全 文 ：第 21卷第 3期
1 8 8 9年 9月
实 验 生 物 学 报 V o l. 21, N o 。 3
A e t a B io l o g i a e E x P e r im e n t a l is S in i e a S e P t em b e r 1 9 8 8
石防风细胞悬浮培养中的体细胞胚发生
夏光敏 陈惠 民
(山东大学生物系 )
植物体细胞胚发生的研究工作 目前已日益
广泛和深入 , 然而还有不少科属植物以及有经
济价值的植物尚未获得体细胞胚 , 很多理论问
题也还待进一步探讨 [” “ 】。
石防风 ( P e ueC d a n u o t e er h玄n t耘a ce “ m ( F i s c h )
e x T ur cz
.
)是一种伞形科中草药 , 其体细胞胚
发生的研究 , 目前在国内外尚未见报道 。
本文工作着重研究了石防风在细胞悬浮培
养中体细胞胚的发生过程及其细胞和组织学观
察 。 细胞培养中体细胞胚发生的研究至今虽已
有很多 , 但在细胞及组织学上的研究却一直很
少 , 我们希望在石防风上的工作能为这方面增
添一些资料 。
材 料 和 方 法
石防风茎 节 在 含 l m g l/ 2 , 4一D 的 M S 培养基上
诱导产生愈伤组织 , 转移至无激素培养基后 获得体细
胞胚并发育成苗 。
以试管苗的初生根在合 0 . 5 m g l/ 2 , 4一D 的 M S
培养基上诱导得胚性愈伤组织 , 生长 40 天后用同样成
份的液体 培 养基振 荡分散 , 经 10 目不锈钢 丝 网过
筛 , 滤过物以 4 x 1 s0 的细胞密度在往复 摇床 l o o r/ m
下振荡培养 。
培养温度 25 士 2℃ , 光照约 12 小时 /天 , 培养 于
散射光下 。
半薄切片用 2 . 5一 4%戊二醛和 1% 四氧化饿双固
定 , 甲苯胺蓝染色 。
细胞计数用 0 . 1%果胶酶游离细胞 , 血球 计数器
上计数
结 果 和 讨 论
一 、 在含 2 , 4一D 的培养液中体细胞胚的诱
导及细胞学观察
石防风的胚性愈伤组织十分疏松 , 易于分
散 。 起始培养物含单细胞 98 % , 其 中 高度液
泡化 细 胞 占 84 % , 含淀粉粒较多的长形 、 球
形和椭圆形小细胞 占 14 % , 此外还有少数 2一
10 多个细胞的小细胞团和由 一 个 大而长的细
胞经内部分裂而成 为 多个 细胞组成的丝状体
( r i l a m e n t o u s s t r u e t u r e ) (图版 工 , 图 l ) 。
在附加 0 . 5 m g / 1 2 , 4一D 的 M S 培 养 液中
培养时 , 培养开始后 , 培养物内各类细胞的比
例逐步发生变化 , 并且 出现新 的 类型 , 见图
1
。 含淀粉粒较多的小细 胞 分 裂 形成细胞团
(图版 I , 图 2 , 3 ) 。 与此同时 , 液泡化的大
细胞很快减少 , 很多变成富含淀粉粒 ; 其中一
部分长细胞作内部分裂转变成丝状体 , 后者数
量逐渐增多 。 到第 7 天 , 丝状体达到最高峰 ,
第 10 天含淀粉粒丰富的细胞上升到 约 83 % ,
本文 2 9 5 7 年 s 月 2 5 日收到 。 1 9 5 5 年 2月 5 日接
夏光敏 陈惠民 21卷
休分裂后 与带有胚柄 l狗早期原胚极为相 似 (图
版 工 , 图 7 ) , 但是从未见由它 们 直接发育为
胚状体 , 它们还是首先发育成细胞团 。 oH km a n
及 F o w k e t s ] 在裸子植物白云杉 ( p ice a g艺a u e a )
的细胞悬浮培养中见到的却相反 , 长细胞首先
作不等分裂 , 一端分裂出的小细胞进一步发育
成胚 , 而另一端大细胞发育成胚柄 。 显然 , 体
细胞胚发育的方式与植物类型有密切关系 。
由于单细胞及丝状体逐渐转变为细胞团 ,
使细胞团的数量不断增加 , 至 15 天 左 右达到
最高峰约 15 % , 以后又逐渐减少 , 因为细胞团
又开始向后一阶段发育 。
细胞团中细胞分裂生长至一定程度使之成
为愈伤组织 , 其内部或表面的某些细胞又进一
步分裂成体积更小 , 原生质浓厚 , 分裂能力强
的胚性细胞 。 由于这些细胞小而密集 、 胞质致
密 , 以至在光学显微镜下呈现为黑色 团 块 ( 图
版 I , 图 1 1 ) , 过 去 H a l p e r i n [心 ] 和 M e w i l l i a m
等 [ ” J曾分别把这样的愈伤组 织 称 为 “ 前胚体 ”
( P r o e m b r y o n i e m a s s )和 “ 胚性细胞团” ( E m b r y -
o g e n i c c l u m p )
。 在本实 验 条 件下 , 石防风的
“ 胚性细 胞 团 ” 第 7 天 开 始 出 现 , 20 天后达
1 0%左右 ; 此时含淀粉粒的细胞减少 , 液泡化
细胞重新增多 , 可能是由于营养条件变劣 , 有
的细胞停止分裂 , 体积扩大形成液泡化的大细
胞并趋向衰老 , 由此引起后者的比例升高 。
以 上是在 0 . 5 m叮 1 2 , 4一D 中 , 细胞 群 体
在一个起始周期 ( 2 天 )内的变化 。 若激素条件
不 同 , 则 结 果 亦 异 。 如 在 Z m g / 1 2 , 4一D 中
9 0% 以上细胞一 直 停 留 在 单 细 胞 阶段 , 在
o
.
s m g / 1 2
, 4一D 加 o . z m g / l 玉米 素 中 , 胚性
愈伤组织的比例大大增加 。
血.
|
内Un仙
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“ùnù八妞,`UOJ.ù甲八0,`弓曰l八.名口余娜叭健丰言印耸称婆联
圈 1 起始培养物中各类型细 胞在一个生长
期中的变化
. 一 . 一 . 一 . 含淀粉粒较多的长形 、 球形、 椭
圆形细胞
O 一 O 一O 一 O 液饱化大细胞
△一△一△一△丝状体
口一口一口一口细胞团
▲一▲一▲一▲胚性微愈伤组织
而液泡化的大细胞下降到 5%左右 。
丝状体通常由 4 、 5 个至 10 个左 右 的细
胞所组成 (图版 I , 图 4 ) , 个别 可 多至 15 一
3 0 个左右 , 其 中 各 细胞的体积大致相等 。 但
偶也有丝状体内部作不等分裂而形成大小不等
的细胞 ( 图版 工 , 图 10 右 ) 。 7 天以后 丝 状体
又逐渐减少 , 因为丝状体进一步分裂成为细胞
团 。 其演变过程根据在培养液中观察到的各种
细胞类型 , 可以认为是 : 内部细胞大小相等的
丝状体从一端开始分裂 , 有时也从中部或两端
开始 ( 图版 I , 图 5一 9 ) 。 而内部不等分裂的丝
状体则在体积小的一端进行分裂 , 但这种丝状
体仅 占少数 , 此外还有很少数横轴较宽的大细
胞也在内部进行细胞壁无定向的分裂 ( 图版 I ,
图 1 0 左 ) 。
值得指出的是在本实验中有很少数的丝状
3期 石防风细胞悬浮培养中的体细胞胚发生
如果在此周期之后或者在不同时期继代 ,
则因继代时细胞的类型和起始培养时不同 , 同
时细胞生理状态亦异 , 故细胞群体各成分比例
在下一个周期中也 不 同 。 例如 , 在 10 一 15 天
时即继代培养可引起下代细 胞 团 /胚性愈伤组
织的比例增加 ; 含淀粉粒 丰 富的细胞 /液泡化
大细胞比值上升 。 在 2 天以后 继 代 , 则细胞
团 /胚性愈伤组织比值减小 ; 含淀粉粒 丰 富的
细胞 /液泡化的大细胞比值下降 。
二 、 从细胞团至原胚的细胞及组织学观察
st ewa dr 最先从胡萝 卜细胞 悬 浮培养得到
体细胞胚 , 他认为它们 是 从 细 胞团直接形成
的 【” J。 但 H a l p e r i n 等后来的工作证 l月胚是从细
胞团表面发生的胚 性 细 胞 发 展 而 成 的 [ 7」。
M e w i l l i a m 和 S t r e e t 等在细胞及组 织 学 上作了
更全面深入的工作同样证明了这一点【” 1。 从石
防风的悬浮培养物的半薄切片表明 , 随着细胞
团的长大成为愈伤组织时 , 其中细胞逐渐发生
明显的分化 , 一类是胞质极为丰 富 的 胚 性细
胞 ; 另一类是液泡化细胞 , 胚性细胞不仅常常
发生在愈伤组织的表面 (图版 工 , 图 12 , 13 ) ,
而且也有一些是从内部或中央发生的 (图版 工 ,
图 14 ) 。 而在胡萝 卜研究中这 种 情 况 并 不多
见 , 这可能是植物种类不同的缘故 。
当培养物转移到无激素培养液中时 , 愈伤
组织上的胚性细胞进一步发展 。 在表面发生的
胚性细胞衍变成胚 , 从中央发生的胚性细胞有
的一 直扩展到整个愈伤组织的边缘 (图版 工 ,图
1 5 )
, 愈伤组织最外层的细胞最终脱落 , 这样形
成的体细胞胚不复带有原来细胞团上细胞的残
余 。 还有一些内部发生的胚性细胞团朝一个方
向分裂 , 结果后来突出于愈伤组织 之 外 (图版
I , 图 1 6 ) ; 那些不参与体细 胞胚构成的细胞
则作为类似胚柄的附着 物 ( s u s p e n s o r一 l i k e a p -
eP dn ag
e )连在胚上 。 有的愈伤 组织多处发生胚
性细胞 团 , 它们并 不 汇合在一起 (图版 I , 图
17
,
18 )
, 于是以后就形成多个 体 细胞胚 。 有
的体细胞胚表面还可以产生次级胚 ( 图版 I ,图
1 9 )
。 愈伤组织上的原 胚 在无激素培养液中经
20 天左右即发育为肉眼可见的体细胞胚 。 这些
胚在发育至球形胚期以后的不同时期脱离愈伤
组织 , 游离于培养液中 。 40 天 后 可 见培养液
中有大量发育阶段不同的体细胞胚 ( 图版 I , 图
2 0 )和少量幼苗 。 此时将培养物转移至无激素固
体培养基上成薄层 , 3一 5 天后形成大量幼苗 。
综上所述 , 可以把石防风从单细胞至体细
胞胚的整个发展过程以 图 2 表示于下 。
值得一提 , 在悬浮培养中丝状体占有一定
的数量 , 尤其是在培养初期 。 但固休培养的胚
性愈伤组织 用涂片观察丝状体数量始终很少 。
这是否与培养基的物理及营养供应状态或细胞
间接触程度等方面有关 , 尚待进一步探讨 。
0 0。一
广暮二二
甲 2 石防风从单细胞到休细胞胚的发育过程
石防风体细胞胚发生能力能长期保持 。 我
们继代培养 了两年多 , 至今仍能分化出体细胞
胚 , 因此它可 以作为研究体细胞胚发生以及在
细胞工程中加 以利用的一个良好实验系统 。
26 8夏光敏 陈惠民 21卷
摘 要
石防风试管苗的根经 2, 4一D 诱导 可 形 成
具有发生体细胞胚潜能的愈伤组织 , 用愈伤组
织制备悬浮细胞 。 细胞及组织学的观察表明 ,
体细胞胚发生经历 了 单 细 胞 、 丝状体 、 细胞
团 、 愈伤组织及胚性细胞团的出现及类胚体的
各个发育阶段 。 丝状体可以经过不 同的分裂途
径发育为细胞 团。 愈伤组织表面或者内部的某
些细胞演变为胚性细胞 , 它们不断分裂形成了
体细胞胚 , 一个愈伤组织可形成一个或几个体
细胞胚 。
参 考 文 献
〔 1 」姚敦义 、 张慧娟 , 19 86 , 植物体细胞胚研究
进展 , 山东师范大学自然科学学报 1 ( 2 :)
5 4一 6 5 .
〔 2 〕 B h o jw a n i , 5 . 5 . a n d M . K . R a z d a n , 1 9 5 3 ,
S o m a t i e e m b yt o g e n e s i s
.
I n
“
P la n t T i s su
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C ul t ur e : T h e o r y a n d rP a e t i e e
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s e ie n e e Pu b l i s h er s
,
A m s t e v d a m
,
P 9 1一
1 1 2
.
〔 3 〕 H a km a n , I 、 a n d L . C . F o w k e , 1 9 8 7 。 A n
e m byr o g e n i e e e l l s u s P e n s i o n e u l t ur e o f
P名eeo g功u e a (W h i t e s Pur e e ) . P王a儿 t C e正落
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[ 吐〕 H a l P e r i n , W . , 1 9 6 6 , A lt e rn a t i v e m o rP h o -
g e n e t i e ve e n t i n e e l l s u s P e n s i o n
.
A邢 . J .
刀O t . , 53 : 4 4 3一 4 5 3 .
〔 5 〕 M ew i l li a m , A . A . , 5 . M . S m i t h a n d H .
E
,
S t r e e t
,
1 9 7 4
。
T h e o r i g i n a n d d e v e】OP .
m e n t o f e m b r y o id s in s u s P e n s io n e u l tuer
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o f e a r o t (D a u e u s e a r o t a )
.
A 儿” . 刀。 t 二
38 : 2 4 3一2 5 0 .
[ 6 〕 S t ew a dr , F . C . , 1 9 5 8 . G or w t h a n d d e v e ·
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.
I n t e rP r e t a
-
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-
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.
A m er
.
J
.
B o t 二 4 5 : 7 0 9一 7 1 3 ,
〔 7 〕 H a 1P e r in , W . a n d W . A . J e n s e n , 1 9 6 7 。
U l t ar s tcur
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l e h a n g e s dur i n g g or w t h a n d
e m byt o g e n es i
s i n e a r o t e e l l e u l t u r e s
.
J
.
U乙忿r a s汀 u e七盯己 R e s e ar e 九, 18 : 4 2 8一 4 4 3 .
3期 石防风细胞悬浮培养中的体细胞胚发生 6 2自
E M B RY OGE N E S IS IN
E PC UE D A N UM
C E L L SE U S PN I T ON F O
E TRE B N I TA C HE UM
Xi a Gu a n g 一m i n a n d C h e n
(B 玄ol 昭y D 已 Pa r t爪e 九t , S瓦a凡 d o n g
H u i一m i n
U 托 i下er s i忿y )
A B S T R A C T
E m b r y o g e n i e e a l li e o u l d b e o b t a i n ed f r o m
t h e s e e d l i n g r o o t o f P e郎 e d a 性“ 琳 才e r e b忿n 一
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.
5 m g / 1 2
, 4一 D .
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m e n t o f s u s Pe n s i o n e u l t u r e
.
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s u s P e n s i o n e u l t u r e w a s i n d u e e d i n t h e P r e s e n e e
o f Z , 4一 D , a n d t h e e m b r y o i d s f o r m ed d e v e l o p e d
in t o P l a n t l e t s w h e n t h e y w e r e t r a n s f e r r e d t o
2 , 4一 D 一 f r e e m ed i u m
.
C y t o 一 h i s t o log i e a l o b s e r v a t i o n s r e v e a le d
t h a t e m b r y o g e n e s i s s t a r t e d w i t h s i n g l e e e l l s
,
f o l l o w ed b y t h e f o r m a t io n o f f i l a m e n t o u s s t r
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u e t u r e s
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S e v e r a l
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a l s o i n t h e i n t e r n a l o f e m b r y o g e n i e e a l l i
.
K e y w o r d s : P e “ e e d o n u 琳 t e r e b i此 t九a e e “ 琳 ( F i s e h ) F i , e h . e x T u r e z . C e l l
s u s P e n s i o n e u l t u r e
.
S o m a t i e e m b r y o g e n e s l吕
.
27 0夏光敏 陈惠民 21卷
图 版 说 明
图 版 工
图 1液体培养起始时的悬浮细胞 。 汉 50
图 2刚分裂形成的小细胞团 。 (半薄切片 ) x02。
图 3正在成长中的细胞团 。 (半薄切片 )火 7 0
图 4液泡化的长细胞经内部分裂而形成的丝状体。 x020
图 5一 9丝状体进一步分裂形成细胞团 。 放大倍数依次为 x23。 , 沐 2 5。 , x 2 0
图 10 左 : 横轴较宽的大细胞在内部作胞壁无定向的分裂 。 x 2 50
右 : 不等分裂的丝状体。 x 25 0
图 1 1 愈伤组织 。 只 一0 0
图 12 胚性细胞从愈伤组织表面发生 。 x 8 0
图 13 愈伤组织表面发生的体细胞胚 。 x 130
图 14 胚性细胞从愈伤组织内部发生 。 x 140
图 15 胚性细胞充满整个愈伤组织 , 边缘细胞止开始脱离 (箭头 ) 义 2 5 0
图 1 6 愈伤组织内部发生的胚性细胞团 , 长大并突出于愈伤组织之外 。 、 70
图 17 一 18 在一个愈伤组织上形成或正在形成几个原胚 。 又 20
图 19 体细胞胚上长出次级胚 。 x 30
图 2 0 不同发育阶段的体细胞胚 。 x l6
X 1 5 0
, x 7 5
E X P L A N A T IO N O F F I G U R E S
P L A T E I
F ig
。
1
.
T h e e e ll s i n
s u s P e n s i o n e u l tu r e a t t h e b e g i n n i n g
。 x 5 0
F i g
.
2
。
S m a l l e e l l a g r e g t e s f o r m e d
。 x 2 0 0
F i g
.
3
.
A g r o w i
n g e e l l a g g r e g a t e
。 x 7 0
F jg
. 咬 . A f j l a m e n t o u s s t r u e t u r e d e r i v e d f r o m a l on g v a euo la t e d e e l l a f t e r i n n e r f r a g m e n t a t i o n
.
X 2 0 0
F i g
.
5一 9 . D i f f e r e n t P a t t e r n o f d i v is io n o f t h e f i l a m e n t o u s s t r uc t u r e l e a d in g t o t h e f o r m a t i o n o f
e e l l a g g r e g a t e
s
.
x 2 3 0 , K 2 5 0 ; x 2 0 0 , x 1 5 0 ; x 7 5
F i g
.
1 0
.
L e f t : I n n e r d i
v i s i o n o f r a n d o m d i r e e ti o n i n a l a r g e b r o a d c e l l
。 x 2 5 0
R i g h t : U n e q au l d iv i s io n i n a f i la m e n t o u s s t r u e t u r e
. x 2 5 0
F i g
.
1 1
。
Em b r y o g e n i e e a l l i
。 x 1 0 0
F i g
.
12
。
Em b r y o g e n i e e e l l s d i f f e r e n t i a t e d f r o m e a l lu s s u r f a e e
. x 8 0 0
F立9 . 1 3 。 A s o m a t i e e m b r y o f or m e d f or m ca ll u s s u r af e e . x 13 0
F ig
,
1 4
.
E m b r y og
e n i e e e ll s d i f f e r e n t ia t e d i n t h e d e e P o f e a ll u s
.
x 1 4 0
F i g
.
1 5
.
E m b r y o g e n i c e e l l s f i ll e d t h e w h o l e i n t e r n a l s P a e e o f t h e e a ll u s e x e e P t t h e e dg e o f i t
。
只 2 5 0
F i g
。
1 6
.
A n e m b r yo g e n ie e e ] 1 m a s s o r全g i n a t e d f r o m t h e in t e r n a l o f t h e em b r y og en i e e a ll u s a n d
g r e w o 匕t o f i t . 火 7 0
F i g
。
1 7一 18 。 S e v e r a l P r im a r y e m b r y o s f o r m e d o n a n e m b r y o g e n i e e a l lu s 。 x 2 0 0
F i g
.
1 9
。
A s o m a t i e e m b r y o b e a r i n g a s e e o n d a r y e m b r y o
。 x 3 0
F i g
.
2 0
。
S o m a t ie e m b r y o s a t d i f f e r e n t d e v e l o Pm e n t a l s t a g e s i n t h e s u s P e n s i o n e u l t u r e
. 火 ] 6
3 期 石防风细胞悬浮培养中的体细胞胚发生 2 71
图 版 工