全 文 ：〖前沿报道〗
半边旗提取物 5F对 HO-8910PM细胞中 NF-κB和
FAK蛋白表达的影响
何太平 , 　莫丽儿 , 　梁念慈
广东医学院(生物化学与分子生物学研究所:何太平 ,梁念慈;天然药物研究与开发重点实验室:莫丽儿),
广东湛江 524023
Effects of 5F from Pteri semipinnata L on expression of NF-κB and FAK proteins
in HO-8910PM cells
HE Tai-ping , MO Li-er , LIA NGNian-ci
Guangdong Medical College , Zhan jiang 524023 , P. R. China
【摘要】　目的:研究半边旗(pteri semipinnata
L , PsL)二萜类化合物 5F对 HO-8910PM 细胞
内核因子-κB(nuclear factor-kappaB , NF-κB)p65
亚基 、黏着斑激酶 (focal adhesion kinase , FAK)
表达及 p-FAK(phosphorylated FAK)水平的影
响 ,探讨其抗肿瘤侵袭转移的作用机制。方法:
MTT 法测定 5F 对细胞增殖的影响;Western
blot分析NF-κB(p65)、FAK 蛋白表达及 p-FAK
水平。 结果:12. 50、25. 00、 50. 00、100. 00 和
200. 00 μmol /L的 5F 作用 HO-8910PM 细胞 24
h 后 ,细胞增殖抑制率分别为(28. 20±3. 66)%、
(30. 96±1. 83)%、(41. 41±1. 65)%、(60. 67±
2. 24)%和(73. 18±1. 24)%, 并有一定的剂量效
应关系 , P <0. 05(P 值分别为 0. 018、0. 000、
0. 000、0. 000 和 0. 000)。25 ～ 100 μmol/ L的 5F
作用 HO-8910PM 细胞24 h 后, NF-κB(p65)蛋白
表达水平明显下降;上调 FAK 蛋白表达 , 使
FAK酪氨酸磷酸化程度降低(p-FAK /FAK),
P<0. 01(P 值分别为 0. 000、0. 001 和 0. 000)。
结论:5F 抗肿瘤侵袭转移与 NF-κB(p65)表达以
及 FAK 酪氨酸磷酸化程度降低有关。
肿瘤防治杂志 , 2005 , 12(8):565- 568
[ ABSTRACT] 　OBJECTIVE:To study the effect of 5F from Pteri
semipinnata L on the expression of NF-κB(p65), FAK pro tein and the
level of phospho ry lated FAK , and to investigate its posssible mecha-
nism of 5F on the metastasis-associated ability of human highly meta-
static ovarian carcinoma HO-8910PM cells. METHODS:MTT assay
was used to examine the effect of 5F on proliferation of HO-8910PM
cells after 24 hours treatment. The expression level of NF-κB(p65),
FAK pro tein and the level of phosphorylated FAK were assessed by
Western blot analysis. RESULTS:5F significantly inhibited prolifera-
tion of HO-8910PM cells after treatment with , 12. 5 , 25. 00 , 50. 00 ,
100. 00 , 200. 00 μmol /L 5F fo r 24 hours , their inhibitory rates were
(28. 20±3. 66) %, (30. 96±1. 83)%, (41. 41±1. 65)%, (60. 67±
2. 24)% and(73. 18±1. 24)%, respectively and the effects appeared in
a dose-dependent manner , P<0. 05(P =0. 018 , 0. 000 , 0. 000 , 0. 000 ,
and 0. 000). The expression level of of NF-κB(p65) pro tein decreased
significantly in HO-8910PM cells after treatment with 25- 100μmol/ L
5F for 24 hours , and 5F up-regulated significantly the expression of
FAK , down-regulated the degree of phosphorylated FAK(p-FAK /
FAK), P<0. 01(P=0. 000 , 0. 001 and 0. 000). CONCLUSION:The
antitumor activity of 5F from Pteri semipinnata L is involved in the ex-
pression of NF-κB(p65) and the deg ree of phosphorylated FAK.
Ch in J Cancer Prev Treat , 2005 , 12(8):565- 568
【关键词】　卵巢肿瘤 /病理学;NF-κB /生物合成;蛋白质酪氨酸激酶 /生物合成;抗肿瘤药(中药) /药理学;比色法
[ KEYWORDS] 　ovarian neoplasms /patholog y;NF-kappa B /biosynthesis;pro tein-ty ro sine kinase /bio syno the sis;antine-
oplastic drugs (TCD) / pharmaco log y;colo rimetry
【中图分类号】　R73　　　【文献标识码】　A　　　【文章编号】　1009 - 4571(2005)08 - 0565 - 04
【基金项目】　国家自然科学基金资助(39870900)
【第一作者简介】　何太平 , 男 , 湖南祁东人 , 硕士 , 主管检验技
师 ,主要从事卵巢癌侵袭与转移分子机制的研究工作。
Tel:86 - 759 - 2388581 - 7　E-mail:taipinghe@163. com
【通讯作者简介】　梁念慈 ,男 , 广东湛江人 ,教授 ,博士生导师 ,
主要从事肿瘤侵袭与转移分子机制的研究工作。
Tel:86 - 759 - 2388501　E-mail:ncliang@admc. edu. cn
　　半边旗(pte ri semipinnata L , PsL)又名半边莲 、半
边菊 ,属凤尾蕨科植物 ,广泛分布于南方各省 ,民间常
用于清热解毒 、利水消肿 、治疗疳积和风湿痛等。半边
旗提取物 5F(5F from pteri semipinnata L)是从中药
半边旗中提取的一种二萜类化合物 ,其化学名为 11α-
羟基-15-氧-16-烯-ent-贝克杉烷-19 酸 。我们已发现
5F 具有明显的抗肿瘤活性 ,能增强 K562细胞 MAPK
565 肿瘤防治杂志 2005年 4月第 12卷第 8期　　 CH IN J CANCER P REV TREAT , Ap ri l 2005 , Vol. 12　No. 8
DOI牶牨牥牣牨牰牥牱牫牤j牣cnki牣cjcpt牣牪牥牥牭牣牥牳牣牥牥牪
的活性及表达[ 1] , 并影响 K562 细胞中 bcl-2 、bax 、
c-jun 、c-fos癌基因的表达[ 2] 。我们应用蛋白印迹的方
法研 究 5F 对核因子-κB (nuclear factor-kappaB ,
NF-κB)p65亚基 、黏着斑激酶 (focal adhesion kinase ,
FAK)表达及 p-FAK(phospho rylated FAK)水平的影
响 ,探讨 5F 抗肿瘤侵袭转移的作用机制。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
人高转移卵巢癌细胞(HO-8910PM)购自上海细
胞生物所 ,由浙江省肿瘤研究所许沈华等[ 3] 建立。细
胞在含 10%小牛血清 、100 U /mL 青霉素和 100
μg /mL链霉素的 RPM I1640完全培养基中 , 37℃、5%
CO 2 饱和湿度孵箱培养。细胞经过消化传代 ,取对数
生长期的细胞进行培养。
1. 2　药品与试剂
超级小牛血清购自杭州四季青公司;RPMI1640培
养基购自 Gibco 公司;4 ×上样缓冲液(125 mmol /L
Tris-HCl , pH 6. 8 , 4%SDS , 10%β-巯基乙醇 ,20%甘
油 ,0. 04%溴酚蓝)、NF-κB(p65)小鼠 IgG 单抗 、p-Ty r
(PY99)小鼠 IgG 单抗和 β-Actin山羊 IgG多抗均购自
Santa Cruz公司;FAK 小鼠 IgG 单抗购自 Neomarkers
公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG和辣根过氧
化物酶标记马抗山羊 IgG购自北京中山公司;半边旗提
取物 5F由广东医学院天然药物开发中心提供。
1. 3　MTT比色法测定 5F对细胞增殖的影响
选取对数生长期的 HO-8910PM 细胞 ,经胰酶消
化 、台盼蓝染色后在血球计数板上计数 ,确保活细胞在
97%以上 。调整细胞浓度按 8 000个 /孔(100 μL /孔)
加到 96孔培养板中 。将培养板放入 37℃、5%CO 2 孵
箱中培养 。待细胞贴壁后取出培养板 ,加入不同浓度
5F 1μL , 使其终浓度分别为 6. 25 、12. 50 、25. 00 、
50. 00 、100. 00 、200. 00 μmol /L ,每个浓度设 3个平行
孔;同时设置空白对照组 、溶剂对照组和调零孔。培养
板放回孵箱继续培养 24 h ,取出培养板 , 每孔加入
MTT 50 μg (10μL),培养板再放回孵箱孵育 4 h 。吸
出上清液 ,加入 200 μL 二甲基亚砜。在平板摇床摇
10 min使甲臜完全溶解。用酶标仪测 570 nm 波长处
每孔的吸光度(A)值。
细胞增殖抑制率(%)=对照组 A 值 - 处理组 A 值对照组 A 值 ×100%
1. 4　Western blot分析 5F对 NF-κB(p65)和 FAK蛋
白表达及 P-FAK水平的影响
取对数生长期的 HO-8910PM 细胞 ,稀释成 1×
106 /mL ,接种于 50 mm 的培养皿中培养 ,每皿 5 mL。
待细胞贴壁后 , 分别以 PBS 、0.1%DMSO 和 25 、50 、
100 μmol /L的5F 处理 HO-8910PM 细胞 24 h ,收集细
胞 ,PBS洗涤 2次 ,加入预冷的细胞裂解液 100μL ,用细
胞刮将细胞刮下 ,并转移至预冷的 1. 5 mL 离心管中 ,置
于碎冰上冰育 20 min 后 ,于 4℃、10 000 r /min 离心
15 min。上清液转移至另一 1. 5 mL离心管中 ,用考马
斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量[ 4] 。蛋白样品和4×
上样缓冲液以 3∶1的比例混合 ,100℃水中煮沸 5 min
使蛋白质变性。SDS-PAGE 电泳后电转移至 PVPF 膜
上 ,5%脱脂牛奶封闭后加入第 1抗体于室温孵育 2 h ,
用 TBS 缓冲液洗涤 3次 ,每次10 min ,加入第 2抗体于
室温孵育 2 h ,再用 TBS缓冲液洗涤 3次 ,每次 10 min ,
加入发光试剂(ECL)显色 ,目的条带用图象分析软件
Scion Image进行光密度积分值分析 ,以 NF-κB(p65)、
FAK 、p-FAK与 β-Actin光密度积分值的比值作为蛋白
表达相对含量。
1. 5　统计学处理
实验数据以 x- ±s表示 ,采用SPSS 11. 0统计软件
包 One-Way Anova 与 Bon-fe rroni (方差齐)或 T am-
hane’ s T2 (方差不齐)检验进行统计学处理。
P<0. 05表示差异有统计学意义。
2　结果
2. 1　MTT比色法测定 5F作用 24 h后对 HO-8910PM
细胞增殖的影响
分别用0～ 200μmol /L 的5F作用HO-8910PM 细胞
24 h后 ,MTT 法测定细胞增殖抑制率。结果表明 ,5F 能
明显抑制 HO-8910PM 细胞的增殖 ,并有剂量效应关系
(表 1 , Tab. 1)。
2. 2　5F对 NF-κB(p65)和 FAK蛋白表达以及 FAK酪
氨酸磷酸化水平的影响
分别用 PBS 、0. 1%DMSO和 25 、50 、100 μmol /L的
5F处理 HO-8910PM 细胞 24 h后 ,Western blot分析目
的蛋白的表达 。结果发现 ,5F 能够明显抑制细胞NF-κB
(p65)蛋白的表达;明显上调 FAK 蛋白的表达 ,轻微降
低FAK酪氨酸磷酸化水平;大幅降低 FAK酪氨酸磷酸
化程度(p-FAK /FAK), P 值分别为 0. 000 、0. 001 和
0.000(图 1 ,Fig. 1;图 2 ,Fig. 2;表2 , Tab . 2)。
表 1　5F作用 24 h后对 HO-8910PM细胞增殖的
影响(x-±s)
组别 抑剂率(%)　　　 P值
空白对照组 0. 00±0. 04
溶剂对照组 -5. 81±2. 24 1. 000
5F浓度(μmol /L)
　　6. 25 25. 96±2. 95 0. 128
　 12. 50 28. 20±3. 66※ 0. 018
　 25. 00 30. 96±1. 83※ 0. 000
　 50. 00 41. 41±1. 65※ 0. 000
　100. 00 60. 67±2. 24※ 0. 000
　200. 00 73. 18±1. 24※ 0. 000
　　与空白对照组比较 , ※P<0. 01。
566 何太平 ,等　半边旗提取物 5F 对 HO-8910PM 细胞中 NF-κB和 FAK 蛋白表达的影响
Tab. 1　Effect of 5F on proliferation of HO-8910PM cells after
24 hours treatment(x-±s)
G roup In hibitory rate(%) P value
0(cont rol) 0. 00±0. 04
0. 1%DMSO -5. 81±2. 24 1. 000
5F (μm ol /L)
　　6. 25 25. 96±2. 95 0. 128
　 12. 50 28. 20±3. 66※ 0. 018
　 25. 00 30. 96±1. 83※ 0. 000
　 50. 00 41. 41±1. 65※ 0. 000
　100. 00 60. 67±2. 24※ 0. 000
　200. 00 73. 18±1. 24※ 0. 000
　　※P<0. 01 , vs con t rol group.
1:空白对照组;2:0. 1%DMSO(溶剂对照组);3:25μmol /L 5F 处理组;
4:50μm ol /L 5F 处理组;5:100μmol /L 5F 处理组。
图 1　5F作用 HO-8910PM细胞 24 h后对 NF-κB(p65)
和 FAK表达及 p-FAK水平的影响。
1:Cont rol group;2:0. 1%DMSO(solvent group);3:25 μmol /L 5F treated
group;4:50μmol /L 5F t reated group;5:100μmol /L 5F treated group.
Fig. 1　Effect of 5F on the expression of NF-κB(p65),
FAK and the level of phosphorylated FAK
C ont rol:空白对照组;0. 1%DMSO:溶剂对照组;1:25 μmol /L 5F 处理
组;2:50 μmol /L 5F 处理组;3:100 μmol /L 5F 处理组;p-FAK /FAK
(% of con t rol):各组 p-FAK /FAK 与空白对照组 p-FAK /FAK 的相对
值。※:与空白对照组比较 , P<0. 05。
图 2　5F作用24 h后 p-FAK F/ AK变化的图象分析
C ont rol: Blank cont rol group; 0. 1% DMSO: Solven t g rou p;
1:25μm ol /L 5F t reated group;2:50 μm ol /L 5F t reated g roup;3:100
μmol /L 5F t reated group;p-FAK /FAK(% of cont rol):relative value
of p-FAK /FAK of each group com pared w ith p-FAK /FAK of con t rol
g rou p. ※P<0. 05 , vs con trol group.
Fig. 2　Image analysis of change of p-FAK/FAK
after treatment with 5F for 24 h
表 2　5F作用 HO-8910PM细胞 24 h后 NF-κB(p65)
和 FAK表达及 p-FAK水平定量分析 (x-±s)
组别 NF-κB(p65)　 FAK　　 p-FAK　　
空白　
对照组 0. 445 2±0. 035 6 0. 208 1±0. 018 4 0. 520 3±0. 052 8
溶剂　
对照组 0. 419 6±0. 040 8 0. 278 3±0. 025 5 0. 580 7±0. 050 2
5F浓度(μmol /L)
　 25 0. 487 0±0. 046 0 0. 476 9±0. 039 8※ 0. 357 1±0. 029 6※
　 50 0. 224 8±0. 015 9※0. 534 2±0. 045 2※ 0. 467 4±0. 038 1
　100 0. 057 2±0. 006 5※0. 496 6±0. 043 7※ 0. 409 7±0. 043 5※
　　与空白对照组比较 , ※P<0. 05。
Tab. 2　Quantity analysis of the expression of NF-κB(p65),
and the level of phosphorylated FAK after
treatment with 5F for 24 h(x-±s)
G roup NF-κB(p65) FAK　　 p-FAK　　
Control 0. 445 2±0. 035 6 0. 208 1±0. 018 4 0. 520 3±0. 052 8
0. 1%
DMSO
0. 419 6±0. 040 8 0. 278 3±0. 025 5 0. 580 7±0. 050 2
5F(μmol /L)
　 25 0. 487 0±0. 046 0 0. 476 9±0. 039 8※ 0. 357 1±0. 029 6※
　 50 0. 224 8±0. 015 9※0. 534 2±0. 045 2※ 0. 467 4±0. 038 1
　100 0. 057 2±0. 006 5※0. 496 6±0. 043 7※ 0. 409 7±0. 043 5※
　　※P<0. 05 , vs con t rol group.
3　讨论
NF-κB是一类几乎存在于所有细胞内 ,能与多种基
因的启动子或增强子 NF-κB结合位点发生特异性结合
并启动基因转录的一组转录调节因子。NF-κB是由亚
单位 p50和 p65组成的异源二聚体 , p50与 DNA 直接
结合 ,p65具有转录活性。静息状态下 ,NF-κB与抑制性
蛋白 IκB-α结合滞留于细胞质中 ,在一定刺激作用下
IκB-α解离 , NF-κB 释放并进入细胞核激活靶基因[ 5] 。
多种致癌因素通过激活 NF-κB ,促进细胞生长及抗凋
亡 ,使细胞发生恶性转化并促进肿瘤细胞的转移 ,因此 ,
抑制 NF-κB成为肿瘤治疗的新靶标之一[ 6] 。我们的研
究表明 ,5F 能明显抑制卵巢癌细胞 NF-κB(p65)的表
达 ,调控其下游的肿瘤侵袭转移相关蛋白(如 FAK等)
的表达 ,并最终影响肿瘤细胞侵袭转移能力。
　　在恶性肿瘤细胞侵袭和转移的过程中 ,肿瘤细胞
要使细胞外基质发生黏附变化才能进行侵袭和迁移。
整合素的黏附介导在这一过程中起着重要作用 ,整合
素触发的主要信号传导途径是酪氨酸激酶磷酸化级联
反应 ,而这一信号传导途径在细胞内的第 1 个信号分
子就是 FAK 。FA K 又是胞内多条信号通路的交汇
点 ,传递多种信息 ,实现多种生物学功能 。研究结果证
实 ,FAK的许多调节功能与肿瘤转移密切相关 ,可通
过 FAK /S rc-PI3K-A kt 途径 ,传递生存信号 , 抑制凋
亡;通过 FAK /Src-Grb /Sos-Ras-Erk 途径 ,传递增殖
信号 ,改变肿瘤转移相关基因表达;通过 FA K /Src-
Cas-Crk /C3G-Rap1途径 ,改变细胞骨架;通过 FA K /
S rc-Paxillin-Crk-Rac途径 , 调节肿瘤细胞的运动能
567 肿瘤防治杂志 2005年 4月第 12卷第 8期　　 CH IN J CANCER P REV TREAT , Ap ri l 2005 , Vol. 12　No. 8
力[ 7] 。大多恶性肿瘤表现为 FAK 表达和 FAK 磷酸
化水平的升高[ 8] 。FAK表达和 FAK磷酸化水平的升
高可以抑制肿瘤细胞的凋亡 、促进肿瘤细胞增殖 、改变
肿瘤细胞黏附性能 、增强肿瘤细胞的迁移运动能力 、促
进肿瘤细胞分泌蛋白酶和促进肿瘤细胞逃避免疫监
控 ,从而使肿瘤细胞的侵袭转移能力得到加强 。Hsia
等[ 9]研究发现 , FAK 参与了 MMPs的分泌和细胞外
基质的重建 ,促进肿瘤细胞的侵袭运动 ,并使肿瘤细胞
向远处移动到达转移部位。Schneider 等[ 10] 在实验中
发现 ,高侵袭口腔癌 SCC25细胞株 FAK 的表达比低
侵袭口腔癌 SCC15细胞株高 1. 5倍 ,转染了 FAK 基
因的低侵袭口腔癌 SCC15细胞株侵袭能力比没转染
FAK 基因的低侵袭口腔癌 SCC15细胞株高 4. 5 倍 ,
证实了 FAK 高表达能增强原发性口腔癌的侵袭转移
潜能 。
我们的研究发现 ,5F 处理 HO-8910PM 细胞 24 h
后 ,明显上调 FAK 的表达 ,轻微下调 FAK 磷酸化水
平 ,明显下调 p-FAK /FAK 。从实验结果可以看出 ,
5F 抑制了 FAK 的磷酸化 ,因而 FAK 的活性下降 ,从
而抑制了 HO-8910PM 细胞的侵袭 、运动和黏附能力 ,
这可能是 5F 抑制HO-8910PM 细胞转移的机制之一。
另外 ,5F 上调 FAK 表达的原因是细胞本身具有维持
自身平衡的能力 ,为了维持细胞中 FAK 磷酸化水平 ,
保证细胞具有侵袭转移的能力 ,FA K磷酸化程度的降
低反而促进了 FAK的表达 。
总之 ,5F 抑制高转移卵巢癌细胞 H0-8910PM 侵
袭转移能力与 NF-κB(p65)的表达以及 FAK 酪氨酸
磷酸化水平密切相关 ,而具体的作用机制有待于更深
入的研究 。
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收稿日期:2004 - 07 - 23　修回日期:2004 - 10 - 11
(编辑:魏玲)
568 何太平 ,等　半边旗提取物 5F 对 HO-8910PM 细胞中 NF-κB和 FAK 蛋白表达的影响