全 文 ：正交设计法优选紫花前胡组织培养基
湖南中医学院 (长沙 4 1仪兀阵) 彭 菲 凌 红
湖南德康制药有限公司 (长沙 4 10 1) 3胡永芳
摘要 目的 :为紫花前胡愈伤组织培养寻求最佳培养基 。 方法 :激素配方采用正交设计方案 ,并对愈伤组织进
行初步的理化定性 。 结果 :紫花前胡愈伤组织诱导的最佳培养基为 MS 附加 2 .丰D 1 11娜 L ;经初步检测其愈伤组织
中含有香豆素类成分 。 结论 :本试验为紫花前胡细胞培养生产有效成分提供了可能性 。
关钮词 紫花前胡 愈伤组织 正交设计 香豆素
紫花前胡 凡陇以阮肋叭 d即明~ M ax im
. 为伞形
科植物 , 根能降气化痰 、宣散风热 〔’ 〕。 其主要化学成
分为香豆素类 ( 6 , 7一毗喃香豆素 、 6 , 7 峡喃香豆素 、简
单香豆素 ) 、 三菇皂贰及挥发油图 。 目前对紫花前胡
愈伤组织培养的研究较少 。 本实验在 M S 培养基上
附加不同浓度的 2 . 今 D 、 IA A 、 吞BA ,用正交法优选最
佳激素配比 , 以提高紫花前胡愈伤组织产量 。
1 材料和方法
从湖南中医学院药圃选取紫花前胡新发嫩枝上
的叶柄 , 用水冲洗干净 ,再用 0 . 1%升汞消毒 12 m i n ,
无菌水反复冲洗 4 一 5 次 。 总叶柄切割长度约 0 . 6 -
o
.
s cm
,接种于含不同激素的 M S 培养基上 , 置于光
照培养箱中 (温度 24 土 1℃ ,光照 9 丫 d) 诱导愈伤组
织。 激素配比采用正交设计方案 , 因子水平安排如
表 l 。
衰 , 场《矛》因子水平表
水平 A ( 2 今 D) B (认 A ) C (吞 BA )
1 0 0 0
.
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2 1 1 1
3 2 2 2
2 结果与分析
2
.
1 激素对愈伤组织诱导率的影响 叶柄在附加
不同激素的 毗 培养基上 , 培养 5 天后均开始出现
膨大现象 , 12 天后开始出现愈伤组织 , 1、 2 、 3 号配方
的愈伤组织长于叶柄切段两端 , 白色致密 ; 4 、 5 、 6 号
配方的愈伤组织长满叶柄周身 ,黄绿色 , 其中 6 号配
方愈伤化程度明显要强一些 ; 7 、 8 、 9 号 配方的愈伤
组织似从内部开始生长 , 而外表愈伤组织量相对较
少 。 培养 28 天后 , 统计愈伤组织诱导率 , 见表 o2
从表 2 来看 , 1、 2 、 3 号配方的诱导率均为 10 % , 但
每个外植体产愈量少 , 因此 ,选择培养愈伤组织的激
素配方不能仅依据愈伤组织诱导率来确定 。 为此 ,
对愈伤组织生长量作了进一步统计分析 。
.2 2 激素时愈伤组织生长量 的影响 外植体的愈
伤化程度一般通过愈伤组织生长量来说明 , 愈伤组
中药材第 解卷第 7 期 Zd 〕1 年 7 月
表 2 激素对愈伤组织诱导率的影晌
编号 接种数
(块 ) 成愈数 愈伤
组织
(块 ) 诱导率 (% )
织生长量的计算方法有多种 , 本文采用愈伤指数表
示法闭 , 以此说明外植体的愈伤化程度 。
愈伤指数 = 各级块数总和 x 最高级数
愈伤化级数划分为 : O 级 , 无愈伤组织 ;l 级 , A
( 14/ ;2 级 , 14/ < A感 12/ ; 3 级 , 12/ < A ( 34/ ;4 级 ,
34/ < A宾 1 。 其中 A 二 愈伤面积 /外植体面积 。
依上计算 、 统计叶柄在不同激素的 MS 培养基
上的愈伤指数 , 结 果见表 3 、 4 。 分析表 明 , 因子 A
( 2
.
-4 D )作用极显著 , 因子 B( 1AA )作用不显著 , 因子
(C 吞BA )对实验结果无影响 。 2 . 牛 D 浓度最佳水平
可由表 3 得知是 l m酬 L 。 因此 , 诱导紫花前胡叶柄
产生愈伤组织的最佳培养基为 MS + 2
.
4
一
D 1 11 1留 oL
2
.
3 愈伤组织中香豆素类成分的定性浏定 将继
代培养第 3 代的愈伤组织 , 置于 O4 ℃烘箱中烘干 。
取愈伤组织干燥粉末 0 . 5 9 , 加 乙醚 5 耐 , 浸泡 Z h
后 ,将澄清乙醚浸 出液 , 滴于小滤纸片上 , 置紫外灯
下观察 ,现淡天蓝色荧光 , 在其上滴加 15 % N成爪 数
滴 , 2 而 n 后荧光消失 。 将一张滤纸避光保存 , 另一
张暴露在光线下 , 约 3 h 后 , 在紫外灯下观察 , 经光
线照射者 ,天兰色荧光加强 ,避光者不现荧光 。
另取愈伤组织干燥粉末 0 . 5 9 , 加人适量乙醚 ,
冷浸 l h ,滤过 ,滤液浓缩至 l ml ,加 7% 盐酸经胺甲
醇 液 2 一 3滴 , 2 0 % 氢氧化钾乙醇液 3滴 , 在水浴 上
.
47 1
DOI : 10. 13863 /j . i ssn1001 -4454. 2001. 07. 002
表 3激素对愈伤指数的影响及正交统计分析
编号D C 叶柄愈伤指数
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以上两试验均为阳性反应 ,说明紫花前胡叶柄
产生的愈伤组织含有香豆素类成分 。
3 讨论
在组织培养中 ,激素的种类和浓度及其配比 ,对
实验结果有相当大的影响 。 正交设计的应用 , 能大
大减少实验次数 ,同时准确率也较高 。
对于愈伤组织生长量的计量方法 ,有人采用愈
伤组织鲜重的方法 ,并不一定可取 , 因为它没有考虑
愈伤组织的质地问题 (尤其是含水量的多少 ) , 而质
地如何 ,对于愈伤组织能否进一步继代培养却至关
重要 。
通过愈伤组织的理化鉴别 , 发现含有香豆素类
成分 ,说明紫花前胡叶柄离体培养产生的愈伤组织 ,
具有产生与原植物体同类化学成分的能力 , 为细胞
培养产生有效成分提供了可能性 。
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表 4 方差分析
方差来源 离差平方和 自由度 F 值
参 考 文 献
A
B
误差 e
0
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0
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加热 , 冷却后 ,加稀 CH L 调 p H 值至 3 一 4 ,再加三氯
化铁乙醇液 1 一 2 滴 ,醚层交界面显红色 。
中华人民共和 国卫生部药典委员会 . 中华人民共和 国
药典一部 . 广州 :广东科技出版社 , 1男:5 23 5郑虎占 ,等 . 中药现代研究与应用 . 第四卷 . 北京 :学苑
出版社 , l卯 7 :孙印
李湘军 ,等 . 膜荚黄蔑愈伤组织诱导及芽的分化 . 中草
药 , l卯 2 , 2 3 ( 1 2 ) : 吞协
( 2X( ) 1一 0 1 一 15 收稿 )
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中药材第 抖 卷第 7 期 2〕 ) 1 年 7 月