,在本实验和 Meikle 等的实验中所用
土壤的粘土含量较高, 在过去的许多研究
中证实高粘土含量有利于细菌存活.在对
不利基模势的抗性方面, 微生物之间存在
较大的差异[ 12] , E . coli 的自然栖息地不是
土壤, 对不利环境条件十分敏感, 而 R .
f redii和 P. f luorescence ( M eikle等实验用
细菌)是土壤微生物, 它们的自然栖息地是
土壤,对不利的土壤条件的抗性自然强得
多. Roberson 和 Firestone[ 7]认为细胞外多
524 应 用 生 态 学 报 8 卷
糖成分和产量同样是决定细菌是否适应干
燥条件的一个重要因素. R . f redii 可以产
生大量的胞外多糖, 这也是其在较低基模
势(十分干燥)的土壤中仍能较好地生存的
一个重要原因.
3. 4 不同基模势的土壤中细菌种群活力
的变化
脱氢酶活性、微生物呼吸是比较传统
的测定微生物活性的方法, 生物发光是针
对发光细菌而建立的测定微生物活性的方
法,评价接种细菌种群代谢活力,是微生物
生态学研究的主要内容. 在灭菌土壤实验
中,分别用 3 种方法测定发光标记菌的活
性,在未灭菌土壤实验中,生物发光值反映
标记菌种群活力,而脱氢酶活性和微生物
呼吸反映总体微生物种群活力.
由图 5 可见, 在基模势为- 30 kPa
时,发光值随时间延长而降低,在第 60 天
时发光值比初始接种时低 2 个数量级, 接
种后初期,呼吸作用和脱氢酶活性立即增
大,随后下降,第 21天时降低到常数水平.
当基模势为- 750 kPa时,接种后 3 h检测
结果表明, 3 种检测方法得到的值与-
30kPa 时同一时间检测结果之间没有显著
差异,呼吸作用和脱氢酶活性未表现初始
增加,在第 21天时, 降至常数水平.发光值
下降迅速, 但是在第 60 天时仍能检测到
(图 5b) . 当基模势为- 1500 kPa 时, 3 种
检测方法得到的初始值较低, 在第 40天时
检测不到发光(图 5c) .
在基模势为- 30 kPa时,发光值随时
间延长而迅速下降, 而在同一基模势下灭
菌土壤中,第 60天时仍可检测到细菌发光
(图 6a) , 在更低的基模势下, 细菌发光值
表现了相似的下降趋势, 与细菌存活趋势
一致.在 3种基模势下,脱氢酶活性和微生
物呼吸初始增加,随后降低到初始值,微生
物呼吸初始增加值低于脱氢酶活性变化
图 5 不同基模势下灭菌土壤中 R . f redi i lux3发光值、
脱氢酶活性和呼吸作用的变化
( a) - 30 kPa, ( b) - 750 kPa, ( c) - 1500 kPa.
Fig. 5 Changes in luminescence, dehydrogenase act ivity and
respirat ion rate sterile soil inoculated with R . f redi i lux3 at
diff erent matric potent ial. SEs for viable cell concentration
and PLf were < 25% of the mean.
(图 6b、c) .
由图 5和图 6可以看出, 基模势对微
生物的活性有十分显著的影响,这一结果
和Wilson 和 Griff in [ 12]研究结果一致, 他
们发现在土壤中细菌的生长和呼吸随基模
势的增加而降低, 表明基模势是细菌接种
物代谢活性的主要影响因子.
从图 5和图 3以及图 6和图 4的比较
可以得出,发光值的变化趋势与细菌存活
趋势一致, 而脱氢酶活性变化和微生物呼
5255 期 崔明学等:基模势对 luxAB标记的快生型大豆根瘤菌在土壤中存活的影响
图 6 不同基模势下未灭菌土壤中 R . f redi i lux 3发光
值、脱氢酶活性和呼吸作用的变化. ( a) - 30 kPa, ( b) -
750 kPa, ( c) - 1500 kPa.
Fig. 6 Changes in luminescence, dehydrogenase act ivity and
respiration rate non- sterile soil inoculated with R . f red ii
lux3 at diff erent matric potent ial. SEs for viable cell con
centration and PLf w ere < 25% of the m ean.
吸的变化则没有明显的规律可循. 脱氢酶
活性独立于培养时间, 脱氢酶活性并未随
时间而呈现明显的上升和下降 ( P =
0. 05) .潜在脱氢酶活性不能预测活细胞浓
度和代谢活性,潜在脱氢酶活性随饥饿时
间延长有时较高,可能和胞外酶活性有关,
这些胞外酶大多来自于死亡或裂解细胞.
参考文献
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