全 文 ：第 42 卷第 4 期 华中师范大学学报(自然科学版) Vo l.42 No.4
2008年 12 月 JOURNAL OF HUAZHONG NORMAL UNIVERSITY(Nat.Sci.) Dec.2008
收稿日期:2008-09-10.
基金项目:湖北省自然科学基金项目(2007ABA240);华中师范大学开放性实验项目.
＊通讯联系人.E-mail:luxqw@yahoo.com.cn.
文章编号:1000-1190(2008)04-0620-04
粗梗水蕨孢子无菌繁殖的研究
孙　锐 , 邓子厚 , 刘胜祥 , 李学宝 , 崔　鸿 , 李　娟＊
(华中师范大学 生命科学学院 , 武汉 430079)
摘　要:观察了在 MS 培养基中粗梗水蕨(Ceratopteris pteridoides)孢子萌发和配子体发育的过
程 ,探究了不同无机盐浓度对粗梗水蕨发育过程的影响.结果表明:粗梗水蕨孢子在 MS 全培养基
中萌发率最高 ,可达 60.5%;3/ 4MS培养基中配子体成苗率最高 ,可达 74.5%;试管苗移栽成活率
达到 80%以上.由此提供了孢子无菌繁殖粗梗水蕨的方法.
关键词:粗梗水蕨;孢子;无菌繁殖
中图分类号:Q945.51 文献标识码:A
　　水蕨属(Ceratopteris)是水蕨科(Ceratopteri-
daceae)唯一的 1 个属 , 在我国分布有水蕨(C.
thalicroides)和粗梗水蕨(C.pteridoides)2 个
种[ 1] .粗梗水蕨常成片漂浮于湖沼 、池塘中 ,由于其
分布的生境日益受到严重的破坏 ,成小斑块状零星
分布 ,1999年国务院批准为国家 Ⅱ级重点保护植
物[ 2] .目前 ,对粗梗水蕨的研究尚少 ,陶玲等人研究
了除草剂二氯喹啉酸及苄嘧磺隆对粗梗水蕨配子
体生长和性器官分化的影响[ 3-4] ,但尚未见人工繁
殖粗梗水蕨方法的报道.而在蕨类植物中大多采用
MS 作为基本培养基进行无菌培养 ,培养基中无机
盐的浓度很重要 ,它对于蕨类的组培效率及试管苗
的正常发育均有影响[ 5] .本文研究了不同无机盐浓
度 MS 培养基中粗梗水蕨孢子萌发 、配子体发育的
过程 ,探究了不同无机盐浓度对粗梗水蕨发育过程
的影响 ,提供了无菌繁殖粗梗水蕨的方法.
1 材料与方法
1.1 孢子的采集
粗梗水蕨的孢子采自咸宁市咸安区官埠镇泉
湖村斧头湖.将具有成熟孢子的叶片自植物体上剪
下 ,放入洁净 、密封的纸袋中 ,置于通风干燥处 ,5 ～
7 d 后孢子自然散落 ,收集于硫酸纸袋中保存 ,及
时接种或播种 ,剩余孢子置 4℃冰箱中保存 ,供重
复培养使用.
1.2 孢子的消毒
取 30 mg 成熟孢子置于 1.5 mL离心管内 ,加
入 5% NaOCl 溶液约 1.5 mL 处理 2 ～ 3 min ,
8 000 r/min离心 4 min ,无菌水漂洗 4 ～ 5次 ,最后
再加入 1.5 mL 无菌水得无菌孢子悬浊液 ,以上操
作均在超净工作台上完成.
1.3 孢子的繁殖及实验观察
以 MS 、3/4M S 、1/2M S 、1/5M S 、1/10M S 、重
蒸馏水为培养基(含 MS全量 Fe 盐及有机成分 ,仅
改变大量元素及微量元素的配比[ 6] ),蔗糖浓度
3%,琼脂浓度 0.8%, pH5.6.灭菌后立即分装至
直径为 6 cm 的培养皿中 ,待冷却后 ,用微量移液器
将无菌孢子悬浊液接种在培养基上(每个培养皿中
接 80 μL),用少量水打匀 ,每种培养基平行处理
6个培养皿 , 培养皿用封口膜封口 , 于 LEICA
MZ7.5体式显微镜下测孢子接种密度(图 1-1),测
得孢子接种密度约为 43个/cm2 .暗处理 24 h促使
同步萌发后[ 7] ,移至光下培养 ,光照强度 2 000 ～
2 300 lx ,光照时间 12 h/d ,培养室温度 25±1℃,
湿度约为 60%～ 70%.
从接种后第 2天开始 ,用 LEICA MZ7.5体式
显微镜定期观察并拍摄孢子萌发及配子体的形态
发育过程直至形成幼孢子体 ,用 Nikon Eclipse 801
光学显微镜观察并拍摄细微结构.接种 10 d 后 ,显
微镜下观察各个培养基固定数目的孢子 ,以确定孢
子萌发率[ 8] .记录不同培养基中孢子萌发的时间 、
原叶体形成的时间 、第 1株幼孢子体苗出现的时
间.待形成幼孢子体时 , 转接至锥形瓶(容积为
100 mL)中培养 ,培养基及培养条件不变.
　第 4期 孙　锐等:粗梗水蕨孢子无菌繁殖的研究 621　
2 结果与分析
2.1 粗梗水蕨孢子萌发 、配子体发育过程
粗梗水蕨成熟孢子(图 1-2)为四面体形 ,三裂
缝 ,外壁具肋条状纹饰.孢子萌发后 ,逐渐发育形成
丝状体 、片状体和原叶体.孢子萌发后原叶体原始
细胞分裂形成丝状体(图 1-3),接种 8 ～ 9 d后形成
匙形片状体(图 1-4).接种后 12 d左右形成楔形原
叶体(图 1-5),性别分化后形成雌雄同体原叶体或
雄性原叶体 ,精子器(图 1-6)突出于原叶体后半部
及混生于假根丛中 ,颈卵器(图 1-7)位于原叶体生
长点之下.原叶体成熟后不规则边缘上卷 ,呈蝴蝶
结状(图 1-8).受精后形成幼胚(图 1-9).接种后 30
d左右可观察到幼胚形成的幼孢子体(图 1-10).转
接至锥形瓶(容积为 100 mL)中培养后能形成较
大的试管苗(图 1-11).
2.2 孢子无菌培养
2.2.1 无机盐浓度对孢子萌发的影响　粗梗水蕨
孢子萌发以假根的出现为标志[ 9] ,从表 1可以看出 ,
1/5MS培养基中孢子萌发开始最早 ,接种 5 d后开
始萌发 ,不同无机盐浓度 MS 培养基中孢子开始萌
发的天数不同 ,但差异不显著.从表 2可以看出 , MS
完全培养基的后期萌发量显著高于其他处理.以接
种 10 d后显微镜下统计的不同处理中孢子萌发量
来计算孢子萌发率 ,从表1可以看出 ,接种在 MS完
全培养基中孢子萌发率最高 ,可达 60.5%.
表 1　粗梗水蕨孢子在不同培养基中的萌发与发育状况
Tab.1　The ge rmination and development o f spo res in various culture media
培养基 萌发时间/ d 萌发率/ % 原叶体形成时间/ d 幼孢子体苗出现时间/d 配子体发育成孢子体的百分率/ %
MS 7 60.5±5.2 a 12 28 48.3±6.5 b
3/ 4MS 7 46.5±4.0 b 11 28 74.5±9.3 a
1/ 2MS 6 43.9±4.7 bc 11 30 20.4±8.3 c
1/ 5MS 5 43.2±3.1 bcd 10 35 5.7±5.5 d
1/ 10MS 7 39.1±3.7 cd 12 35 5.0±3.2 d
重蒸水 7 36.6±8.9 d 14 - -
　　注:时间存在随机抽样误差 ,绝对误差≤1d;同列数据后不同小写字母表示差异显著(LSD 多重比较 , P<0.05).
表 2　粗梗水蕨孢子在不同培养基中孢子萌发量
Tab.2　The germina tion number o f
spor es in various culture media
时间/ d 孢子萌发量/个
M S 3/ 4MS 1/ 2MS 1/ 5MS 1/ 10MS 重蒸水
6 0c 0c 4b 10a 0c 0c
10 78a 60b 57bc 55bcd 50cd 47d
14 83a 61b 60bc 55bcd 52cd 48d
18 86a 62b 60bc 58bc 54bc 51c
　　注:统计的孢子萌发量为 LEICA MZ7.5 ×10下 ,视野面积
约为 3 cm2 ;同行数据后不同小写字母表示差异显著(LSD 多重
比较 , P<0.05)
2.2.2 无机盐浓度对配子体发育及成苗的影响　
从表 1可以看出 ,1/5M S 培养基中原叶体形成的
最早 ,在接种 10 d后开始形成;重蒸馏水中由于缺
乏无机盐离子 , 原叶体形成晚且发育畸形.
3/4M S配子体发育的速度最快 ,从孢子萌发到形
成原叶体只需 4 d ,但不同无机盐浓度 MS 培养基
对配子体发育速度的影响不显著.
不同无机盐浓度 MS 培养基对原叶体的生长
有很大影响.在接 种 18 d时 可观察到:MS ,
3/4MS ,1/2MS 培养基中原叶体发育良好 ,能形成
面积较大的原叶体;1/5M S 培养基中形成的原叶
体面积较小;1/10MS 原叶体发育不良 ,形成的原
叶体面积小;双蒸水中原叶体不能生长.
表 3　粗梗水蕨在不同培养基中孢子体量
Tab.3　The number of spo rophy tes in various culture media
时间/ d 孢子体量/个
MS 3/ 4MS 1/ 2MS 1/ 5MS 1/ 10MS
30 3b 6a 2b 0c 0c
35 15b 20a 4 c 1c 1c
40 32a 37a 6b 1b 3b
45 42a 46a 12b 3c 3c
　　注:同行数据后不同小写字母表示差异显著(LSD 多重比较 ,
P<0.05).
从表 3可以看出 ,无机盐浓度较高时有利于配
子体受精形成孢子体 , 3/4M S 培养基的成孢子体
量在初期及后期显著高于其他处理.从表 1可以看
出 , 3/4M S培养基中配子体发育成孢子体的百分
率最高 ,可达 74.5%;部分 MS 完全培养基由于出
现大量营养繁殖现象 ,成孢子体的百分率次之 ,可达
48.3%;1/2MS , 1/5MS , 1/10 MS 培养基中部分配
子体在培养过程中未产生孢子体就出现不同程度的
622　 华中师范大学学报(自然科学版) 　　第 42 卷
死亡 ,成孢子体的百分率低;含盐量最低的重蒸馏水
中 ,配子体完全死亡 ,不能受精形成孢子体.
2.2.3 试管苗的移栽　待幼孢子体长成稍大植株
时 ,将三角瓶瓶盖打开炼苗.用镊子轻夹出试管苗 ,
洗净培养基 ,移栽至栽培基质(草炭土∶蛭石∶素
砂∶有机肥=4∶2∶2∶1)中 ,室内栽培 ,保持适宜
的光照 、空气湿度及基质温度 ,移栽成活率达 80%
以上(图 1-12).
图 1　粗梗水蕨(C.pteridoi des)发育照片
Fig.1　Stage s o f the development o f Ceratopterv s p teridoides
　　1.不同视野下的孢子数(×50).2.粗梗水蕨成熟孢子(×400).3.丝状体(×100).4.片状体(×100).5.原叶体
(×100).6.精子器(×400).7.颈卵器(×400).8.成熟原叶体(×50).9.幼胚(×100).10.幼孢子体(×50).11.试管
苗.12.栽培基质中生长的粗梗水蕨.13.MS 培养基中出现的配子体营养繁殖现象.14.3/4MS 培养基中正常形成的
孢子体.15.幼孢子体在 MS 培养基中出现的营养繁殖.
图中 1、8、10 观测结果为 LEICAMZ 7.5 体式显微镜(×50)下 ,视野直径为 4.2 mm.图中2 、3 、4 、5 、6 、7、9 为 Ni-
kon Eclipse 801显微镜下观测结果.
3 讨论
3.1 无机盐浓度对孢子萌发的影响
粗梗水蕨的孢子在不同无机盐浓度 MS 培养
基上都能萌发 ,这与 M iller(1986)报道的从蒸馏水
到复杂的营养液都适于孢子萌发的研究结果一致.
不同无机盐浓度对粗梗水蕨孢子开始萌发的时间
影响不显著 ,各种 MS培养基中的孢子在 7 d时都
可以开始萌发与陶玲等报道的结果[ 3-4] 基本一致.
MS 完全培养基接种的孢子萌发率最高 ,与徐
艳等报道的无机盐浓度较高时抑制白玉凤尾蕨孢子
萌发[ 10] 及 Khoo 等报道的无机盐浓度较高时抑制
Adiantum raddianum`Tassel 孢子萌发[ 11] 的结果相
反 ,但与翟国燕等报道的 MS 全培养基对提高孢子
萌发率效果最好[ 6] 的结果一致.我们认为这种差异
是由于研究材料的种属不同造成的.在 MS 培养基
中粗梗水蕨孢子萌发率普遍低于陶玲等[ 3-4] 研究的
除草剂二氯喹啉酸及苄嘧磺隆对粗梗水蕨配子体生
长和性器官分化的影响对照组中的粗梗水蕨孢子萌
发率 ,这可能是由于 Knop s培养基更适合培养粗梗
　第 4期 孙　锐等:粗梗水蕨孢子无菌繁殖的研究 623　
水蕨或是测定孢子萌发率的方法不同引起的.
3.2 无机盐浓度对配子体生长发育及成苗的影响
不同无机盐浓度 MS 培养基对配子体发育速
度的影响不显著 ,而对原叶体的生长有很大影响 ,
无机盐浓度高时形成的原叶体面积较大 ,双蒸水中
原叶体不能生长 ,最后死亡.
无机盐浓度较高时有利于配子体受精形成孢
子体 ,但过高的无机盐浓度会由于产生大量的营养
繁殖现象而降低配子体受精率.实验发现 MS 完全
培养基中配子体易出现营养繁殖现象(图 1-13 ,
1-14),与张开梅 、石雷报道的结果[ 12] 一致 ,这种现
象产生的原因与 MS 培养基中比较丰富的营养有
关.另外 ,实验中还发现在 MS 培养基培养的幼孢
子体同样存在营养繁殖的现象 ,在叶片的边缘会分
化出新的假根和小叶 ,形成新的植株 ,且不脱离母
体(图 1-15).
本研究完成了对粗梗水蕨生活史全过程的观察 ,
通过无菌培养技术建立了人工繁殖粗梗水蕨的方法 ,
为粗梗水蕨的理论研究和科学保护提供了参考.
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Studies on the spore sterile culture of Ceratopteris pteridoides
SUN Rui , DENG Zihou , LIU Shengx iang , LI Xuebao , CUI Hong , LI Juan
(College o f Life Science , Huazhong No rmal Univer sity , Wuhan 430079)
Abstract:The ef fect of dif ferent M S medium radios treatments on the format ion of g a-
metophy te and sporophyte in Ceratopteris pteridoides was invest igated in present stud-
y.The result show ed that the maximum ge rm inat ion rate w as obtained in M S medium ,
which reached 60.5%;the highest rate of g ametophy te to sporophy te w as achieved in 3/
4 MS medium , which reached 67.7%;the transplant survival rate o f spo rophy te reached
above 80%.The research offered the method of the spo re steri le culture of Ceratopteris
pteridoides.
Key words:Ceratopteris p teridoides ;spore;steri le culture