全 文 ：·生物技术· 北方园艺 2010(23):140～ 142
第一作者简介:肖东梅(1984-),女 ,在读硕士, 研究方向为园林植
物与观赏园艺。
通讯作者:熊丽(1953-),女,本科,研究员 ,现从事杜鹃花资源驯化
及育种研究工作。 E-mail:xi51487@163.com。
基金项目:云南省科技创新强省资助项目(2007AB006)。
收稿日期:2010-09-19
三花杜鹃组培快繁技术的研究
肖东 梅1 , 宣 艳辉2 , 朱光杰2 , 熊 丽2
(1.云南农业大学园林园艺学院,云南 昆明 650201;2.云南绿大地生物技术股份有限公司,云南 昆明 650217)
摘 要:以菌子山采集的优良三花杜鹃单株的茎尖和茎段为外植体 ,研究三花杜鹃组培快繁
技术。结果表明:三花杜鹃组织培养的外植体采用 0.1%HgCl2 消毒 3 min ,2%NaClO 消毒 8
min ,茎尖的诱导率最高为 80%,采用0.1%HgCl2消毒 5 min ,2%NaC10消毒10 min ,茎段的诱导
率最高为 75%。分别比较了不同培养基对外植体诱导 、丛生芽增殖及试管苗生根的效果;初代培
养 ,外植体诱导不定芽最适培养基1/4 MS+ZT 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L ,三花杜鹃茎尖和茎
段的诱导率最高 ,达到90%;增殖培养基采用1/4MS+ZT 1.0 mg/L+NAA 0.1mg/L;壮苗培养
基采用 1/4 MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/ L效果最好;三花杜鹃最适生根培养基是 1/4 MS+
IAA 2.0mg/L+NAA 2.0 mg/L ,生根率为90%。移栽采用泥炭土+珍珠岩+蛭石比例为2∶1∶
1作为基质最好 ,成活率为86%。
关键词:三花杜鹃;组织培养;成活率;繁殖
中图分类号:S 685.21 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2010)23-0140-03
三花杜鹃(Rhododendron tri f loraHook.f.)属杜鹃
亚属(Subg.Rhododendron)三花杜鹃亚组(Subsect.Tri-
f lora(Hutch)Sleumer)常绿灌木 ,幼枝被鳞片 ,常无毛或
罕有柔毛或刚毛。叶革质 ,常两面被鳞片或仅背面被鳞
片 ,通常被无毛。花序顶生 ,短总状或近伞形 ,有花 5 ～ 8
朵 ,花瓣深裂 ,花蕊长 ,花朵平展 ,花萼不发达 ,花冠阔漏
斗状 ,红色 、紫色 、浅紫色 、白色 、白粉色或黄色 ,外侧有时
具鳞片或毛 ,雄蕊 10 ,不等长 ,花丝下部常具毛;子房 5
室 ,具鳞片;花柱通常无毛无磷片。硕果圆形或长圆状
卵球形。
三花杜鹃花色丰富 ,开花繁茂 ,树形优美 ,叶片有光
泽 ,极具园林观赏价值。三花杜鹃分布在海拔 1 500 ～
2 500 m山区 ,抗逆性强。在2010年云南百年一遇的大
旱气候条件下 ,经考察发现在土壤极其干旱的原生地三
花杜鹃开花仍十分繁茂 ,因此认为三花杜鹃是十分具有
开发利用前景的云南野生特色杜鹃花卉。从野生三花
杜鹃资源中筛选园艺性状凸显的优良单株 ,进行组培快
繁技术研究 ,对有效保护和规模化开发利用这一优势资
源意义明显。当前国内外有关杜鹃花的组培快繁技术
已有较多研究[ 1-5] ,但未见有三花杜鹃组培快繁技术完
整的 、系统性的报道。该研究利用茎尖 、茎段诱导分化 ,
增殖培养 ,成功获得大量的组培生根苗 ,且移栽成活
率高。
1 材料与方法
1.1 试验材料
来源于师宗菌子山野生三花杜鹃优良单株的茎尖
和茎段。
1.2 试验方法
1.2.1 消毒处理 将采集来的新鲜茎尖、茎段修剪 ,用
洗洁精清洗 ,再用自来水冲洗 30 min ,然后用 75%的酒
精消毒不超过 30 s;茎尖用 0.1%的 HgCl2 消毒 3 min ,
再用 2%NaClO消毒8 ～ 15 min;茎段用0.1%HgCl2 消
毒5 min ,2%NaClO消毒 8 ～ 15 min ,无菌水洗 4 ～ 5次 ,
然后用滤纸吸干表面水分 ,在无菌条件下接种进入组培
瓶培养。
1.2.2 培养条件 每天光照时间 12 h ,光照强度
1 500～ 2 000 lx ,培养温度(24±2)℃。
1.2.3 培养方法 不定芽的诱导:将消毒灭菌后的茎尖
接种于下列诱导培养基中;1/4 MS基本培养基 ,附加不
同种类和不同浓度的生长素 NAA(0.1 、0.5 mg/L)和细
胞分裂素 ZT(4 、3、2 mg/L),添加蔗糖 30 g/ L、琼脂
5 g/L 、pH 调至5.4。培养 40 d后观察不同培养基对诱
导率的影响。不定芽的增殖:以1/4 MS为基本培养基 ,
添加ZT (0.5 、1 mg/L)或 6-BA(1 、1.5、2 mg/L)、NAA
(0.1 、0.5 mg/ L)或 IAA(0.5 、1 mg/ L),蔗糖 30 g/L 、琼
脂 5 g/L 、pH 调至 5.4。培养 30 d后观察不同培养基对
增殖率的影响 ,调查各处理的出芽时间和生长状态。丛
140
北方园艺 2010(23):140 ～ 142 ·生物技术 ·
生苗的继代及壮苗:以 1/4 MS为基本培养基 ,添加 ZT
(0.5～ 1mg/L)、NAA(0.1mg/L)、蔗糖30 g/ L、琼脂5 g/L 、
pH 调至 5.4。培养 30 d后观察生长情况。生根与移
栽:选取高度为3 cm 以上的健壮组培苗进行生根培养 ,
以1/4 MS为基本培养基 ,添加 IBA(2 、1 、0 mg/ L)、NAA
(2 、1、0 mg/L)、蔗糖 30 g/ L、琼脂 5 g/L 、pH 调至 5.4。
30 d后观察三花杜鹃生根情况 ,待根长1 cm以上 ,即可
出瓶练苗。组培瓶在室内散射光条件下放置 1周左右 ,
用镊子取出组培苗 ,洗去根部粘连的培养基 ,移入装满
泥炭土+珍珠岩+蛭石(2∶1∶1)混合基质的穴盘中 ,浇
足定根水。
2 结果与分析
2.1 三花杜鹃初代培养结果
2.1.1 不同消毒时间对外植体成活率的影响 由表 1
可知 ,采用 0.1%HgCl2 消毒 3 min , 2%NaClO 消毒
8 min ,茎尖的成活率最高为 80%;采用 0.1%HgCl2消
毒5 min ,2%NaClO消毒 10 min ,茎段的成活率最高为
75%,茎尖的成活率高于茎段。三花杜鹃的叶片及幼茎
无毛(或鳞片),并于春天选取刚抽生的幼茎作为外植
体 ,得到了灭菌成活率相对较高的效果。但三花杜鹃对
杀菌剂的感应性强 ,掌握适宜的灭菌浓度及时间也是提
高成活率的重要因素。
表 1 不同消毒时间对外植体成活率的影响
试材 0.1%HgCl2 2%NaClO 每瓶接种数 每瓶成活数 成活率/ %
茎尖 3 8 20 16 80
3 10 20 8 40
3 15 20 3 15
茎段 5 8 20 8 40
5 10 20 15 75
5 15 20 5 25
2.1.2 不同激素浓度对三花杜鹃诱导率的影晌 试验
发现 , 经灭菌接种后的外植体 , 其腋芽在附加 4 ～
2 mg/L ZT 的 1/4MS培养基中被诱导萌发。一般为接
种2周后 ,可看到腋芽开始膨大;4周左右 ,小幼芽形成 ,
并带有叶片(图1)。试验表明 ,由表 2可知 ,在 1/4 MS
+ZT 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 的培养基中 ,三花杜
鹃茎尖和茎段的诱导率最高 ,达到了 90%。随着高度的
增加 ,将新发的带有多个腋芽的茎段切断 ,进入增殖
培养。
表 2 不同激素浓度对三花杜鹃诱导率的影晌
培养基编号 培养基/ mg·L-1
接种瓶
数/瓶
诱导瓶
数/瓶 诱导率
A 1/4 MS+ZT 4.0+NAA 0.1 20 16 80
B 1/4 MS+ZT 3.0+NAA 0.1 20 9 45
C 1/4 MS+ZT 2.0+NAA 0.1 20 3 15
D 1/4 MS+ZT 4.0+NAA 0.5 20 17 85
E 1/4 MS+ZT 3.0+NAA 0.5 20 18 90
F 1/4 MS+ZT 2.0+NAA 0.5 20 8 40
2.2 不同的细胞分裂素及浓度对三花杜鹃增殖的影响
由表3 、4可看出 ,三花杜鹃的丛生芽在含不同细胞分
裂素和生长素的培养基中萌发的数量不同。在1/4 MS+
ZT 1 mg/ L+NAA 0.1 mg/L培养基上三花杜鹃的增殖
率相对较高 ,而降低ZT 为 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/ L
时 ,虽然分化率降低 ,但分化苗的粗度和高度增加。
在增殖培养基中 ,经过40 d的培养后 ,再次转接进
行继代培育 ,分化苗生长旺盛 ,部分侧芽又会萌生丛生
芽 ,基部也会生长出大量的丛生芽 ,有的多达10株以上 ,
甚至还有数量较多的小芽簇 ,平均增殖系数大 ,可达到
短期内大量繁殖的目的 ,不足的是多数丛生苗纤细。当
降低ZT 浓度至0.5mg/L 时 ,可有效控制丛生苗及分化
芽的数量 ,分化苗增粗 ,丛生苗纵向生长 ,大苗增多(图
2)。由此可见 ,ZT 对三花杜鹃丛生芽增殖系数的影响
很大 ,继代次数越多 ,增殖能力就越强。将三花杜鹃丛
生苗切成单苗 ,放进降低ZT 浓度 、增加 NAA 浓度的培
养基中 ,可达到壮苗的目的。采用苗高达到 4 cm 左右
的健壮幼苗进入生根培养 ,可提高生根苗的质量和组培
苗的过渡成活率。
在 6-BA和 IAA的培养基上 ,三花杜鹃的增殖效果
不明显 ,部分苗出现黄化 ,还有少量的苗出现玻璃化现
象 ,腋芽萌发少 ,伸长量较小 ,长势较差。由此可见 ,6-
BA和 IAA组合的培养基不适宜用作三花杜鹃增殖培
养基 ,而ZT 是三花杜鹃离体培养的最佳细胞分裂素。
表 3 外源激素ZT 对三花杜鹃增殖率的影响
培养基
编号
ZT浓度
/ mg·L-1
NAA 浓度
/ mg·L-1
增殖
系数 生长状况
G 1 0.1 10 侧芽伸长 ,茎基部长出许多丛生芽,芽小,苗旺
H 1 0.5 8 侧芽伸长 ,茎基部长出较多丛生芽,芽小,苗纤弱
I 0.5 0.1 6.5 侧芽伸长 ,茎基部长出丛生芽 ,茎细 ,苗较高
J 0.5 0.5 3.16 侧芽伸长 ,茎基部长出的丛生芽较少 ,茎稍粗 ,节长
表 4 外源激素6-BA对三花杜鹃增殖率的影响
培养基
编号
6-BA浓度
/ mg·L-1
IAA浓度
/ mg·L-1
增殖
系数 生长状况
K 1 0.5 2 茎尖与侧芽伸长 1 ～ 2个节 ,长势一般,苗小
L 1 1 2.5 茎尖与侧芽伸长 1 ～ 2个节 ,长势一般
M 1.5 0.5 1 茎尖略微伸长 ,侧芽萌动少 ,长势弱
N 1.5 1 2 茎尖与侧芽伸长 1 ～ 2个节 ,长势一般
O 2 0.5 1.5 茎尖与侧芽伸长 1 ～ 2个节 ,长势较弱
P 2 1 3.5 茎尖与侧芽伸长 2 ～ 3个节 ,长势较强
2.3 生根培养
生长素对三花杜鹃组培植株不定根的诱导作用明
显 ,对不同生长素作用效果差异的研究发现[ 6] ,NAA与
IAA共同作用比单独使用效果好 ,可提高根的数量 、质
141
·生物技术· 北方园艺 2010(23):140～ 142
量 ,且有利于移栽练苗。
由表 5可知 ,经过 4周的培养 , R号生根培养基上
的生根效果最好 ,生根率达到 90%,根的数量和根长也
达到所有处理的最佳结果。当使用 IBA 的浓度为
2 mg/L ,NAA 的浓度为 0时 ,生根率最低为 15%～
20%;但改变激素 IBA的浓度为 0时 ,三花杜鹃生根率
可达 50%～ 60%,表明生长素 NAA应是三花杜鹃组培
苗的有效生根物质。
表 5 植物生长调节剂对三花杜鹃生根培养的影响
培养基
编号
IBA浓度
/mg·L-1
NAA浓度
/mg·L-1
生根率
/ %
平均根数
/条
平均根长
/ cm
Q 2 0 20 4 0.7
R 2 2 90 25 1.2
S 1 1 33 8 0.5
T 1 0 15 3 1.0
U 0 1 50 5 0.8
V 0 2 60 6 0.6
图 1 三花杜鹃的诱导培养 图 2 三花杜鹃的增殖培养
3 讨论
该研究中选择的外植体为多年生的野生三花杜鹃 ,
由于其生长在野外环境 ,导致灭菌较困难 ,需把握好采
芽时间和灭菌处理条件。茎尖虽比茎段的诱导率稍高 ,
但茎段材料更易获取。杜鹃花组培中外植体的诱导分
化与使用的外源激素种类密切相关[ 7] ,试验中发现 ,与
6-BA 相比 ,细胞分裂素ZT 对三花杜鹃的诱导分化作用
明显。
在应用组培技术进行观赏植物的快速繁殖中 ,繁殖
系数是决定试管苗生产效益和成本的一个重要因素。
ZT 对丛生芽增殖系数的影响很大 ,继代次数越多 ,增殖
率也越高。分切三花杜鹃的幼小芽苗 ,进入降低 ZT 及
增加 NAA浓度的培养基 ,可达到壮苗的目的。ZT 价格
昂贵 ,在三花杜鹃诱导分化前期 ,该试验选用了 ZT 浓度
相对较高的培养基 ,对已分化出的小幼苗 ,使用 ZT 浓度
相对较低的培养基进行继代及壮苗培养 ,既节约了成
本 ,也获得了较好的增殖效果和提高了组培苗质量。
该研究通过对植物生长素 、细胞分裂素及使用浓度
的比较选择 ,探索出一套高效的三花杜鹃组培快繁技
术 ,可在短期内达到三花杜鹃规模化生产 、保护野生杜
鹃资源和开发利用并举的目的。
参考文献
[ 1] 范玉清.国外杜鹃花组织培养发展概况[ J] .生物学杂志 , 1996 , 70
(2):30-31.
[ 2] Anderson W C.A revised ti ssue cultu re medium for shoot multiplication
of Rhododendron [ J] .Journal of the American Society for Horticultural Sci-
ence ,1984(109):343-347.
[ 3] Economou A S , Read P E.In vitro shoot proliferat ion of M innesota de-
ciduous azaleas[ J] .Hortscience , 1984(19):60-61.
[ 4] Douglas G C.Propagation of eight cultivars of Rhododendron in vitro
using agar-solidified and liquid media and di rect rooting of shoots in vivo [ J] .
Scientia Hort iculture , 1984(24):337-347.
[ 5] Read P E ,Fellman C D.Accelerat ing acclimation of in vitro propagated
w oody ornamentals [ J] .Acta Horticulture ,1985 ,166:l5-20.
[ 6] 崔丽华.植物生长调节物质对组织培养中不定芽不定根的作用[ J] .
辽宁师专学报 ,2000 ,6(2):97-99.
[ 7] Hsia C N ,Korban S S.The influence of cytokinins and ionic strength of
Andersons medium on shoot establishment and prolif eration of evergreen a-
zalea[ J] .Euphytica , 1997 ,93:11-l7.
Study on Rapid Propagation of Rhododendron trif lora
XIAO Dong-mei1 , XUAN Yan-hui2 , ZH U Guang-jie2 , XIONG Li2
(1.College of Horticulture and Landscape , Yunnan Agricultural University , Kunming , Yunnan 650201;2.Yunnan Greenland Biology Technological
Stock Limited Company , Kunming , Yunnan 650217)
Abstract:The tip shoot and stalk node of Rhododendron tri f lora f rom Junzi Mountian were used as explants , the
tissueculture rapid propagation of Rhododendron tri f lora were studied.The results show ed that the tip shoot on inducing
the plant regeneration and the inductivity had reached 80%by 0.1%HgCl2 sterilizing for 3 minutes and 2% NaClO
8 minutes and stalk node had reached 75%by 0.1%HgCl2 for 5 minutes and 2%NaClO for 10 minutes.The comparison
of the effects of different media on the explants induction , the proliferation of clump sprouts and the test-tube plantlet
rooting show ed that in primary culture , the best medium for explants induction was 1/4 MS+ZT 3.0 mg/L +NAA
0.5 mg/L , tip shoot and stalk node of Rhododendron tri f lora on inductivity had highly reached 90%.The best for
proliferating clump sprouts was 1/4 MS+ZT 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/ L.The best medium for the st reng thening
culture was 1/4 MS+ZT 0.5 mg/ L+NAA 0.1 mg/ L.The best medium for the rooting culture was 1/4 MS+IAA
2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/ L.The best stroma of the plantlets out of test-tube was Peat+pearlite+roseite consisting of
2∶1∶1 , the transplant survival percent reach 86%.
Keywords:Rhododendron tri f lora;tissue culture;success ratio;propagation
142