全 文 ：兰 州 大 毕学 报 ( 自 然 科 学 版) , ,。白。 . 泛e ( 4 ) : , 1 3、 1 1。
JO U RN A L O F L A N Z H O U U N IV E R S I T Y ( N a t u r a l S e ie n e e s )
卜 二叶律多糖的研究
1
. 分离 、 纯化及其基本性质
孟延发 胡晓愚 孟雪琴
( 生 物 系 )
摘 要 二叶 林用沸水才* 提 , 三 氛乙 酸一 正 丁 醉除蛋 白 , 乙醇沉 沈得 二叶球 多枯粗品 . 比粗 品
进一 步通过 C T 人B 和 D E人 E 一 纤维素柱层析 纯化 . 其主要 成份 用SeP h ad e x G 一 1” 分子 筛 、 纸层
析 、 醋 酸纤维薄膜 电泳 和琼脂 糖 电泳均证 明是均一的 . 用 S叩h ad e x G 一 20 。凝胶过滤法 测得 分子
童是了9 。。。 . 纯 多糖糖含童以 蔺萄糖 为标准是 69 拓 , 以 半乳 糖为标准是伟 6 书 , 以 糖原 为标准是
70
.
4 拓 . 糖 醛酸含量是 74 拓 . 体 内试验表明二 叶称 多糖对 移植 S一 1 80 肉瘤 细胞 具有抑 制作 用 .
关键词 白花蛇舌草 ( 二叶萍 ) . 多糖研 完 , 才允肿 瘤
60 年代以来 , 人们发现多糖具有多方面的生物功能 . 如银耳多糖 、 黑木耳多糖 、 亮
菌多糖及某 些蘑茹多糖等都具有抗放射 、 抗肿瘤 、 免疫促进等作用 . 因此 , 对多糖的研
研越来越引起人们的关注 .
二叶捧 , 又名白花蛇舌草是一种 中草药 , 它的主要功能是抑制肿瘤 、 清热解毒 、 消
炎和抗肝炎病毒等 . 到 目前为止 , 对二叶薄多糖的研究还未见报导 . 本文报告二叶捧多
糖 的分离纯化及体 内抗肿瘤细胞生长的研究 .
1
, 试验部分
1
.
1 二叶捧 由甘肃省 医药公司提供 .
1
.
2 定性及定量分析 总糖含量测定用 H : 5 0 4 一蕙酮 试 剂法 ; 糖 醛 酸 含 量 测 定 用
H
:
5 0
` 一咔哩试剂法 〔 ” ;蛋 白质含量测定用紫外吸收法或者 L o w r y ` s法 ; 核酸含量测定
用紫外吸收法 ( 2 6 o n m ) ; 跟踪多糖用 M o l i s e h试验 .
1
.
3 二叶葬多糖的制备 1 2 」 L3 } I k g 二叶棒在 自制的制备型脂肪抽提器中 , 加适量 乙
醚 除去脂溶性物质 . 加 9 倍左右体积水于沸水浴中搅拌提取 1 2 h , 残渣反复提取 3 次 ,
合并提取液 ,浓缩 , 离心 3 50 o r/ m l’n x l0 o i n) . 清液加入等体积预冷的 5肠三氯乙酸 : 正丁
醇 ( 犷 / F 二 1 : l) 于分液漏斗中 , 置 4 ℃分层后 , 除去正丁醇层和中层蛋 白 , 下层清液透析
70 h
, 浓缩 ,加 乙醇沉淀 , 离心后沉淀用无水 乙醇洗 3 次 , 乙醚洗一次 , 得棕黑色粗 品 多
糖 . 将此粗品配成 5肠浓度 , 调 p H为 8 ~ 9 , 一次加入 1 / 6样品量的 H : O : , 15 ℃ 放 置
4 8 h脱色 . 透析 、 浓缩 、 乙醇沉淀 , 乙醚洗 , 置 P : O 。真空干燥器 中 干 燥 , 得 深 黄 色
P S〔 I 〕 12 9 -
将 P S〔 工」1 2 9溶解于 25 o m L 水中 , 加 2肠 C T A B (澳代十六烷基三 甲胺 )至沉淀完拿;
本 文 2 0 5日年 6 月2 5收 至lJ
DOI : 10. 13885 /j . i ssn. 0455 -2059. 1990. 04. 019
1 14 兰州大学学报 (自然科学版 ) 26卷
摇匀 , 室温静止过夜 , 离心后沉淀用热水洗 3 次 , 加 ZM N a CI 2 5 o o m L 于沉淀中 , 60 ℃
解离 s h , 离心收集上清 , 透析 4 8 h , 浓缩后加 3 倍体积 95 % 乙醇沉淀 , 用无水乙醇 、 乙
醚洗沉淀 , 低温真空干燥得 P S 〔 且〕 5 . 3参
1
.
4 O E A E一纤维素一 5 2柱层析 t “ ’ 1 3 ’ D E A E一纤维素 (1C 一型 ) , 层析柱 ( 2 。 sc m
x 4 o e m )
, 预先用 o . IM N a C I 平衡 , 流速 2 2 m L / h , 将 P S〔亚」1 . 5 9 溶解于 Z o m L 热水
中 , 离心除去不溶物后上样 , 用 0 . 1对 N a CI 洗脱 , 分步收集 , 每管 5 。 s m L , 收集 H Z s O `
一蕙酮反应阳性部分 ( 4 9 . 5~ 1 49 m L ) , 透析浓缩 乙醇沉淀干燥后得 P S〔皿 〕 1 1 m g . 残留在
D E A E一纤维素上的多糖改用 。 。 l ~ 4M N a CI 进行直线梯度洗脱 , 收集 H : 5 0 ` 一 蕙酮反
应 阳性部分 ( 60 . 5一 1 70 。 s m L ) 。 透析浓缩 乙醇 沉 淀 后 干燥得 白色粉末状 P S〔丁 〕
3 1 o m g
。
1
.
5 均一性鉴定 “ “
2
.
5
.
1 S e p h a d e 、 G 一 2 5 0凝胶过滤 称取 P S〔W 〕 2 5 m g 溶解于 Z m L o 。 o 5M N a C I 中 , 上
于 S e p h a d e x G 一 2 5 0柱 ( Z e m X 4 5 e m ) , 用。 。 o 5M N a C I洗脱 , 流速 6 m L / h , 每管 收集
Z m L
, 用 H : 5 0 ` 一蕙酮法检测 。
1
.
5
.
2 纸层析 W h a t m a n N o . I 滤纸 ( s e m x Z o e m ) , 展开剂为正丁醇 : 浓氨水 :
水 二 6 0 : 4 0 : 5 (犷 /犷 ) ,室温展开 1 5 。 sc m , 吹干后用。 。 5肠甲苯胺蓝 乙醇液染色 , 95 肠
乙醇漂洗 .
1
。
5
。
3 醋酸纤维薄膜 电泳 电极缓冲液为 p H S 。 5 , 0 . 06 M 巴 比妥缓冲液 , 电压 2 0 OV ,
电流 。。 6 m A c/ m , 电泳时间为 45 m in , 取出膜凉干后 , 在 。。 5肠甲苯胺蓝乙 醇液中 染 色
10 m in
,在 乙醇 : 水 : 冰乙酸中漂洗至背景无 色 。
1
。
5
.
4 琼脂糖 电泳 用电极缓冲浓配成 0 . 5肠的琼脂糖 , 取 3 m L铺于 2 。 sc m x 7 c m 的载玻
片上 , 待 凝固后点样 . 电流强度开始为。 。 4 m人 c/ m , 电泳缓冲液为 p H S . 5 , o . 06 M 巴 比
妥 缓冲浓 . s m in 后加大为 0 . 6 m A / c m , 电泳 1 . 5 h , 用 0 . 1肠甲苯胺蓝 乙醇液染色 10 m in ,
用 乙酸 : 乙醇 : 水 = 1 : 50 : 50 (厂 /犷 ) 漂洗至背景无 色 。
1
。
6 分子量测定 `” ’ 采用凝胶过滤法 . S e p h a d e x G 一 2 0 0柱 ( 1 . s e m X 3 o e m ) , 预先
用 o . 0 5M N a C I 平衡 , 流速 7 。 s m L / h , 将 4 种 已知分子量的 D e xt ar n 标 准品 (分子量分
别为 1 X l o 4 , 4 火 1 0 4 , 7 X z o 4和 1 X l o “ ) 分别上样 , 分步收集 , 每管 3 m L , 用 H Z S O ` -
蕙酮法检测 . 求得厂 e分别为 5 2 。 3 m L , 3 8 . 5 m L 夕 3 0 。 4 m L 和 2 8 。 s m L . B j u e d e x t r a n
( M
r > 2 x 1 0
6
) 上柱 , 求得犷。为 2 。 s m L 。 按犷 e /犷。与 M r对数关系作图得标准曲线 。 最
后将 P S仁万 〕上样 , 求得犷e为 2 9 . 7 m L 。 查标准曲线得知 分子量 。
1
。 了 体内抗肿瘤试验 小白鼠由兰州大学生物园提 供 , 雌雄均有 , 体重平均 2 09 . 试验
组 9 只小白鼠 , 每只腋窝皮下注射 。。 Zm L约含2 x 1 0 6 5 一 1 80 腹水癌细胞 . 2 h4 后开始腹腔
注射 P S 〔卫 〕多糖 ( 50 m g / k g 。 d 一 ` )连续 12 d 。 对照组 9只小白鼠注射 等体积生理盐水 。 第 12 d
后将小白鼠拉椎处死 , 解剖称瘤重 , 与对照组比较 , 按下面公式计算抑制率 。
阅
抑制率 = 对照组瘤重 一 试验组瘤重
,
8 二叶捧多糖的部分理化性质
对照组瘤重
二叶薄多糖精品为乳 白色粉末 , 易溶于热水 , 一 有一定
4 期 孟延发等 : 二叶棒多糖的研究 11弓
睁 的粘度 , 不 溶于高浓度 乙醇 、 丙酮 、 乙醚等有机溶剂 ; 与 H : 5 0 ` 一 a 一茶酚反应 , 其界面 产生紫色环 ; 与K 工 一 工试剂呈阴性反应 ; 与 H : 5 0 ; 一咔哇试剂反应呈玫瑰色 ,在 5 3 0n m处有最大吸收 ; 与 H Z S O `一苯酚试剂反应后 ,特征吸收峰为 4 90n m , 与 H Z S O `一蕙酮试 剂反应后 , 特征吸收峰为 6 2 o n m ; 将样品点于滤纸上 , 用 S hc if f试剂染色呈玫瑰红 色 , 甲笨
胺蓝染色呈蓝色 ; 二叶棒多糖溶液可被 C T A B络合而沉淀 .
2 结果与讨论
二叶捧多糖 的分离纯化过程见下表 .
附表 二叶棒多糖的分离纯化过程
总 糖 含 全 多段率阶收
骤 G / g
拓 scI 为标 准 glc 为标准
· 糖原 为标准
据醛 酸
拓
蛋白含女
拓
核酸含全
书
水抽提 . 乙醉 沉
淀千燥得 P S〔 I 〕
C T A B络合 后 的
P S〔 l 〕
x
.
s g P S [ I 」经 D E
一 5 2后得主 要 成份
P S [万〕
.
2 4 6
。
7 9 5 4 7
。
5 5 4 。 3 5
。
6 8
5
。
3
O
。
3 1
4 4
。
2 6 8
。
0 1 6 0 7 4
。
0 7 2 。 0
2 1
。
0 6 9
。
0 1 5 6 ? O
。
4 7 4
。
0
从表 中分析结果表明通过 C T A B络合后的 P S〔 亚 〕组成 中不含蛋白质和核酸类物质 . 而 组
成 中富含有糖醛酸 , 因此我们认为此多糖是一种酸性杂多糖 , 可能是抗肿瘤 、 抗肝 炎病
毒的有效成分之一 。
P S〔五」经 D E A E一纤维素柱层析 , 多糖检测结果及洗脱曲线见图 A , 得到的 P S〔 l 〕
月乓 0 . 1 5
已
劝
6 2 9 5 139
f / m L
附图
A 。 。 I M N a C L洗脱曲线
一 1 苏
z 尸
层
t)
·
7 5乙
叱
Z
r闷日.助任\Q
1 3 8 1 7 1
V / m L
D E A E一纤 维素一 52 柱层析
B o
.
I M ~ 4 M N a CL直 线梯度洗脱 曲线
糖含 量 (一 . 一 ) : 以 半乳 糖为标准测 定的结果
蛋白含量 (一一 ) : 以 B S A为标准测定的结垠
1 1 6 兰州大学学报 (自然科学版 ) 幻卷
产量甚微 , 非主要成分 。 残留在 D E A E一纤维素柱上多糖部分用 。 . 1~ 4M N a CI 进行
直线梯度洗脱 , 用同样方法测多糖含量 , 其结果及洗脱曲线见图 B , 得 P S〔万 〕 , 其产量
为 P S〔皿 〕的 3 0倍 , 证明是 P S〔五 〕的主要组成成分 。 经分析结果表明糖含量及糖醛酸含量
基本上与 P S〔亚 〕接近 .
经 D E 一 52 柱层析得到的主要组分 P S〔万 〕, 再经 S e p h a de x G 一 1 50 凝胶过滤得单一洗
脱峰 。 经纸层析 、 醛酸纤维薄膜电泳和琼脂糖 电泳均为单一区带或单一斑点 。
采用凝胶过滤法测得二叶棒多糖的分子量为 79 0 0。 。小 白鼠体内试验结果表明二叶释
多糖对 S 一 1 8 。肉瘤细胞抑制率达 40 肠左右 .
至于二叶律多糖的结构及其结构和功能之间有何关系 , 抗肿瘤作用机理等 问题正在
研究 中 。
阅
参 考 文 献
1
2
5
D )
s h e 2
.
A N e w S p e e i f i e C o l o r R e a e t i o n o f H e x u r o n i e A e i d
.
J B C
,
1 9 4 7 , 1 6 7 : 1 8 9
K a y o k o F u k u d a e t a l
.
T h e P o l y s a e e h a r i d e f r o m L a m p t e r o m y e e s J a p o n i e u s
.
C h e m P h a r m B u l l
, 1 9 7 5 , 2 3 ( 9 )
: 1 9 5 5
刘京丽等 . 生物化学杂志 . 1 9 5 9 , 5 ( 1 ) : 3 3 ~ 3 8
张惟杰编 . 复合多糖生化研究技术 . 上海 : 上海科学技术出版社 , 1 9 8 7
A n d r e w s P
。
T h e G e l
一
f i l t r a t i o n B e h a v i o u r o f P r o t e i n s R e l a t e d t o T l e i r
M o l e e u l a r W
e i g h t s o v e r a W i d
e R a n g e
.
B i o e h e m J
, 1 9 6 5
, 9 6 : 5 0 5
-
八04
S t u d i e s o n P o l y s a e e h a r i d e f r o m O l d e n l a n d i a
D i f f u s a ( W i l l d
.
) R o x b
。
M
e n g Y e n f
a
H
u X i a o 夕。 M e行g X “ e g i n
( D
e P a rt m e n 七 o f B i o l o g y )
A b s t r a e t
F
r o m o l d e n l
a n d i a d i f f u s a (w i l l d二 ) R o x b , a p o l y s a e e h a r i d e 15 e x t r a e t e d
w i t h b o i l i n g w a t e r
。
T h e p r o t e i n a n d n u e l e i e a e i d i n t h e e x t r a e t a r e r e m o v e d
b y t r i e h l o r o a e e t i e a e i d a n d n
一
b u t a n o l
。
T h e P o 飞y s a e e h a r i d e i n t h e f i l t r a t e
p r e e i p i t a t e s f r a e t i o n a l l y w i t h a l e o h o l
。
T h e p r o d u e t i s t h e n f u r t h e r p u r i f i e d
b y C T A B a n d D E A E
一 e e l l u l o s e
一
5 2 e o l u m n e h r o m a t o g r a p h y
。
T h e p u r i f i e d
p o l y s a e e h a r i d e 15 s h o w n t o b e h o m o g e n e o u s o n S e p h a d e x G
一
1 5 0 g e l f i l t r a t i o n
p a p e r e h r o m a t o g r a p h y
, e e l l u l o s e a e e t a t e m e m b r a n e e l e e t r o p h o r e s i s a n d
a g a r o s e e l e e t r o p h o r e s i s
.
M o l e e u l a r W
e i g h t 7 9
, 0 0 0 15 o b t a i n e尽 b y S e p h a d e x
G
一 2 0 0 g e l f i l t r a t i o n
。
T h e s u g a r e o n t e n t o f t h e p u r i f i e d p o l y s a e e h a r i d e
15 6 9肠 a s g l u e o s e , 1 5 6肠 a s g a l a e t o s e a n d 7 0 . 4肠 a s g l y e o g e n 。 T h e g l u e u r o n i e
a e i d e o n t e n t o f t h e p u r i f i e d p o ly s a e e h a r i d e 15 7 4 肠 . T h e e x p e r i m e n t a t i o n
i n v i v o s h o w s t h a t t h i s p o l y s a e e h a r i d e h a s i n h i b i t i o n a e t i o n o n t h e e e l l s o f
t h e i m P l a n t e d t u m o r S a r e o m a
一
1 8 0
.
K e y w o r d s h e d y o t i s d i f f u s a
, p o ly s a e e h a r i d e r e s e a r e h e s
, p u r i f i e a t i o n
? f p o l y s a e e h a r i d e
之
场