全 文 ：　＊国家自然科学基金资助项目(编号:30600598),上海市青年科技
启明星计划 (编号:06QA14034), 上海市科研计划项目 (编号:
08411964800)
　■通信作者。医学博士 ,副主任医师 ,副教授;E-mail:leejiyu@si-
na.com
溪黄草有效成分 Nodosin保留灌注对供肝缺血期的
保护作用＊
王震宇 1 , 杜隽铭 1 , 丁晶 1 , 孙丽娟 2 , 李济宇 1■ , 全志伟1
1上海交通大学医学院附属新华医院普外科(上海 200092);2华东理工大学药学院(上海 200237)
　　【摘要】　目的　研究肝脏保留灌注溪黄草有效成分 Nodosin对大鼠供肝缺血期的保护作用和作用机制。方
法　将实验雄性 Wistar大鼠随机分为 6组(n=3):空白对照组(乳酸钠林格液 LR组)、实验组(低浓度 NL组 、中
浓度 NM组 、高浓度 NH组)和阳性对照组(Co组)、阴性对照组(Zn组)。实验动物经门静脉灌注实验药物 , 于灌
注后 0、1、2 h时相点取肝脏组织标本 ,用比色法测定肝脏 SOD酶活性和 MDA含量 , Banff标准评价损伤的病理表
现 , 胆红素生成试验测定 HO-1酶活性。结果　NH组和 Co组肝脏保留灌注 2h后 , MDA含量和 Banf评分明显
低于 LR组(P<0.05), SOD酶活性和 HO-1酶活性明显高于 LR组(P<0.05);Zn组肝脏保留灌注 2 h后 , MDA
含量明显高于 LR组(P<0.05), SOD酶活性和 HO-1酶活性明显低于 LR组(P<0.05)。结论　保留灌注溪黄
草有效成分 Nodosin可以提高大鼠供肝抗氧化能力 ,减轻肝脏组织缺血期损伤 , 其作用可能是通过诱导肝脏组织
HO-1酶表达上调来实现的。
【关键词】　肝灌注;缺血期损伤;Nodosin;血红素加氧酶 -1;肝脏移植
TheprotectionfromischemicinjuryinratliverbyreservedinfusionwithNodosin　WANGZhen-yu☆ , DUJun-
ming, DINGJing, SUNLi-juan, LIJi-yu, QUANZhi-wei.☆DepartmentofGeneralSurgery, XinhuaHospital,
ShanghaiJiaotongUniversitymedicalschool, Shanghai200092, China
CoresponddingAuthor:LIJi-yu.E-mail:leejiyu@sina.com
　　【Abstract】　Objective　Tostudythemechanismofprotectionfromischemicinjuryinratliverbyreservedinfusing
withNodosin.Methods　 EighteenmaleWistarratswererandomlyassignedinto6groups(n=3):Controlgroup(lacta-
tedringerssolution, LRgroup), experimentgroups(Nodosin-Lowconcentrationgroup, Nodosin-Middleconcentration
group, Nodosin-Highconcentrationgroup), positivecontrolgroup(Coppgroup), andnegativecontrolgroup(Znpp
group).Hepatictissueswereobtained0h, 1hand2hafterperfusion.ActivityofSODandthequantityofMDAwereas-
sessedviausingcolorimetricmethod, whiletheseverityofpathologyinjurywasevaluatedaccordingtoBanfCriteria, and
theactivityofHO-1 wasassessedviausingbilirubinproductiontest.Results　 ThequantitiesofMDAandBanfs
scoresinNHgroupandpositivecontrolgroup(Coppgroup)weresignificantlylowerthanthatincontrolgroup(P<0.05)
at2h, whileactivitiesofSODandHO-1weresignificantlyhigher(P<0.05).ThequantityofMDAinnegativecontrol
group(Znppgroup)wassignificantlyhigherthanthatincontrolgroup(P<0.05)at2h, whiletheactivitiesofSODand
HO-1 wassignificantlyhigher(P<0.05).Conclusion　ReservedinfusionwithNodosincanimprovetheanti-oxidant
abilityofratlivertoprotectfromhepaticischemicinjury, whichmaybemediatedbyinductionofHO-1 expression.
【Keywords】　heparinfusion;ischemicinjury;nodosin;hemeoxygenase-1;livertransplantation.
　　近年来 ,肝脏移植(livertransplantation, LT)治疗迅
猛发展 ,已经成为了治疗多种终末期肝病的有效方法。
但是在进行肝脏移植治疗的同时 ,供肝缺血期损伤造
成的移植物失功能仍是目前影响受者长期存活的重要
因素之一 [ 1] 。近年来 ,研究发现移植物组织本身还存
在着保护性基因 [ 2] ,其表达上调对术后移植物功能维
护方面起到了非常重要的作用。因此 ,如何通过 “快
速 、有效 、安全 ”的方法 ,诱导供肝保护性基因上调 ,使
供肝在缺血期早期就拥有自我保护能力 ,成为了我们
此次研究的目的。在本次实验中 ,我们通过分离得到
溪黄草有效成分 Nodosin,将其配制成一定浓度溶液保
留灌注肝脏 ,观察其对供肝缺血期的保护作用和作用
机制。
1　材料与方法
1.1　实验材料及分组　Nodosin的获得来自溪黄草有
效成分的萃取 、分离和纯化 ,通过细胞筛选实验证实其
作用 ,通过波谱鉴定其分子结构 [ 3] 。血红素加氧酶 -1
(hemeoxygenase-1, HO-1)诱导剂钴原卟啉 (Cobalt
Protoporphyrin, CoPP)[ 4] , HO-1抑制剂锌原卟啉 (Zinc
Protoporphyrin, ZnPP)[ 4]购自 Alexis公司;丙二醛 (ma-
londialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxidedis-
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DOI :10.13820/j.cnki.gdyx.2010.05.007
mutase, SOD)活性试剂盒分别购自 Cayman公司和 Bio-
Vision公司;血晶素 (hemin)购自 Sigma公司。 Wistar
大鼠购自中科院上海实验动物中心 ,雄性 ,体重约为
250 ～ 300 g,随机分为 6组 ,每组 3只。
空白对照组 (LR组 )用 0 ～ 4℃乳酸钠林格液
(lactatedringerssolution, LR),实验组(N组)用 0 ～ 4℃
Nodosin浓度为 L:10 μg/mL;M:20 μg/mL;H:200
μg/mL, 3组浓度溶液(Nodosin溶解于二甲基亚砜后经
乳酸钠林格液稀释 ,二甲基亚砜浓度小于 1/1000)。
阳性对照组 (Co组)用 HO-1诱导剂 CoPP(浓度为
125 μg/mL)和阴性对照组 (Zn组 )用 HO-1抑制剂
ZnPP(浓度为 500 μg/mL),分别溶解于 0.2 mmol/L
NaOH中 ,用 1 mmol/LHcl调节 pH到 7.4,乳酸钠林格
液稀释。
1.2　肝脏的灌注　Wistar大鼠乙醚麻醉后 ,取大 “十 ”
字切口进腹。经门静脉插管灌注含 25单位 /mL肝素
的 0 ～ 4℃ 0.9%生理盐水 20 mL,剪开肝上及肝下下腔
静脉放血 ,直到肝脏呈均匀黄白色。取出肝脏后 ,置于
0 ～ 4℃ 0.9%生理盐水中 ,经门静脉插管 ,灌注各组实
验溶液 15 mL(灌注时灌洗速度控制在 2 ～ 3 mL/min)。
用无损伤血管夹夹闭门静脉 、肝上下腔静脉 、肝下下腔
静脉。分别于灌注后 0、1、2 h时间点取材。获取的肝
脏组织 -80℃保存备用。
1.3　组织学检查　各组标本在各时间点取材。取右
侧肝叶组织约 1 cm×1 cm×1cm,经 10%甲醛固定 ,石
蜡包埋 , HE染色后 ,光镜下检查组织损伤程度 ,并用
Banf标准评分 [ 5] 。 Banf评分标准是根据肝小叶结构
破坏和气球样变的严重程度按照 0 ～ 4分尺度分等级
的 ,没有改变为 1分 ,严重的肝小叶结构破坏或气球样
变为 4分。
1.4　比色法测定肝脏超氧化物歧化酶 (SOD)活性和
丙二醛(MDA)含量 　取肝脏组织洗去残血并吸干水
分 ,用天平称取 1 g肝脏组织 ,用 0.9%生理盐水配置
成 100 g/L组织匀浆 ,于 3 000 r/min离心 10 min,离心
半径 12 cm,吸取上清液 , 严格按照试剂盒说明书进行
操作 ,测量肝脏组织 SOD酶活性及 MDA含量。
1.5　HO-1酶活性检测　采用 HO-1降解血红素生
成胆红素和 CO原理 ,测定肝脏标本中胆红素生成量
代表 HO-1酶活性。肝脏组织制成冰冻匀浆 ,匀浆和
0.5 mmol/LNADPH, 0.8 mmol/L6 -磷酸葡萄糖 , 1.0
U的 G-6 -P脱氢酶 , 1 mmol/L氯化镁 , 10 mL纯化的
鼠胆绿素混合 ,加入 Hemin,在 37℃黑暗中孵育。
1.6　统计学方法　采用 SAS6.12统计软件 ,用 Gener-
alLinearModelsProcedure进行方差分析 , Student-
Newman-Keulstest进行均数间的两两比较。
2　结果
2.1　采用伊红染色观察病理变化　LR组的肝脏标本
经伊红染色后显示肝细胞浊肿较为明显 ,可见大量气
球样变且范围呈满视野 ,肝小叶结构轻度紊乱 , Banf
评分为 2.67±0.58(LR-2 h组);实验组 (N组)和阳
性对照组(Co组)基本相似 ,病理提示肝细胞浊肿很轻
且范围呈灶状分布 ,未见明显空泡变 ,各时间点的病理
变化无明显差别 , Banf评分为 1.33 ±0.58(NH-2 h
组)与 LR-2 h组比较差异有统计学意义(P<0.05);
Zn组显示肝细胞浊肿较为明显 ,可见大量气球样变且
范围呈满视野 ,肝小叶结构紊乱 , Banf评分为 3.67 ±
0.58(Zn-2 h组)。见图 1。
A、B:分别为空白对照组 LR-1h、LR-2h;C、D:分别为实验组NH-
1h、NH-2h;E、F:分别为阳性对照组Co-1h、Co-2h;G、H:分别为
阴性对照组 Zn-1h、Zn-2h
图 1　各组灌注保存肝脏病理图(HE, ×20)
2.2　测定肝脏标本中 SOD酶活性 (NU/mL)和 MDA
含量(nmol/mL)　NH组和 Co组在灌注后 0、1和 2h时
间点的 SOD酶活性均高于 LR组(P<0.05, P<0.01);
Zn组在灌注后 1 h和 2 h时间点的 SOD酶活性均低于
LR组(P<0.05);NH组和 Co组在灌注后 0、1和 2 h时
间点的 MDA含量均低于 LR组(P<0.05, P<0.01);Zn
组在灌注后 1和 2 h时间点的 MDA含量均高于 LR组
(P<0.05)。见图 2、3。
2.3　测定肝脏标本中 HO-1酶活性(nmol/(h· L))
　实验组(NM组和 NH组)和阳性对照组(Co组 )在
保留灌注后 1和 2 h时间点的 HO-1酶活性均高于空
白对照组 (LR组 )(P<0.05, P<0.01);阴性对照组
(Zn组)在保留灌注后 1和 2 h时间点的 HO-1酶活
性均低于空白对照组(LR组)(P<0.05)。见图 4。
3　讨论
肝脏移植已成为终末期肝脏疾病的首选治疗方
法 ,而原发性供肝无功能和供肝早期失功能依然是影
响原位肝脏移植效果的重要因素 ,这些都与肝脏缺血
期的损伤相关 [ 1] 。目前使用的肝脏缺血期保存方法是
通过低温冷保存降低供肝的代谢速率 ,同时这会抑制
细胞膜 Na+ -K-ATP酶功能 ,导致细胞水肿。为此研
究者纷纷在 UW保存液中加入各种胶体成分 ,以减轻
细胞水肿 ,可是黏度的增加也可能导致胆管周围小动
脉丛灌注不足从而对胆管造成损伤 [ 6] 。不仅如此 ,肝
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源的紧缺已成为肝脏移植治疗的主要矛盾 ,如果应用
脂肪肝作为供肝 ,将大大增加肝源的范围 ,可是脂肪肝
较健康的肝脏对缺血缺氧的耐受力明显降低 ,直接影
响移植效果 [ 7] 。面对现行的种种缺陷及矛盾 ,如何应
用新方法和新途径 , “快速 、有效 、安全 ”地诱导供肝保
护性基因上调 ,使其在缺血期早期就拥有自我保护能
力 ,一直以来都是研究的重点和难点 ,也是我们此次研
究的目的。
在病理结果中我们可以看到 ,空白对照组(LR组)
肝细胞水肿明显 ,以至小叶结构也有所变化。而实验
组(NH组),在没有添加胶体成分的情况下 ,肝细胞浊
肿程度及范围都减轻 ,小叶结构基本完整 , Banf评分
也得到同样的结果 ,提示 Nodosin在不改变灌注液黏度
的情况下 ,能有效减轻供肝冷缺血期的肝细胞水肿。
SOD是细胞内氧自由基清除剂 ,是肝脏细胞缺血
期主要的抗氧化物酶 , 代表了细胞抗氧化能力 [ 8] 。
MDA是氧自由基与细胞膜成分发生脂质过氧化反应
的产物 ,代表了细胞氧化损伤的程度。肝脏缺血时 ,线
粒体内呼吸链受阻 ,氧被还原成活性氧 ,其产物为超氧
阴离子自由基 O-2 、氢过氧化自由基 HOO-以及羟自由
基 OH-。肝脏是全身最富含黄嘌呤氧化酶的器官 ,缺
血时该酶在分子氧作用下产生大量自由基 ,并与细胞
膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应造成细胞
膜 、膜上磷脂 、蛋白质及酶活性发生改变 ,最终导致细
胞和结构功能的损害。在结果中我们可看到 ,虽然将
肝脏进行了冷保存 ,但随着冷存时间的延长 ,各组 SOD
酶活性在不断降低 ,而 MDA含量也在不断增加 ,提示
肝脏组织抗氧化能力正在减弱 ,冷保存缺血过程中生
成的自由氧基在损伤肝细胞。虽然 ,冷缺血期的部分
损伤是可逆的 ,但对于脂肪肝这样的供肝 ,因其肝细胞
内脂质成分过高 ,在缺血状态下产生出更多的氧自由
基 ,也更易受到氧自由基损伤 ,这样的损伤很可能对移
植后的功能产生影响。因此 ,在肝脏缺血期早期就快
速地提高肝脏自我保护能力 ,对移植后移植物的功能
维护是相当重要的。本次实验中 ,各时间点的肝脏组
织 SOD酶活性和 MDA含量的测定 ,提示通过保留灌
注中药有效成分 Nodosin对减轻供脏在缺血期的损伤
是有效的。
溪黄草(IsodonSera)系唇形科香茶菜属植物的全
草 ,具有清热利湿 、凉血散瘀之功 ,可用于治疗急性肝
炎。对溪黄草中有效成分 Nodosin的研究表明 ,细胞增
殖的毒理学实验测定提示其用药安全性良好 [ 3] ,并且
发现 Nodosin灌注能有效地上调肝脏组织的 HO-1的
表达 [ 9] ,而血红素加氧酶 -1(HO-1)就是最有效的 、
研究最多的保护性基因之一 ,在移植过程中 ,供体组织
中 HO-1表达上调 ,能发挥减少氧自由基对移植物的
损伤 、防止过度炎性反应和抑制移植组织细胞凋亡等
作用 [ 4] ,来保护移植物功能。已有研究报道 ,通过上调
供肝 HO-1表达 ,能有效保护脂肪肝在肝移植中的功
能 [ 4] 。在此次实验中 ,我们测定了各组肝脏组织中 HO
-1酶活性。结果提示随着灌注药物 Nodosin浓度的
增加 ,肝脏组织中 HO-1酶活性也逐步提高 ,这与同
组肝脏组织的 SOD活性变化趋势一致 ,与 MDA含量
变化趋势相反。并且结合阳性对照组(Co组)和阴性
对照组(Zn组 )也能有效地上调和抑制 HO-1酶活
性 ,其 MDA含量 、SOD活性和 Banf评分变化趋势与实
验组(NH组)基本一致。因此 ,我们认为 Nodosin可能
是通过保护性基因来上调 HO-1酶活性提高供肝在
缺血期的抗氧化作用。在本实验中 ,组内比较提示 NM
组和 NH组保留灌注 1 h时 , HO-1酶活性就明显提高 ,
并达到高峰 ,这也基本符合保护供肝快速有效的要求。
综上所述 ,本次试验中我们将溪黄草有效成分
Nodosin灌注大鼠肝脏对肝脏移植缺血期的保护作用
进行了初步的探索 ,其结果显示 Nodosin能减轻细胞水
肿 ,提高肝脏缺血期的 SOD酶活性 ,并减少 MDA的生
成 ,从而减轻了肝脏在缺血期的损伤 ,其作用机制可能
是通过诱导供肝自身的保护性基因上调 ,增强了供肝
自身抗氧化能力 ,维护了供肝的功能。保留灌注 Nodo-
sin避免了现在供肝保存方法一些缺陷 ,同时体现了一
定的效果 ,因此可以考虑与现行的方法结合 ,最大限度
地取长补短 ,我们也将对此进一步地探索研究。
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对肝脏组织血红素加氧酶 -1的表达的影响 [ J].华东理工大
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(收稿日期:2009-06-18　编辑:张素文)
　＊广东省自然科学基金资助项目(编号:06024396)
塞来昔布对人舌鳞癌 Tca8113细胞 survivin表达
与诱导细胞凋亡的作用＊
李伟忠 1 , 王晓燕 2 , 霍秋菊1
南方医科大学南方医院 1口腔科 , 2病理科 (广州 510515)
　　【摘要】　目的　观察环氧化酶 -2抑制剂塞来昔布对人舌鳞癌 Tca8113细胞 COX-2、survivin表达的影响及
诱导细胞凋亡的作用 。方法　塞来昔布作用 Tca8113细胞后 , 采用流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率 , 半定
量 RT-PCR法 、WesternBlot法检测 COX-2、survivinmRNA及其蛋白表达变化。结果　塞来昔布以剂量依赖方
式抑制细胞周期进程的同时 ,其诱导细胞凋亡的作用也明显增强 , 塞来昔布下调 survivinmRNA及其蛋白表达的
同时抑制 COX-2蛋白的表达 ,但对 COX-2 mRNA表达的抑制作用较弱。结论　COX-2抑制剂塞来昔布下调
survivin表达的作用可能与抑制肿瘤细胞生长 、诱导细胞凋亡作用有关 , 其机制有待进一步研究。
【关键词】　环氧化酶 -2;塞来昔布;癌 ,鳞状细胞;基因表达;细胞凋亡
　　由于非甾体类抗炎药物(non-steroidalantinflam-
matorydrugs, NSAIDs)在预防肠道肿瘤中的潜在作用 ,
其在不同类型恶性肿瘤防治中的作用机制一直是研究
的热点。目前认为其主要与抑制环氧化酶(cyclooxyge-
nase, COX)的作用有关。 COX是催化前列腺素合成过
程中的重要限速酶 [ 1] , 传统的非甾体类抗炎药物
(NSAIDs)如氟布洛芬 、吲哚美辛及舒林酸等可以同时
抑制 COX-1和 COX-2,而新一代的 NSAIDs如塞来
昔布 、伐地考昔和伐地考昔等 ,主要抑制 COX-2酶的
活性 ,由于这些药物对 COX-2酶的高选择性的抑制
作用 ,与传统 NSAIDs相比 ,产生很好的治疗效果且不
良反应少 [ 2-4] 。我们前一部分研究证实 ,选择性 COX
-2抑制剂塞来昔布以剂量依赖方式抑制人舌鳞癌细
胞 Tca8113增殖 ,这种作用与抑制前列腺素释放及
COX-2、VEGF-CmRNA的表达有关 [ 5] 。本研究 ,我
们观察了塞来昔布对人舌鳞癌 Tca8113细胞生存素
(survivin)蛋白及 mRNA的表达及与抑制细胞生长 、诱
导细胞凋亡之间的关系。
1　材料与方法
1.1　细胞系和主要试剂 　人舌鳞癌 Tca8113细胞 ,上
海交通大学第九人民医院口腔医学院建株 ,南方医科
大学南方医院口腔科实验室保存。将 Tca8113细胞置
于含有 10%胎牛血清的低糖 DMEM培养液 , 37℃,饱
和湿度 , 含 5%CO2 和 95%空气的恒温箱中培养 ,
0.25%胰蛋白酶消化传代。塞来昔布 (相对分子质量
381.38,辉瑞大连公司)用低糖 DMEM培养液稀释备
用 , Trizol试剂盒(Invitrogen公司), RT-PCR成套试剂
盒(TaKaRa公司), COX-2鼠抗人单克隆抗体及 Sur-
vivin兔抗人多克隆抗体及小牛血清 (北京中杉公司),
survivin、COX-2和 β -actin引物由上海生工生物工
程公司合成。
1.2　流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率 　调整
·543·广东医学　 2010年 3月 第 31卷第 5期　 GuangdongMedicalJournal　Mar.2010, Vol.31, No.5