全 文 ：2011;31(8) 南方医科大学学报（J South Med Univ）
·基础研究·
半边旗提取物5F对人胃癌细胞凋亡的影响及其机制
陈建发 1，陈引香 1，李 萍 1，傅明 1，吕应年 2，李 立 2
1解放军第 422中心医院普外科，广东 湛江 524009；2广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室，广东
湛江 524023
摘要：目的 探讨草药半边旗提取物Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid（5F）对人胃癌SGC7901细胞凋亡的影
响及其机制。方法 通过生存及细胞凋亡分析检测5F对SGC7901增殖的抑制效果。同时，采用免疫印迹法评价5F对
SGC7901细胞Bcl-2及Bax表达的影响。结果 MTT分析证实了 5F呈剂量依赖、时间依赖方式抑制SGC7901增殖。
Annexin V-EGFP染色及caspase-3活化则确认了5F诱导的细胞凋亡。并且，该凋亡伴随着Bcl-2表达的降低、Bax表达的
提高。结论 5F通过激活细胞凋亡线粒体途径诱导SGC7901细胞凋亡。
关键词：半边旗；胃癌；细胞凋亡
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1673-4254（2011）08-1345-04
Effect of Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid on human gastric cancer cells
and its mechanism
CHEN Jian-fa1, CHEN Yin-xiang1, LI Ping1, FU Ming1, LÜ Ying-nian2, LI Li2
1Department of General Surgery, 422 Hospital of PLA, Zhanjiang 524009, China; 2Guangdong Key Laboratory for Research and
Development of Natural Drugs, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China
Abstract: Objective To investigate the apoptosis-inducing effect of Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid
(5F), a compound isolated from Pteris semipinnata L (PsL), on human gastric cancer SGC7901 cells and explore its
mechanism. Methods The inhibitory effect of 5F on SGC7901 cells was observed by MTT assay and flow cytometry,
and the changes of the expression of Bcl-2 and Bax in SGC7901 cells following 5F exposure were evaluated by Western
blot analysis. Results 5F inhibited the proliferation of SGC7901 cells in a concentration- and time-dependent manner,
and the cell apoptosis induced by 5F was confirmed by Annexin V-EGFP staining and caspase-3 activation assay. The
cell apoptosis induced by 5F was associated with decreased Bcl-2 and increased Bax expressions. Conclusion 5F
exposure induces apoptosis in SGC7901 cells by activating mitochondrial apoptotic pathways.
Key words: pteris semipinnata L; gastric cancer; apoptosis
目前对胃癌的系统治疗由于毒副作用而常常具有
局限性［1-2］。因此，寻找高效、低毒的抗肿瘤药物极具现
实意义。天然产物作为抗癌药物已愈来愈受到重视，其
中，植物产物被广泛用于药物筛选则是缘于其巨大的药
用价值及低毒性［3-4］。
半边旗属凤尾蕨科植物，广泛分布于中国南方各
省，作为中草药曾用于肝炎、肠炎及毒蛇咬伤等疾病治
疗。研究发现，由半边旗提取的二萜类化合物5F可抑
制多种肿瘤细胞的增殖且毒副作用轻微［5-9］。先前的研
究显示5F可抑制胃癌MKN-45、MKN-细胞增殖，并且
该抑制效果与胃癌细胞株p53状态有关［6］。在本研究
中，作者首次采用了胃癌SGC7901细胞株，以期进一步
确定5F对胃癌细胞的杀灭效果，并探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 人胃癌SGC7901细胞株购于中科院上
海细胞生物学研究所。
1.1.2 药品 半边旗提取物5F干粉由广东医学院广东
天然药物研究与开发重点实验室吕应年老师提供，经丙
二醇溶解，蒸馏水稀释，制成丙二醇体积分数为0.15、5F
质量浓度为1000 mg/L的储备液，除菌过滤后冷藏保
存，实验时再以培养基稀释至所需浓度(丙二醇最终浓
度≤0.012)。
1.1.3 试剂及抗体 单克隆抗体Bcl-2、Bax、β-actin及辣
根过氧化物酶标记二抗（Santa）；RPMI 1640培养基干
收稿日期：2011-04-12
基金项目：国家自然科学基金（3987099）
Supported by National Natural Science Foundation of China(3987099).
作者简介：陈建发，硕士，副主任医师，电话：0759-3565422-65049，E-mail:
chenjf623@163.com
··1345
南方医科大学学报（J South Med Univ） 第31卷
粉（Sigma）；新生牛血清（Hyclone）；青霉素及链霉素；胰
蛋白酶（Amresco）；丙二醇；二甲基亚砜DMSO；MTT
（Sigma）。
1.1.4 主要仪器 医用净化工作台（苏州净化设备公司）；
CO2 恒 温 培 养 箱（Shellab）；ELx800 酶 标 仪
（BIO-TEK）；普通光学倒置显微镜（Nikon）；荧光显微镜
及成像系统（Leica）；垂直电泳仪（Bio-rad）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人胃癌SGC7901细胞株于含10%新
生牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RMPI
1640培养液内，在37 ℃、含5% CO2的饱和湿度空气中
培养。
1.2.2 MTT法检测肿瘤细胞存活率 取对数生长期的
SGC7901细胞用于实验，以0.25%胰酶剥离细胞，细胞
计数后以培养液调整细胞浓度，接种细胞于96孔培养
板，确定每孔含细胞2000个。细胞贴壁后换液，各实验
组添加5F并使其终浓度分别为5、10、20、40、80 mg/L，
阴性对照组则加相同体积培养液。实验组每个剂量设8
个平行孔，阴性对照组同样设8孔。经24、48、72 h培养
后，加MTT染液（MTT终浓度为0.5 mg/ml）并继续培养
4 h，弃上清，每孔加DMSO 100 μl，震荡5 min后以酶标
仪检测波长570 nm处吸光度，计算肿瘤细胞存活率。
1.2.3 Annexin V-EGFP检测细胞凋亡 接种细胞于盖
玻片，细胞贴壁后以不同浓度 5F（0~80 mg/L）处理
24 h。弃培养液，PBS洗涤。采用Annexin V-EGFP细
胞凋亡检测试剂盒（凯基公司）观察5F对胃癌细胞凋亡
发生的影响，具体方法按试剂盒所附操作指南进行。
1.2.4 分光光度法检测caspase-3活性 接种细胞于盖玻
片，细胞贴壁后以不同浓度5F（0~80 mg/L）处理24 h。
弃培养液，PBS洗涤。采用caspase-3分光光度法检测
试剂盒（凯基公司）分析5F对胃癌细胞caspase-3活性的
影响，具体方法按试剂盒所附操作指南进行。以酶标仪
在405 nm处测定吸光值，通过计算OD5F处理组/OD空
白对照组的倍数来确定5F处理组caspase-3活性。
1.2.5 Western blot检测Bcl-2及Bax表达 接种细胞于
6孔细胞培养板，细胞贴壁后以0、20、40、80 mg/L 5F处
理，处理24 h后收集细胞。采用细胞全蛋白抽提试剂盒
（凯基公司）提取细胞全蛋白，采用BCA蛋白定量试剂
盒（凯基公司）测定所提蛋白浓度。SDS-PAGE电泳，转
膜；封闭1 h后加一抗（Bcl-2或Bax或β-actin），4 ℃孵育
过夜；洗膜后加二抗，室温孵育1 h；洗膜、曝光显影，采
用Quantity One软件分析目标蛋白表达水平。
1.2.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件系统单因素方
差分析对实验数据进行统计学处理，P<0.05认为差异
有统计学意义。
2 结果
2.1 5F抑制SGC7901细胞增殖活性
MTT实验结果显示5F可强烈抑制SGC7901细胞
增殖，并且其细胞毒作用具有剂量、时间依赖性（图1）。
2.2 5F诱导肿瘤细胞发生凋亡
在正常细胞，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜
脂质双层内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中PS由脂膜
内侧翻向外侧。Annexin V是一种相对分子质量为35~
36 000的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和
力，故可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞
膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的
灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP）标
记，并以标记了的Annexin V作为荧光探针，检测细胞
凋亡的发生。在本研究中，在荧光显微镜下可见经5F
处理的SGC7901细胞可发出明亮绿色荧光，显示有早
期凋亡发生（图2）。
2.3 5F对SGC7901细胞caspase-3活性的影响
与对照比较，5F处理组肿瘤细胞caspase-3活性随
5F处理剂量的增加而提高（P<0.05，图3）。
2.4 5F对SGC7901细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响
与对照比较，5F处理组肿瘤细胞Bcl-2蛋白表达水
平随5F处理剂量的增加而下降（P<0.05），而Bax蛋白
表达则随5F剂量的增加而提高（P<0.05，图4~6）。
3 讨论
在本研究中，MTT结果表明5F可强烈抑制胃癌
SGC7901细胞增殖，并呈剂量、时间依赖关系，提示5F
具有较强的抗癌活性。细胞凋亡是去除不需要的或有
害的细胞，在胎儿发育及成人组织恒常性的维持过程中
发挥重要作用。细胞增殖与细胞凋亡之间存在的平衡
一旦瓦解，细胞增殖则失控，进而导致癌症发生［10-11］。反
图1 5F对SGC7901增殖的抑制效果呈剂量、时间依赖性
Fig.1 Concentration- and time-dependent inhibition of 5F
on the proliferation of SGC7901 cells.
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
C
on
tr
ol
ce
ll
vi
ab
il
it
y
(%
)
24 h
48 h
72 h
0 5 10 20 40 80
5F(mg/L)
··1346
陈建发,等.半边旗提取物5F对人胃癌细胞凋亡的影响及其机制第8期
过来，通过细胞凋亡杀灭癌细胞则被认为是治疗癌症的
最佳策略，而癌细胞凋亡也因此成为所有抗癌治疗方法
的聚焦点［12-13］。在本研究中，Annexin V-EGFP分析证实
图2 Annexin V-EGFP染色检测 5F诱导SGC7901发生细胞凋亡
Fig.2 Apoptosis induced by 5F detected by Annexin V-EGFP staining(×200). A: Control (5F 0 mg/L); B: 5F (5 mg/L); C: 5F (10 mg/L);
D: 5F (20 mg/L); E: 5F (40 mg/)L; F: (5F 80 mg/L).
A B C
D E F
图3 5F处理促进SGC7901细胞caspase-3活性
与空白对照相比较：*P<0.05
Fig.3 5F-induced activation of caspase-3 in SGC7901 cells.
2
1.5
1
0.5
0
C
as
pa
se
-3
ac
ti
vi
ty
(r
el
at
iv
e
to
co
nt
ro
l)
0 5 10 20 40 80
5F (mg/L)
**
*
*
图4 5F对SGC7901细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响
Fig.4 Effect of 5F on the expression of Bcl-2 and Bax protein in
SGC7901 cells.
Bcl-2 (26 000)
Bax (23 000)
β-actin (43 000)
0 20 40 80 mg/L 5F
图5 5F对SGC7901细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响
与空白对照相比较：*P<0.05
Fig.5 Effect of 5F on the expression of Bcl-2 protein in
SGC7901 cells.
0 20 40 80
5F (mg/L)
B
cl
-2
/β-
ac
ti
n
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
*
*
图6 5F对SGC7901细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响
与空白对照相比较：*P<0.05
Fig.6 Effect of 5F on the expression of Bax protein in SGC7901
cell.
0 20 40 80
5F (mg/L)
B
cl
-2
/β-
ac
ti
n
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
* *
*
··1347
南方医科大学学报（J South Med Univ） 第31卷
5F可有效地诱导SGC7901细胞发生凋亡，该结果与先
前5F诱导其他癌细胞株发生凋亡的研究结果相类似，
提示5F通过诱导癌细胞凋亡从而实现其细胞毒作用。
Caspase是一类属于半胱氨酸家族的酶，可特异性
地切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键，在细胞凋亡过程
中发挥了关键作用［14］，其中，caspase-3则在细胞凋亡过
程中扮演了一个执行者的角色［15］。在本研究中，作者发
现5F处理可促进caspase-3活性，提示caspase-3活化参
与了5F所诱导的胃癌细胞凋亡。
为了进一步阐明5F诱导癌细胞发生凋亡的可能机
制，作者检测了调控线粒体外膜通透性的Bcl-2家族蛋
白(包括Bcl-2、Bax等)的表达情况。Bcl-2家族蛋白在
线粒体途径所介导的细胞凋亡过程中发挥了重要作
用。Bcl-2为抗细胞凋亡蛋白，在临床中常常用作癌症
预后的生物标记物［16］，而Bcl-2过表达则与细胞毒药物
的耐药有关［17-18］。在本研究中，5F处理可抑制抗凋亡蛋
白Bcl-2表达水平，并且该表达下调伴随促凋亡蛋白
Bax表达的上调。Bax为线粒体介导的细胞凋亡所必
须，Bax插入线粒体膜可导致cytochrome c释放至胞浆
并激活caspase，并导致细胞凋亡发生［19-20］。在许多癌症
中，Bax高表达往往与较佳的生存预后有关。在本研究
中，5F诱导的细胞凋亡与细胞凋亡线粒体途径Bcl-2家
族成员的表达变化关系密切。并且，作者在这里首次发
现5F具有改变胃癌SGC7901细胞Bcl-2/Bax比值的能
力，而该比值的变化则应该是启动细胞凋亡程序的关键
因素。
综上所述，Bax表达上调、Bcl-2表达下调以及
caspase-3活化提示5F通过线粒体途径促进体外培养的
胃癌细胞发生凋亡。目前的研究均为体外研究，尚需通
过体内实验确定5F对胃癌的治疗效果以及是否会对正
常组织产生不利的影响。
参考文献：
［1］ Palesty JA, Wang W, Javle MM, et al. Side effects of therapy:case 3.
gastric cancer after radiotherapy of pediatric hodgkins disease［J］. J
Clin Oncol, 2004, 22(12): 2507-9.
［2］ Yu G, Ren D, Sun G, et al. Clinical and experimental studies of
JPYS in reducing side-effects of chemotherapy in late-stage gastric
cancer［J］. J Tradit Chin Med, 1993, 13(1): 31-7.
［3］ Hata K, Ishikawa K, Hori K, et al. Differentiation-inducing activity
of lupeol, a lupane-type triterpene from chinese dandelion root
(hokouei-kon), on a mouse melanoma cell line［J］. Biol Pharm Bull,
2000, 23(8): 962-7.
［4］ Newman DJ, Cragg GM, Snader KM. The influence of natural
products upon drug discovery［J］. Nat Prod Rep, 2000, 17(3):
215-34.
［5］ Chen GG, Liang NC, Lee JF, et al. Over-expression of Bcl-2
against pteris semipinnata L-induced apoptosis of human colon
cancer cells via a NF-kappa B-related pathway［J］. Apoptosis, 2004,
9(5): 619-27.
［6］ Liu Z, Ng EK, Liang NC, et al. Cell death induced by pteris
semipinnata L.is associated with p53 and oxidant stress in gastric
cancer cells［J］. FEBS Lett, 2005, 579(6): 1477-87.
［7］ Liu ZM, Chen GG, Vlantis AC, et al. Cell death induced by
ent-11alpha-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid in anaplastic
thyroid carcinoma cells is via a mitochondrial-mediated pathway
［J］. Apoptosis, 2005, 10(6): 1345-56.
［8］ Vlantis AC, Lo CS, Chen GG, et al. Induction of laryngeal cancer
cell death by Ent-11-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic acid［J］.
Head Neck, 2010, 32(11): 1506-18.
［9］ Li MY, Leung J, Kong AW, et al. Anticancer efficacy of 5F in
NNK-induced lung cancer development of a/J mice and human
lung cancer cells［J］. J Mol Med, 2010, 88(12): 1265-76.
［10］Evans GL, Proliferation KV. Cell cycle and apoptosis in cancer［J］.
Nature, 2001, 411(6835): 342-8.
［11］Scully C, Field JK, Tanzawa H. Genetic aberrations in oral or head
and neck squamous cell carcinoma(scchn): 1.carcinogen
metabolism, DNA repair and cell cycle control［J］. Oral Oncol,
2000, 36(3): 256-63.
［12］Clark GB, Thompson G, Roux SJ. Signal transduction mechanisms
in plants: an overview［J］. Curr Sci, 2001, 80(2): 170-7.
［13］Lin HL, Yang JS, Yang JH, et al. The role of Ca2 + on the DADS-
induced apoptosis in mouse-rat hybrid retina ganglion cells(N18)
［J］. Neurochem Res, 2006, 31(3): 383-93.
［14］Cohen GM. Caspases:the executioners of apoptosis［J］. Biochem J,
1997, 326(Pt 1): 1-16.
［15］ Salvesen GS, Dixit VM. Caspases: intracellular signaling by
proteolysis［J］. Cell, 1997, 91(4): 443-6.
［16］Hector S, Prehn JH. Apoptosis signaling proteins as prognostic
biomarkers in colorectal cancer: a review［J］. Biochim Biophys
Acta, 2009, 1795(2): 117-29.
［17］Violette S, Poulain L, Dussaulx E, et al. Resistance of colon cancer
cells to long-term 5-fluorouracil exposure is correlated to the
relative level of Bcl-2 and Bcl-X(L) in addition to Bax and p53
status［J］. Int J Cancer, 2002, 98(4): 498-504.
［18］Yang X, Zheng F, Xing H, et al. Resistance to chemotherapy-
induced apoptosis via decreased caspase-3 activity and
overexpression of antiapoptotic proteins in ovarian cancer［J］. J
Cancer Res Clin Oncol, 2004, 130(7): 423-8.
［19］Gross A, Jockel J, Wei MC, et al. Enforced dimerization of BAX
results in its translocation, mitochondrial dysfunction and apoptosis
［J］. EMBO J, 1998, 17(14): 3878-85.
［20］Lindsten T, Panoutsakopoulou V. Proapoptotic BAX and BAK: a
requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death［J］.
Science, 2001, 292(5517): 727-30.
（编辑：陈望忠）
··1348