全 文 ：NJA 中华男科学杂志National Journal of AndrologyZhonghua Nan Ke Xue Za Zhi2014，20(5) :400 － 404
http:/ /www． androl． cn
·论 著·
Basic Ｒesearch
(基础研究)
豹皮樟总黄酮通过增强小鼠睾丸 Leydig细胞
缝隙连接功能减轻奥沙利铂的细胞毒作用
余彬彬，童旭辉，董淑英，谷昱琛，焦 浩，纪 洁，屈 彪
(蚌埠医学院药学系药理学教研室 /安徽省生化药物工程技术研究中心，安徽 蚌埠 233030)
【摘要】 目的:探讨豹皮樟总黄酮(TFLC)对体外培养的小鼠睾丸 Leydig细胞系(TM3)缝隙连接(GJ)功能的
作用，以及 TFLC是否减轻化疗药奥沙利铂(OHP )的细胞毒作用。 方法:荧光示踪法测定体外培养的 TM3 细胞
之间荧光传递，反映 GJ的功能;Western印迹法检测 TFLC对连接蛋白 43(Cx43)表达的影响;细胞免疫荧光法观察
TFLC对 TM3 细胞胞膜 Cx43 蛋白表达的影响;MTT法检测 OHP的细胞毒作用，以及 TFLC对 OHP细胞毒的影响。
结果:在 TM3 细胞中 GJ的功能随着 TFLC 浓度的增加而增强;Western 印迹和免疫荧光实验结果显示 TFLC 可显
著增强 TM3 细胞中 Cx43 蛋白和膜 Cx43 蛋白的表达;MTT 结果表明，高密度接种细胞(生长融合，有 GJ 形成) ，
20 μg /ml TFLC增强细胞 GJ功能，且减轻 OHP的细胞毒作用［细胞存活率(89． 5 ± 1． 8)%高于单用 ONP 组(80． 0
± 1． 5)%，(P ＜ 0． 05) ］;低密度接种细胞 (生长未融合，无 GJ 形成) ，TFLC 对 OHP 的细胞毒作用没有影响(P ＞
0． 05)。 结论:TFLC增强睾丸正常细胞 TM3 中 Cx43 的表达，并增强细胞间的 GJ 功能;TFLC 减轻 OHP 在 TM3
细胞的毒性作用，并可能与增强 GJ功能有关。
【关键词】TM3 细胞;豹皮樟总黄酮;Cx43;缝隙连接;奥沙利铂
中图分类号:Ｒ737． 21;Ｒ931． 71 文献标志码:A doi:10． 13263 / j． cnki． nja． 2014． 05． 003 *
Total flavonoids of Litsea Coreana decreases the cytotoxicity of oxaliplatin in
TM3 Leydig cells via enhancing the function of gap junction
YU Bin-bin，TONG Xu-hui，DONG Shu-ying，GU Yu-chen，JIAO Hao，JI Jie，QU Biao
Faculty of Pharmacology，Department of Pharmacy，Bengbu Medical College / Anhui Ｒesearch Center for Engineer-
ing Technology of Biochemical Pharmaceuticals，Bengbu，Anhui 233030，China
【Abstract】 Objective:To investigate the effects of total flavonoids of Litsea Coreana (TFLC)on the gap junction (GJ)inter-
cellular communication in TM3 testicular Leydig cells and whether TFLC can reduce the cytotoxicity of oxaliplatin (OHP)in vitro．
Methods:We detected the effect of TFLC on the dye spread of the in vitro cultured TM3 cells by parachute assay，observed changes in
the expression of connexin 43 (Cx43)total protein in the TFLC-treated TM3 cells by Western blot，and determined the effects of TFLC
on the expression of Cx43 on the membrane of the TM3 cells by immunofluorescence assay and on the cytotoxicity of OHP by MTT as-
say． Ｒesults:TFLC obviously enhanced the GJ function with the increasing of the TFLC concentration in the TM3 cells． Western
blot and immunofluorescence assay confirmed that TFLC significantly enhanced the expression of Cx43 total protein and Cx43 expres-
sion on the membrane of the TM3 cells． MTT assay showed that at a high cell density (confluent with GJ formation) ，20 μg /ml
TFLC enhanced the GJ function of the TM3 cells and reduced the cytotoxicity of OHP (P ＜ 0． 05) ，while at a low density (preconflu-
ent with no GJ formation) ，TFLC exhibited no effect on the cytotoxicity of OHP (P ＞ 0． 05)． Conclusion:TFLC increases the Cx43
expression and GJ function in normal TM3 Leydig cells，and the enhancement of GJ function reduces the cytotoxicity of OHP．
·004·
* 基金项目:国家自然科学基金(81001457) ;安徽省教育厅高校省级科学研究项目(KJ2010B117)
作者简介:余彬彬(1989-) ，女，安徽安庆市人，硕士研究生，从事肿瘤药理学的研究。Email:youxiang6161616161@ 126． com
通讯作者:童旭辉，Email:bbmctxh@ 126． com
Natl J Androl，2014，20 (5) :400 －404
【Key words】normal TM3 Leydig cell;total flavonoids of Litsea Coreana;connexin 43;gap junction;oxaliplatin
Supported by grants from National Natural Science Foundation of China (81001457)and Scientific Ｒesearch Project of High Education Institutions of An-
hui Province (KJ2010B117)．
Corresppondence to:TONG Xu-hui，email:bbmctxh@ 126． com
Ｒeceived:October 1，2013;accepted:January 13，2014
奥沙利铂(oxaliplatin，OHP)是一种新型的铂类
抗肿瘤药，对实体瘤(如睾丸癌等)的疗效比较好，
但是它对肿瘤细胞的选择性依然很低，在杀伤睾丸
癌细胞的同时，对正常睾丸细胞也有很大的损害作
用。寻求保持 OHP的抗肿瘤作用的同时而减轻其对
正常细胞的损害，对临床 OHP应用具有重要的意义。
缝隙连接(gap junction，GJ)是细胞间一种蛋白
质通道，它由连接蛋白(connexin，Cx)组成。在睾
丸组织中表达的连接蛋白主要是 Cx43［1］。目前已
有文献证实，Cx43 的存在可以增强化疗药物诱导的
细胞凋亡作用;但在人正常组织中，Cx 具有抑制肿
瘤生长的作用［2］。对此国内外许多学者将寻找增
强 GJ功能的药物作为肿瘤治疗研究的新方向。如
文献报道黄酮类物质(如:黄芩素等)能够增强 GJ
的功能，并且这种增强作用能够提高化疗药物和放
疗对肿瘤细胞的毒性，而对相应正常细胞的毒性则
研究较少［3］。
豹皮樟总黄酮(total flavonoids of litsea coreana，
TFLC)是从老鹰茶中提取的有效成分，是通过乙醚
萃取后经大孔吸附树脂，再经醇洗脱、减压浓缩后，
经过真空干燥得到的总黄酮(含量 ＞ 75%) ，其黄酮
类化合物，经结构鉴定为儿茶素、槲皮素-3-O-B-D-
半乳糖苷、槲皮素 3-O-B-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-
B-D-半乳糖和山奈酚-3-O-B-D-葡萄糖苷［4］。目前
国内外文献对于 TFLC 的研究多数局限于抗炎、免
疫调节和糖尿病的治疗［5-6］，而关于 TFLC 与 GJ 功
能的研究暂未见报道。
本文研究 TFLC 对睾丸正常间质细胞 TM3 中
Cx43 表达和 GJ功能的影响，进而观察 TFLC是否通
过增强 GJ而减轻抗肿瘤药物 OHP的细胞毒性。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 细胞 小鼠睾丸 Leydig 细胞系(TM3)购于
美国 ATCC公司。
1． 1． 2 试剂 F12 /DMEM 培养液、胎牛血清、马血
清、荧光染料 Calcine-AM 为 Gibco 产品;OHP、四甲
基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白
酶、4，6-联眯-2-苯基吲哚(DAPI)、抗 Cx43 蛋白抗
体、β-肌动蛋白、FITC -羊抗小鼠 IgG 和羊抗小鼠
IgG均为 Sigma-Aldrich产品;BCA 蛋白浓度测定试
剂盒为 Bio-Ｒad 产品;ECL 发光试剂盒为 Millipore
产品;TFLC 为安徽医科大学药学院李俊教授馈赠，
用 DMSO 配置，终浓度中 DMSO 的含量均低于
0． 1%;其他常用试剂均为国产分析纯级。
1． 2 方法
1． 2． 1 细胞培养 TM3 细胞采用的 F12 /DMEM培
养液［含有 5%(V /V)马血清、2． 5%(V /V)胎牛血
清、100 U /ml 青霉素、100 mg /ml 链霉素］，置于
37 ℃、5% CO2以及饱和湿度的细胞培养箱中培养。
细胞常规培养于培养瓶中，0． 25%胰蛋白酶溶液消
化传代，1 周传代 2 ～ 3 次，传代比例为 1∶2。
1． 2． 2 细胞接种荧光示踪法［7］测定 TM3 细胞间
GJ功能 将 TM3 细胞按每孔 1 ml(1 × 105 /L )接
种于 12 孔板，培养 48 h，待细胞融合后，用不同浓度
(5、10、20 μg /ml)的 TFLC 处理 24 h 后，将 TM3 细
胞与荧光指示剂 Calcein-AM 共同孵育，使 Calcein-
AM 进入细胞，该细胞称为“供体细胞”。将“供体细
胞”接种到表达有相同 Cx，已生长融合的 TM3 细胞
(“接受细胞”)上，培养 4 h。待形成稳定的 GJ 后，
小分子的 Calcein (发绿色荧光)可以通过 GJ 进入
相邻的“接受细胞”，用荧光显微镜观察，记录 GJ 荧
光传递功能。一个“供体细胞”周围含有 Calcein 的
“接受细胞”数目作为 GJ功能的指标。
1． 2． 3 Western印迹法检测 TM3 细胞内的 Cx43 总
蛋白表达 实验重复 4 次。收集稳定表达 Cx43 的
TM3 细胞，加入细胞裂解液冰上裂解 30 min，收集
细胞蛋白样品，用 BCA 蛋白定量法测各组蛋白浓
度，用细胞裂解液将各组蛋白稀释至相同浓度，与
2 ×上样缓冲液按 1∶1 混合，100 ℃ 煮沸 5 min 使蛋
白变性。每组取蛋白50 μg，10% SDS-PAGE 电泳
(70 V，30 min;110 V，90 min) ;转膜(50 V，
150 min) ;脱脂牛奶室温封闭 2 h;一抗 1∶ 4 000 稀
释，4 ℃孵育过夜;TPBS 洗涤 3 次，每次 15 min;
FITC-羊抗小鼠 IgG 1∶5 000 稀释，室温孵育 2 h ;洗
涤 3 次 × 15 min;ECL 发光试剂盒暗室发光、显影、
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定影。Bio-Ｒad 凝胶成像系统采集图像。并用
Quantity One (Bio-Ｒad)软件对目的条带灰度扫描
进行定量分析。
1． 2． 4 细胞免疫荧光法检测 TM3 细胞胞膜 Cx43
蛋白表达 实验重复 3 次。将 TM3 细胞按每孔1 ml
(1 × 105 /L)接种于 12孔板，放置培养箱中培养 48 h，
待细胞融合后，用不同浓度的TFLC(5、10、20 μg /ml)处
理 24 h 后，吸去培养液，PBS 洗3 次，每次5 min;4%多
聚甲醛溶液室温固定 15 min，PBS 洗涤 2 次，每次
10 min;5% BSA封片 2 h;Cx43一抗 1∶1 000稀释，4 ℃
孵育过夜，PBS 洗 3 次，每次 15 min;FITC -羊抗小鼠
IgG 1∶500 稀释，湿盒 37 ℃孵育 2 h，PBS 洗涤 3 次 ×
10 min;并采用DAPI(5 μg /ml)染核，室温下反应5 min;
PBS 洗涤 3 次，每次 15 min;碳酸甘油缓冲液封片;倒置
荧光显微镜下观察 Cx43在细胞胞膜中的表达。
1． 2． 5 MTT法测定药物的细胞毒性 实验重复 3
次。将 TM3 细胞按每孔 200 μl(细胞高密度接种为
5 × 104 /ml，低密度接种为 3 × 102 /ml)接种于 96 孔
板，每组药物浓度设 5 个复孔。检测每组药物浓度
处理 TM3 细胞 24 h 后的细胞存活率。另设阴性溶
剂对照组(不加药物)。加药 24 h 后(药物作用终
点时间)终止培养，终止培养前 4 h，每孔加 MTT
15 μl(5 g /L)。4 h 后弃上清液，加入 DMSO 150
μl /孔，微量振荡器震摇 10 min，全自动定量绘图酶
标仪测定每孔的570 nm波长处吸光度 A值。
1． 3 统计学分析 实验结果使用 SPSS 13． 0 软件
进行分析，数据资料以 x ± s 表示，两组之间计量资
料比较进行 t 检验，统计图表采用 Sigma Plot 10． 0
绘制。P≤0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 TFLC增强 TM3 细胞 GJ功能 细胞接种荧光
示踪的结果显示用 5、10、20 μg /ml TFLC(预实验结
果表明 0 ～ 80 μg /ml TFLC处理 TM3 细胞 24 h，其
细胞存活率均在 90%以上)处理 TM3 细胞 24 h，可
以显著增强 GJ介导的细胞间荧光传递。与溶剂对
照组相比，TFLC处理后细胞的荧光传递功能分别增
加了(36． 0 ± 2． 9)% (P ＜ 0． 05)、(85． 0 ± 2． 1)%
(P ＜ 0． 05)和(180． 0 ± 1． 4)%(P ＜ 0． 01) (图 1)。
2． 2 TFLC增强 TM3 细胞胞膜 Cx43 蛋白的表达
细胞免疫荧光结果显示 5、10、20 μg /ml TFLC 分别
作用 TM3 细胞 24 h，可显著增强细胞胞膜 Cx43 蛋
白的表达(图 2)。
2． 3 TFLC 增强 TM3 细胞中 Cx43 总蛋白表达
Western印迹结果显示用 TFLC (5、10、20 μg /ml)处
理 TM3 细胞 24 h，可以显著增强 Cx43 总蛋白的表
达。与溶剂对照组相比，TFLC 预处理后细胞的
Cx43 总蛋白表达分别增加了(34． 0 ± 4． 3)%(P ＜
0． 05)、(99． 6 ± 10． 9)% (P ＜ 0． 01)和(129． 0 ±
13． 4)%(P ＜ 0． 01) (图 3)。
2． 4 TFLC减轻 OHP细胞毒性 根据 2． 1 ～ 2． 3 的
实验结果得知，TFLC在 20 μg /ml浓度时对 GJ功能
和 Cx43 表达的增强作用最明显。故挑选 20 μg /ml
的 TFLC 于 TM3 细胞生长融合(高密度接种 5 ×
104 /ml，有 GJ形成)和生长未融合(低密度接种 3 ×
102 /ml，无 GJ形成)的状态下预处理细胞 24 h 增强
GJ功能后，然后再加入 10 μmol /L OHP 作用 24 h，
采用 MTT法检测细胞的存活率。在高密度接种细
胞时(生长融合，有 GJ形成) ，OHP单用组的细胞存
活率为(80． 0 ± 1． 5)%，加入 TFLC 预处理细胞以
增强 GJ功能后，OHP作用 TM3 细胞24 h，细胞存活
率高于单用 OHP 组［(89． 5 ± 1． 8)%，P ＜ 0． 05］。
而在低密度接种的细胞(生长未融合，无 GJ 形成) ，
TFLC 和 OHP 联合用药组细胞存活率［(81． 0 ±
0． 6)%］与单用 OHP 组［(81． 6 ± 0． 3)%］无统计
学意义(P ＞ 0． 05)。见图 4。
图 1 TFLC对 TM3 细胞由 Cx43 构成 GJ功能的影响(荧光显微镜 × 200)。
TM3 细胞用 5、10、20 μg /ml TFLC处理 24 h
Figure 1． Effects of TFLC on the junction of gap function associated with Cx43 in the TM3 Leydig cells (fluorescence microscope ×200)
The TM3 Leydig cells were exposed to 5，10 and 20 μg /ml TFLC for 24 h．
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图 2 TFLC对 TM3 细胞胞膜上 Cx43 蛋白表达的影响(荧光显微镜 × 200)
不同浓度的 TFLC处理 TM3 细胞 24 h后观察 TM3 细胞膜上连接蛋白 43 形成的 Cx。绿色荧光显示的是 TM3 细胞上的连接蛋白 43 的 Cx，蓝色
显示的是相应细胞核的 DAPI单染
Figure 2． Effects of TFLC on the expression of connexin 4 on the membrane of the TM3 Leydig cells (fluorescence microscope × 200)
Cx43 gap junction plaques (green)were observed in the TM3 cells treated with different concentrations of TFLC for 24 h． The blue images show the cell
nuclei stained by DAPI．
图 3 TFLC对 TM3 细胞中 Cx43 总蛋白表达的影响
TM3 细胞用 5、10、20 μg /ml TFLC处理 24 h
Figure 3． Effect of TFLC on the expression of Cx43 in the TM3
Leydig cells
The TM3 cells were exposed to 5，10 and 20 μg /ml TFLC for 24 h．
图 4 TFLC对 OHP在 TM3 中细胞毒性的影响(n = 3)
在高低密度情况下，检测 20 μg /ml TFLC 预处理细胞 24 h，再联合使
用 10 μmol /L OHP 后 TM3 细胞存活率。与对照组比较，* :P ＜
0． 05;＊＊:P ＜ 0． 01;与单用 OHP组比较，#:P ＜ 0． 05
Figure 4． Effects of TFLC on the cytotoxicity of OHP in the TM3
Leydig cells (n = 3)
The TM3 cells at high and low densities were treated with 20 μg /ml TFLC
for 24 h followed by combination with 10 μmol /L OHP． * :P ＜ 0． 05，
＊＊:P ＜ 0． 01 versus the control;#:P ＜ 0． 05 versus single OHP．
3 讨论
GJ是近年来癌症的一个研究热点。有文献认
为，增强 GJ功能可增加化疗药对肿瘤细胞的细胞毒
作用;相反，减弱 GJ 功能则会减轻化疗药的细胞毒
作用［8-10］。在正常细胞中，是否也存在类似的作用，
研究却发现，对于正常睾丸间质细胞和支持细胞，增
强 GJ功能反而降低了顺铂的细胞毒性［11］。由此表
明，调控 GJ功能，在肿瘤细胞和正常细胞中会对化
疗药的细胞毒性出现完全相反的影响，其机制尚不
清楚。文献表明［12］，GJ 在正常细胞和肿瘤细胞中
对抗化疗药的细胞毒性作用恰恰相反，可能涉及到
“旁细胞效应”，即药物有可能刺激细胞产生了某些
死亡信号(如腺苷、前列腺素、谷氨酸、谷胱苷肽、磷
酸肌醇酯类、cAMP、NAD +及 Ca2 +等) ;且药物在损
伤肿瘤细胞的同时，也会激活多种修复机制和抗凋
亡机制，使得正常细胞产生保护信号(如:葡萄糖、
ATP和 维生素 C等)从而起到抵抗化疗药对正常细
胞的损害作用。已有实验表明，“旁观者效应”是 GJ
传递死亡信号的一种方式［13-14］。这些死亡信号可以
激活 caspase 9，通过线粒体通路来诱导肿瘤细胞凋
亡［15］。
在本研究中，我们采用细胞接种荧光示踪法研
究了 TFLC 对 TM3 细胞中 GJ 功能的影响。结果表
明，使用 TFLC可以显著增强 TM3 细胞的 GJ 功能。
目前认为药物主要通过两种机制影响 GJ功能:影响
GJ的通透性以及改变 Cx 的结构、数量及分布。在
正常的睾丸组织中表达的连接蛋白有 Cx43 和 Cx26，
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而间质细胞中主要表达 Cx43［16］。Cx 的磷酸化有可
能参与了 GJ的组装形成、通道开放的调控及内在化
降解等过程［17］。本研究结果发现，TFLC 能够明显
增强 TM3 细胞中 Cx43 总蛋白和胞膜 Cx43 蛋白的
表达。因此，TFLC 可能是通过增强 TM3 细胞 Cx43
总蛋白和胞膜 Cx43 蛋白的表达来增强细胞的 GJ功
能。是否 TFLC还影响 GJ通透性，本文未能涉及。
本文结果还证明了 TFLC 可以通过增强正常睾
丸间质细胞(TM3)GJ功能，减轻 OHP对体外培养正
常细胞的细胞毒作用，而这种作用仅在高密度培养
(有 GJ形成)细胞时才会出现;在低密度培养 (无
GJ形成)的细胞中，TFLC 不能影响 OHP 对 TM3 细
胞的毒性。这表明 TFLC减轻 OHP细胞毒性的作用
可能与 GJ功能增强有关。OHP 是临床上一种常见
的铂类化疗药物，其作用机制是当铂类药物进入细
胞后，铂可与 DNA 分子上的碱基结合形成 DNA 分
子链内或链间的交叉联合物，称为 DNA 加合物。这
种 DNA加合物破坏了 DNA的结构和功能。当 DNA
损伤过度无法修复时，就会引起细胞凋亡或坏
死［18-20］。在这一过程中，GJ 可能起着传递死亡或保
护信号的作用，其中具体的机制还有待进一步研究。
综上所述，本研究表明了 TFLC 可以增强 GJ 功
能，并在 OHP治疗时对正常细胞具有一定的保护作
用，进而减轻铂类药物对正常细胞的损害，对优化抗
肿瘤药物的临床应用具有一定的意义。
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(收稿日期:2013-10-01;接受日期:2014-01-13)
(本文编辑:史轶超)
·404· 中华男科学杂志 2014 年 5 月 第 20 卷 第 5 期 Natl J Androl，Vol． 20，No． 5，May 2014