全 文 ：中粒种咖啡叶片离体培养的研究
华南热带作物科学研究院热带作物生物技术国家重 .叙实验 室
张锡炎 郑学勤 曾宪松
摘 井
本文报道诱导中粒种咖啡叶片产生愈伤组织 、 膝状续以及再焦小遣株的方法 。 试验表明 , 诱
导产生愈伤组织的关键激素是 2 , 4 一 D和 K t , 最有利于胚状体分化和小植株再生的培养基分 别 为
M S + K 2t
. 。毫克 / 升 + G A 3 0 . 5毫克 / 升 + N A A O。 2毫克 / 升和M S + G A : 1 . 。毫克 /升 + I A A o . 5
毫克 / 升 。
中粒种咖啡为异花授粉植物 , 实生苗的
产量有明显的株间变异现象 , 不能保持优良
母株的高产特性 。 以高产单株的直生枝扦插
而成的无性系 , 平均亩产干豆在 50 公 斤 ·以
上 , 而 目前生产上使用普通实生苗的产量平
均只有 25 ~ 吐0公斤气 可见推广优良无性系 ,
将会使咖啡生产的效益大为提高 。 由于插条
苗繁殖缓慢 , 根系又欠佳 , 不能很好地挖掘
咖啡生产的潜力 。 本试验拟通过中粒种咖啡
叶片离体培养的方法 , 探索快速繁殖优良无
性种苗的新途径 。
材料与方法
供试材料为中粒种咖啡的叶片。 从植株
上摘取半成熟的叶片 , 用 自来水神 洗 干 净
后 , 浸入 70 %的酒精溶液中约 3 一 5 秒钟 ,
取 出后再浸泡于 0 . 1%的升汞溶液 中 8 一 12 分
钟 , 然后在超净工作台上取 出 , 用无菌蒸馏
水冲洗 3 次 , 以除去升汞残液 , 最后用无菌
吸水纸吸干表面水分 , 再把叶片切为 约 。 . 5
~ o
.
c7 m
Z的小块 ( 以下称叶切块 ) 便 可 接
种 。 试验选用M S培养基为基本培养 基 , 并
加入 。 . 6~ 0 . 7%的琼脂为固化剂 , p H 值 调
节在 5 . 8左右 , 然后在 0 . 8一 1 . 0公斤 / 厘米 “
的湿热压力下灭菌 20 分钟 。 培养室的温度为
2 6~ 2 9℃ , 相对湿度为 6 0一 5 0% 。 在愈伤组
织诱导阶段采用 自然散射光 ; 在胚状体分化
和小植株再生阶段采用日光灯照明 12 一 1 4小
时 , 光照强度为 2 0 0 0一 3 0 0 0 zu 二 。
. 文中数据由笔者在大丰农场 、 红光农场等地调查所得 。
照片由郑楷拍摄 , 在此致谢 。
施 ,
六 、 结 语
土地开垦种植橡胶 , 是以 1 种人工植物
种群去替换天然植物群落的生产过程 。 这必
然全打破原来生态系统的平衡 。 胶园实行综
合生产 , 可以加快改善生态环境或建立起新
的生态系统的平衡 。 但是 , 胶园实 行 综 合
一生 产 , 必 须从实际出发 , 因地制宜 。 只有
采取科学的规划设计方案和合理的 抚 管 措
其
局 。
并不断纂结经验 , 加以完善 , 才能发挥
“三大效益 ” , 促进胶 园生产水平不断提
参考文献
〔 1 〕 华南热带作物学院编 : 《橡胶栽培学》 ,
农业出版社 , 1 9 7 9年
〔 2 〕 中国科学院云南热带植物研究所 , 广东
省海南农垦局编 : 《胶茶人工群落研究
与推广科技成果鉴定 会 会 议 材 料 汇
缤 》 , 1 9 8 5年 1 2月
试 验 结 果
万寸 _·
( 一 )愈杨组织诱导阶段
叶切块接种到同时含有 2, 4 一 D 和K t ,
以及分别只含有 2 . 4 一 D 或K t的 3 种培 养 基
中 , 培养 50 ~ 60 天 , 观察结果见表 l 。
表 1的结果表明 , 同时加 入 2 , 4 一 D 和
表 2 N A A 在叶片愈伤组织形成中的
作用
培 养 基
(毫克 / 升 )
}接种叶 )长愈伤
旧块数 }组织块
} ( 块 )l 数 (块 )
频率
( % )
愈伤组织评价
K t l
.
0
+
2
,
4
一
D 0
.
5
+ N A A 3
.
O
6 {透明 、 疏松
K t l
.
0
+
2
,
4
一
D 0
.
5
+
N A A 1
.
0
K t l
.
0
+
2
,
4
一
D 0
.
5
+
N A A O
。
2
1 一透明
衰 , ’ 2, 4 一 D和 K t在叶片愈伤组织形
成中的作用
9 2
。
5
紧实 、浅绿色
疏松
扁平
培 养 基
(毫克 /升 ) 叶
切块
数 (块 )
长愈伤组织块数
(块 )
频率
( % )
愈伤组织评价
3405K t l
, 0年 2 , 4D 0
.
5
K t l
。
0
2
,
4 一 D O 。 5
4 1
3 1
3 2
8 3
。
0 透明 、 疏松
6 {透明 、 疏松
丸的培养基 , 诱导愈伤组织的效果最好 , 在
接种的 41 块叶切块中 , 有 34 块产生 愈 伤 组
织 , 愈伤组织诱导频率达到 83 . 0% , 且所产
生的愈伤组织呈透明疏松状 , 诱导效果最差
的是仅加入 K t而不加 2 , 4 一 D 的培养基 , 接种
的3 1块叶切块中 , 虽然多数可存活 ( 保持绿
色 ) 较长时间 , 但到了60 天左右便相继死亡
( 变褐 ) , 没有一块产生愈伤组织 , 仅加入
2
,
4
一
D而缺少 tK 的培养基 , 诱导愈伤组织的
效果居前两者之间 , 在接种的 32 块 叶 切 块
中 , 大部分在培养了巧天左右便相继死亡 ,
只有 5 块形成了疏松透明的愈伤组织 , 诱导
频率仅为 15 . 6% 。
在同时加入 2 , 4一 D和 K t 的培养基中 , 再
加入 N A A , 对愈伤组织的形成也有 一 定 的
影响 ( 表 2 ) 。
由表 2 可看出 , 当加入 N A A 1 . 0毫克 /
升时 , 愈伤组织的形成频率为 8 2 . 1% , 呈透
明疏松状 , 与表 1中不加 N A A时的 诱 导 效
果没有明显的差别 ; 当把 N A A的浓 度 提 高
到 3 . 0毫克 / 升时 , 对愈伤组织的形成 便 有
一定的促进作用 , 诱导频率提高到 9 0。 6% ,
呈透明疏松状 ; 当把 N A A的浓度再 降 低 到
。 . 2毫克 / 升时 , 则对愈伤组织的质量 产 生
了不良影响 , 虽然形成频率仍高达 9 2 . 5 % , ·
但所产生的愈伤组织呈浅绿色 、 紧实 、 扁平
状 , 不利于进一步诱导分化胚状体 。
为了进一步明确 2 . 4 一 D 在愈伤组织诱 导
中所起的作用 , 设计了不含 2 , 4 一 D 培养基 诱
导效果的试验 , 结果见表 3 。
表 3 不含 2 , 4一 D的培养基对叶片愈
伤组织形成的影响
培 养 基
(毫克 / 升 ) 评价
K t l
.
0
+
N A A 3
.
0
叶切块伸长 , 卷曲
K t l
.
0
+
N A A I
.
0
接种叶 }长愈伤 一 、 *
丰刀 丰卜 决人 【占口 冷门 小斗T ` 夕多毛兰千」
七创 `多.之文凡 }类」注耳 气艺弋 一 / 甲 、
l 牛书 、 !兴 寿 1 4`书 、 」、 0/ ,
~ …~ i一2 7
}
0
{
”
2 9 …“ } 。
3 2
{
0 。
叶切块伸长 , 卷曲
N A A 3
。
0
叶切块处静止状态
叶切块处静止状态
胜..、
!…1;…
N A A I
。
0 1 3 0 } 0 ! 0
由表 3 可知 , 仅含N A A 或者仅 含 N A A
和 K t而缺乏 2 , 4 一 D的培养基 , 均不能诱 导愈
伤组织的形成 。 同时含有 K t和 N A A 的 两 种
培养基 , 接种后叶切块有继续伸长和卷曲现
象 , 而仅含有 N A A的两种培养基 , 接 种 后
叶切块一直保持静止状态 。
根据表 1 、 表 2 和表 3 的结果 , 2 , 4一 D是
诱导中粒种咖啡叶片产生愈伤组织不可缺少
的因素 , 但 2 , 4 一 D的作用必须在其它激素 ,
特别是 K t的配合下才能取得 良好的效果 。
(二 ) 胚状体的分化阶段
把第一阶段产生的愈伤组织 , 转移到一
组分化培养基上 , 培养 60 一 90 天后 , 观察结
果表见 4 。
表 4 几种分化培养基对胚状体分化
的作用
( 三 ) 小植株的再生阶段
1
. 几种激素对胚状体正常发育的影响
把胚状体转入含有不同激素的一组培养
基中 , 培养 50 ~ 60 天后 , 观察胚状 体 的 颜
色 、 根的数量 , 测量胚轴长度 , 结 果 如 表
5
。
培 养 缝
(毫克 / 升 )
种愈
组织
J乡成胚
;伏体数
( 团 )
胚状体类型和数量
表 5 不同激素对胚状体正常发育的影响 ,
激素
K t 2
.
0
+
G A 0 0
.
5
+
N A A 0
.
2
K t o
.
5
+
N A A O
.
2
小子叶型 、球型 , 最多
子叶型 , 少
子叶·型 、 鱼雷形 , 少
子叶形 、 鱼雷形 , 少
着、 及其浓度 1胚状体一胚状体 {毫克 / 升 ) {数 (团 ) l 颜色 l
根的数量
鱼 {上
o 一 o
接伤数
白
.410.5
。
2!3
一日一过
卜卫月口自
709针拱n
00八U,曰内O丹乃`价J八口月乙,d
K t 2
.
0
+
N A A O
B A O
。
3
+
IA A O
。
3
`
GA 3 O
. 争半姚
一 a a 2
.
0
+ 生物素 0 . 5
I A A I
。
O
G A 3 1
。
0
N A A l
。
O
K t l
。
0
绿色
白
白、 绿
,
4
一
D l
根据表 4 结果 , 培养基 K tZ . 0 毫克 / 升
+ G A
。 0
.
5毫克 / 升 十 N A A o . 2 毫克 / 升 最
有利于胚状体的分化 , 分化频率高达 8 4 . 4%,
且所产生的胚状体多为小子叶型 。 小子叶型
胚状体形体小 、 数量大 , 样子和种子中的幼
胚十分相峨 ; 多数小子叶型胚状体能很好地
发育为性 吠良好 的子叶型呸状体 ( 图 I ) 。
3 l
2 4
愈伤组织
G A
3 1
.
0
+
IA A 1
.
0 绿色
月王轴长度 *
(厘米 )
0
。
3 5
0
。
3 1
1
。
6 2
0
。
2 4
0
。
3 7
愈伤组织
1
。
4 3
蟀幻一划:.381
团一240了
图 1 小子叶形胚状体数盘多 、 性状 良
好
其它 3 种培养基也能诱 导产生胚状体 , 不过
分化频率较低 , 只分别为 2 5 . 0% 、 4 3 . 3%和
拐 . 1% , 并且所产生的胚状体多数 为 鱼 雷
型 , 再生性能不如前者 , 数量也比前者少得
_多。
* 各处理挑选30 个发育较好的胚状体 , 测量后
求平均值 。
从表 5 可见 , 在不加任何激素的培养基
上 , 胚状体保持白色 , 胚轴平均长度为 0 . 35
厘米 , 根系没有发育 ; 加入 G A 。 1 . 0毫克 /升
的培养基 , 则能促使胚状体转绿 , 促进胚轴
伸长和根系发育 , 胚轴平均长度 为 1 . 62 厘
米 , 根系抽生率为 2 1 . 9% ; 含有 I A A I . o 或
N A A .] o毫克 / 升的两种培养基 , 不但不 能
使胚状体转绿 , 而且对胚轴的伸长有一定的
抑制作用 , 胚 轴平均长度分另lj为 0 . 3 1和 0 . 2 4
厘米 , !一匕不加任何激素时还短 , 但 N A A 对
根系的发育有一定的促进作用 , 其根系的抽
生频率为 3 4 . 6% ; 加了K t 1 . 。毫克 / 升的 培
养基 , 能使部分胚状体转绿 , 并引起一些子
叶徒长 , 在胚轴没有明显伸长的情况下 ( 平
均长度为 0 . 37 厘米 ) , 子叶徒 一长到面积大于
1平方厘米 , 使胚状体畸形发育 , 含有 2 , 4 -
D l
.
o毫克 / 升的培养基 , 使所有胚 状 体 重
新回复到愈伤组织状态 。 可见 , 单用一种激
素时 , G A 3最有利于胚状体的正常发育 。
表 5 的最后一行是同时加了 G A 3 1 . 0 毫
克 / 升和 I A A 王· 0辛辜/ 升的培养基 , 这 个
培养基能促进胚状傣祷霉, 胚轴伸长和根系
发育 , 胚轴平均长度为 ! ,招厘米 , 更接近正
常情祝 , 根的抽生率为 45 , 8叮 , 比单独使用
G A
。时还高 。 因此 , 在使用 G A 。时 , 配合使
用 I A A , 更有利于胚状体的正常发育 。
2
.
G A
: 与 I A A 的配比对小植株再生的
攀响
为了确定 G A 。和 I A A促进小植株再生的
最佳浓度及比例 , 安扣卜了培养基中的 G A 和
I A A配比试验 , 结果见表 6 。
表 6 G A 。和 I A A 配比对小植株再 生
的影晌
提高 , 小植株筑再生频率和根系的抽生频率
也随之提高 。 因此 , 整个试 验 中 , ’ 以 G A ,
1
.
0毫决_ / 升 ` I八八。 . 6毫克 / 升的配比最有
刊于小植袜苗内生和根 李爪发育 。
( 四 ) 小 苗 移栽
小植株形成后 , 必须经 过催根催芽 , 使
其抽生真叶和根系 ( 图 2 , 3 ) , 然后才能
移栽 。 移栽前必须 准务好括士 。 基 _ !二 按 塘
泥 , 河沙 , 木 裸 二 1 , 2 , l 混 合 。 把 试
管苗轻轻移入伙有 自来对; 今 盆 中 , 洗 净 根
系 , 然后定植于准备好的基土中 。 定植 60 天
j亩叶色转绿 , 权系进一 步生 一沃 , 其叶继续抽
…八曰SQ幻,土J已口ddl1lJl
les1
.匕…
…n自Q尸 口一才OQ与qU一11,曰1.1`
. .
n了比八é,]性才O八
G A 3 0
.
5
+
IA A o
.
z {
G A 3 0
。
5
十
IA A O
.
3
G A 3 0
.
5
,
I A A O
.
5一
I A A O
.
5
+
G A 3 0
.
1
I A A o
.
5
*
G A 3 o
.
3 }
I A A O
.
5
+
G A 3 1
. 。 {
胚状体
数
(团块 )
3 l
3 3
3 2
3魂
3 4
3O
小植株数 , 长根数
(侠 、 ’
基升
/
养克毫培
(
3峨
4 8
5 1
. 为胚状休团块数的百分比
表 6 的前三行中 , 每种培养基的 G A : 浓
度保持 0 . 5毫克 / 升不变 , I A A 跳浓度 分 别
为 0 。 1 、 0 . 3和 0 . 5毫克 / 升 , 3 种培养 基 诱
导小植株再生的频率依次为 1 1 0 . 。 、 1 4 5 . 0和
15 9
.
0%
, 根系的抽生频 牢 分 别 为 16 . 1 、
3 9
.
4和 5 0 . 0% 。 可见 , 当G A 。浓度保 持 0 . 5
毫克 / 升不变 , I A A的浓度在 0 . 5毫克 / 升
的范围内时 , I A A浓度提高 , 小植株再生频
率随之提高 , 根系的抽生能力也随之增强 。
表 6 的后 4 行中 , 每种培养基的工A A 浓
度保持 0 . 5毫克 / 升不变 , G A 3 的浓度 分 别
为 0 . 1 、 0 . 3 、 0 . 5和 1 . 0毫克 / 升 , 4 种培养
基诱导小植株的再生 频 率 依 次 为 5 8 . 8 、
1 2 9
.
0
、
1压9 . 0和2 9 7 . 0% , 根的抽生频 率 分
别为 1 1 。 8、 4了。 1 、 5 0 . 0和 1 0 3 . 0 % 。 可 见 ,
当 I A A的浓度佩持 .0 5毫克 /升不变 、 G A 。的
浓度在 1 . 0毫克 / 升的范围内时 , G A 。 浓 度
讨 论
中粒种咖啡叶片的离体结养 , 已经能够
获得大量小植株 , 但是让小植株继续抽生真
叶和根系的工作 , 做得还比较少 , 到写此文
时 ( 1 9 8 9年 10 月 ) 为止 , 移栽的试管苗只有
无荫蔽栽培小粒种咖啡密植
的生理学基础
云 南省 热带作物科学研 究所 杨 湘 江
摘 . 要
本文论述 了无荫蔽栽培小粒种咖啡密植的生理学基础及高产效应 , 指出无荫蔽栽培小粒种咖
啡所具有的丰产潜力 , 并指出密植对无荫蔽栽培的小粒种咖啡的特殊意义在于它创造了良好的适
生条件 , 从而有效地发挥其丰产潜力 。
小粒种咖啡密植的高产效应已为国内外
左产实践和科学实验所证实 , 但密植是有限
度的 。 只有群体植株的生理产量的总和超过
常规种植密度的总和时 , 密植才能增加商品
产量 。 通过种植密度的合过:控制 , 可以使产
量达到最佳水平 , 并保持生产周期中的高产
稳产 。 小粒种咖啡是一种 3 0一 40 年收益期的
作物 , 因此种植密度的合理控制 , 实属 “ 百
年大计 ” 问题 。
一 、 无荫蔽栽培小粒种咖啡 密 植
的生理学基础
小粒种咖啡从野生 到 引 种栽培历史不
长 . 因此它的生理学特点在很大程度上反映
出它的天然习性 , 即喜温凉和荫蔽 , 每年经
历一个干旱期 。 在赤道附近由于光照强 、 气
温高 , 小粒种咖啡往往在高海拔的山区或有
荫蔽树条件栽培下 。 然而 , 在纬度较高的地
区 , 如北纬 2 “ 的古巴 、 南纬 26 。 的巴西 、 津
巴 布韦和北纬 26 。 的夏威 夷以及我国云南的
绝大多数咖啡园和海南岛的许多小粒种咖啡
钟植园 , , 通常采用无荫蔽栽培 。
23株。 因此 , 下一阶段的工作 , 重点应该放
在把大量的小植株诱导成可供移栽 的 试 管
一畜 , 更好地掌握移苗规律 , 以便进 一 步 完
荫蔽树在高温干旱季节与咖啡争夺土壤
有效水分 , 这可能是肯尼亚和巴西采用荫蔽
树栽培失败的原因 ( F r a n e o , 1 9 5 2 ) 。 荫蔽
树在旺盛生长和结果季节又与咖啡 争 夺 肥
料 , 这将影响咖啡树干物质的生产率 。 而无
荫蔽栽培 , 则可克服这两个弊病 。
更为重要的是 ,在无荫蔽栽培条件下 , 光
照充足 , 有利于小粒种咖啡枝条结果节上潜
在花芽的分化萌动 。 在原产地森林荫蔽条件
下的小粒种咖啡 , 结果量很少 , 因为顶层荫蔽
使咖啡结果节接受的光照少 , 开花减少 ( 0 5 -
t e n d e r f 1 9 62
,
W i l一e y 1 9 7 5 ) 。 19 6 6 年 ,
C a s t i l l o 和 L o p e z 证实哥伦比亚植后 2 8个月的
小粒种咖啡树 , 荫蔽度为 50 % 的结果节百分
率 、 每结果节的花序数量和每花序的花朵数
量分别 比无荫蔽的减少 30 % 、 钧%和 50 % 。所
以 , 咖啡园荫蔽度大是其低产的主要原因 。
危地马拉试验结果表明 , 无荫蔽树的小粒种
咖啡的产量比使用荫蔽树的高 5 一 8 倍 。 可
见 , 无荫蔽栽培小粒种咖啡的一个显著的特
点是大量结果 , 这是小粒种咖啡无荫蔽栽培
最具有丰产潜力的特性 。 与此相关的是无荫
善这一微繁技术 , 使之在生产中得以应用和
推广 。