全 文 ：植物病理学报
ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA　39(3):314-317(2009)
收稿日期: 2008-10-18;修回日期: 2009-03-02
基金项目:国家科技支撑计划项目(2006BAI09B01-03)
通讯作者:丁万隆 ,研究员 ,主要从事中药材病害生物防治研究;Tel:010-62899745, E-mail:wlding@implad.ac.cn。
研究简报
北京地区柴胡根腐病的病原菌鉴定
李 勇1 , 刘时轮 1, 2 , 杨成民 1 , 魏建和 1 , 丁万隆1＊
(1 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所 , 北京 100193;2沈阳农业大学植物保护学院 , 沈阳 110161)
IdentificationofrootrotpathogenofBupleurum chinenseDC.inBeijingarea　LI
Yong1 , LIUShi-lun1, 2 , YANGCheng-min1 , WEIJian-he1 , DINGWan-long1　(1InstituteofMedicinalPlantDe-
velopment, ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalColege, Beijing100193, China;2PlantProtection
College, ShenyangAgriculturalUniversity, Shenyang110161, China)
Abstract:RootrotdiseaseisoneofthemostimportantdiseasesofBupleurumchinenseDC..Pureisolates
fromhosttissueswereobtained.Theresultsofpathogenicitytest, morphologyobservationandITSsequence
analysisindicatedthatthediseasewascausedbyFusariumoxysporum.
Keywords:BupleurumchinenseDC.;rootrot;pathogenidentification;ITS
文章编号:0412-0914(2009)03-0314-04
　　柴胡(BupleurumchinenseDC.)别名北柴胡 、
竹叶柴胡 ,为伞形科多年生草本植物 ,以根入药 ,是
我国常用大宗中药材品种。柴胡主要分布于我国
华北 、西北和东北地区 ,主产于山西 、陕西 、河北 、河
南 、辽宁 、吉林等地 [ 1] 。柴胡以前多处于野生状
态 ,根腐病仅零星发生 。随着近年人工栽培面积的
不断扩大 ,柴胡病虫害发生日益严重 ,其中根腐病
为害尤其严重 ,经常造成二年生柴胡枯死 ,一般发
病率在 15% ～ 30%,严重田块达 60%以上 ,已成为
影响柴胡生产的主要问题之一 。
目前 ,国内外有关柴胡根腐病的研究报道极
少 ,仅见 Xiang等[ 2]提及柴胡根腐病致病菌为半知
菌的腐皮镰刀菌(Fusariumsolani);Zhu等 [ 3]研究
发现 ,施用氮 、钾肥会显著降低柴胡对根腐病的抗
性 ,大量施用磷肥可以降低柴胡根腐病病情指数。
近年来 ,根腐病在各柴胡主产区发病有逐年加重趋
势 。为此 ,笔者在对柴胡根腐病菌分离的基础上 ,
对柴胡病原菌从形态学 、致病性和分子生物学方面
进行了系统研究 ,为增强人们对柴胡根腐病及其致
病菌的了解以及病害防治奠定理论基础 。
1　材料与方法
1.1　标样采集和病原菌分离
从北京市延庆县永宁镇和中国医学科学院药
用植物研究所柴胡试验基地采集柴胡根腐病株标
样。将新鲜的病株和健株根部用清水冲洗干净 ,观
察柴胡根腐病根部症状。病样根部经 75%乙醇表
面消毒后 ,从病健交界处用灭菌刀片切取 0.5 ～ 1
cm根段 , PDA培养基上 25℃恒温培养 。从发病的
根部组织挑取少量新近长出的病菌菌丝体 ,装入斜
面 PDA培养基 , 4℃保存备用。病原菌的具体分离
操作参照 Fang[ 4]的 《植病研究方法 》。
1.2　形态观察
将分离获得的候选真菌分别在 PDA和麦汁培
养基(小麦粒 30 g煮沸 30 min,加琼脂 15 g后用
水定容至 1L)上 25℃恒温培养 7 d,观察菌落形
态 、颜色 ,测量菌落生长速度;用显微镜观察候选真
　
　3期 李 勇 , 等:北京地区柴胡根腐病的病原菌鉴定
菌分生孢子形态 、大小 ,隔膜有无及数目 、产孢结
构 、厚垣孢子有无及着生部位等 。
1.3　致病性测定
1.3.1　离体接种　选取健康无病的一年生柴胡根
组织 ,用清水冲洗干净 , 75%乙醇消毒 5 min,再用
无菌水冲洗多次 ,置于事先灭菌的培养皿中。采用
针刺法接种 ,接种浓度(1×107个孢子 /mL),接种
量 0.1mL, 25℃恒温保湿培养 ,以接种等量无菌水
作为对照。对照和处理各 3次重复。
1.3.2　田间和室内盆栽接种　用分离的候选真菌
分别接种田间种植和室内盆栽的健康一年生柴胡
根部 ,接种量和接种浓度同 1.3.1,以接种等量无
菌水作为对照。接种后的植株继续在田间和室内
花盆中生长 ,对照和处理各接种 10株 ,定期观察发
病情况 。
1.4　病原菌分子鉴定
1.4.1　基因组 DNA提取　柴胡致病菌在 PDA培
养基上 25℃恒温培养 7 d后 ,取 0.1 g菌丝体 ,加
液氮研磨 ,用真菌基因组提取试剂盒(美国 Omega
公司)提取病原菌基因组总 DNA,具体操作步骤按
照试剂盒说明进行。
1.4.2　rDNA-ITS区段扩增　用真核生物基因组
中的 rDNA-ITS区段通用引物 ITS1(5′-TCCG-
TAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4 (5′-TCCTC-
CGCTTATTGATATGC-3′)扩增病原菌基因组
DNA。引物由上海生工生物工程技术服务有限公
司合成。 PCR反应体系为 25 μL,包括:10 ×PCR
Buffer(含 Mg2+)2.5 μL, dNTP(2.5 mmol/L)1
μL,模板 DNA(约 30 ng)1 μL,引物 ITS1和 ITS4
(5 μmol/L)各 1 μL, TaqDNA聚合酶 (2.5 U/
μL)1 μL, ddH2O17.5 μL。 PCR扩增在 Thermo
Tgradient96型扩增仪(美国 Biometra公司)上完
成 ,扩增程序为:94℃预变性 5 min;94℃变性 1
min, 55℃退火 30s, 72℃延伸 1 min, 32个循环;最
后 72℃延伸 10min。PCR扩增产物用 1%琼脂糖
凝胶电泳检测 , Bio-Rad凝胶成像系统观察 、照相 。
1.4.3　纯化及测序　扩增产物经 1%琼脂糖凝胶
电泳 ,在紫外灯照射下从凝胶中切取目的条带 ,经
琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京汇天东方生物技术
有限公司)纯化 ,由上海生工生物工程技术服务有
限公司测序 。
1.4.4　同源性分析　测序结果经 BLAST(htp://
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)与 NCBI数据库中
的已知序列进行同源性比较 ,根据同源性比较结
果 ,结合对病原菌的形态学观察及致病性测定 ,最
终鉴定柴胡根腐病病原菌 。
2　结果与分析
2.1　病害症状
根腐病主要为害柴胡主根 ,亦为害侧根。发病
初期 ,自根茎交界处产生黑褐色斑点 ,后逐渐扩大
呈圆形 、近圆形或不规则病斑 。发病后期 ,根部表
皮自顶端向下产生纵向干裂 ,裂口变褐或发黑并逐
渐加宽 、加深(图 1)。发病初期 ,地上部分与健株
无明显区别 ,后期裂口遍及根部整个外围 ,发病部
位稍膨大 ,病部组织变硬 、变脆 ,裂口深及木质部并
造成水分 、营养运输中断 ,导致整个植株萎蔫死亡 。
田间一年生柴胡在当年秋季地上部枯萎后即有发
生 ,二年生柴胡在 5 ～ 8月份为病害高发期。
Fig.1　SymptomsonrootsofBupleurum chinenseinoculatedwithrootrotpathogen
a:Diseasedroot;b:Healthyroot;c:Inoculatedplantinthefield;d:Inoculatedplantinthelab.
315
　
植物病理学报 39卷
2.2　形态特征
自柴胡根部发病部位只分离到 1种真菌 ,在
PDA培养基上生长迅速 ,菌丝体乳白色 ,气生菌丝
发达 ,不易产孢;在麦汁培养基上生长稍慢 ,菌落呈
灰白色 ,气生菌丝稀疏 ,易于产孢 。从麦汁培养基
上挑取少量菌丝 ,镜检发现大量分生孢子和分生孢
子梗。大分生孢子镰刀形 , 1 ～ 3个隔膜(3个隔膜
者占总数的 98%以上), (14.9 ～ 36)μm×(3.3 ～
4.4)μm(图 2a),簇生(图 2d);小分生孢子数量
多 ,卵形 、长椭圆形或短棒状 ,无隔膜 , (4.3 ～ 5.6)
μm×(2.3 ～ 3.0)μm(图 2b),由侧生分生孢子梗
产生(图 2e);厚垣孢子近圆形 , 顶生或间生(图
2c)。
2.3　致病性测定
为了明确分离菌的致病性 ,首先在室内用离体
根组织进行接种 。接种 3d后 ,接种点周围开始腐
烂 , 7 d后整个根段组织布满白色菌丝体;随后 ,在
室内及田间用活体植株进行接种。研究发现 ,接种
5 d后 ,接种部位出现黑色斑点 ,后病斑逐渐环周
扩展 ,地上部叶片卷曲并逐渐萎蔫 ,呈现与田间自
然发病植株类似症状 。无论是离体接种还是活体
接种 ,对照均无发病症状。从根部病组织重新分离
病原物经显微镜观察发现 ,再次分离的病原菌与原
接种病原菌在菌落 、分生孢子等形态特征上完全一
致。根据致病性测定结果及病原菌形态特征观察 ,
参考 Booth[ 5]的《镰刀菌属》一书 ,将柴胡根腐病病
原菌初步鉴定为尖孢镰刀菌 (Fusariumoxyspo-
rum)。
2.4　病原菌分子鉴定
2.4.1　rDNA-ITS区段扩增及测序　以病原菌基
因组 DNA为模板 ,用 rDNA的 ITS区段通用引物
ITS1和 ITS4扩增 ,得到 1条近 600 bp的扩增条
带。经回收 、纯化及序列测定 ,扩增条带实际为
544bp(图 3)。
2.4.2　同源性分析　BLAST分析结果显示 ,该扩
增片段的核酸序列 (登录号:EU862240)与 Gen-
Bank中 F.oxysporum对应 ITS序列的同源性最
高 , 其 中 与 ITS序 列 (FJ605243、 AB369482、
AB369259、EU285554)的同源性为 99.6%,与 ITS
序列(FJ233193、EU285553、EU285552、EF590328、
EF495237、 EF495230、 DQ459007、 DQ452455、
DQ452454、DQ452450、AY188919、FJ605244)的同
源性为 99.4%。本研究分离的镰刀菌形态特征与
尖孢镰刀菌(F.oxysporum)基本一致 。综合形态
学观察 、致病性测定及 ITS分析结果 ,最终确认本
研究分离的柴胡根腐病病原菌为尖孢镰刀菌(Fu-
sariumoxysporum)。
Fig.2　AsexualsporesofrootrotpathogenofBupleurum chinense
a:Macroconidia;b:Microconidia;c:Chlamydospores;d:Conidiophoresofmacroconidia;e:Conidiophoresofmicroconidia.
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　3期 李 勇 , 等:北京地区柴胡根腐病的病原菌鉴定
Fig.3　AgarosegelelectrophoresisofFusari-
um oxysporum genomicDNA (a),
ITSregionamplifiedbyprimersITS1
andITS4 (b)
3　讨论
根据病斑上的病原菌形态特征和致病性测定
结果 ,确定柴胡根腐病由尖孢镰刀菌(F.oxyspo-
rum)引起 ,鉴定结果不同于 Xiang等 [ 2] 描述的柴
胡根腐病病原菌为腐皮镰刀菌(F.solani)。但鉴
于本研究采集的病害标样仅局限于中国医学科学
院药用植物研究所及北京郊县 ,不排除从其它柴胡
产区分离出新类型根腐病致病菌的可能。
　　大面积人工栽培柴胡导致其根腐病的发生和
为害逐年加重。目前未见有关该病害的系统研究
报道 ,应在充分研究病害侵染循环的基础上 ,尽快
开展相关防治技术研究。
参考文献
[ 1] 　YaoL, ChengHZ, YangZ.Beijing:Guidelinesof
goodagriculturalpracticesofChinesecrudedrugs(in
Chinese)[ M] .Beijing:ChinaAgriculturePress(北
京:中国农业出版社), 2005.
[ 2] 　XiangQ, LiXL, LiangZS, etal.Surveyofmajor
pestsandcontrolinDupleurumchinense(inChinese)
[ J] .ShaanxiJournalofAgriculturalSciences(陕西
农业科学), 2005, 2:39-41.
[ 3] 　ZhuZB, LiangZS, WeiXR, etal.Preliminary
studyonN, P, KfertilizertocontrolofrootrotofDu-
pleurumchinense(inChinese)[ J] .JournalofChi-
neseMedicinalMaterials(中药材), 2006, 29(10):
1005-1007.
[ 4] 　FangZD.Plantpathologyresearchmethods(3thed.)
(inChinese)[ M] .Beijing:ChinaAgriculturePress
(北京:中国农业出版社), 1998.
[ 5] 　BoothC.(translatedbyChenQY).Fusariumgenus
(inChinese)[ M] .Beijing:AgriculturePress(北京:
农业出版社), 1988.
责任编辑:张国珍
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