全 文 ：第 31卷 第 12期
2013年 12月
河 南 科 学
HENAN SCIENCE
Vol.31 No.12
Dec. 2013
收稿日期：2013-08-19
基金项目：辽宁省重点实验室项目（2009S061）
作者简介：王晓炜（1977－），女，辽宁大连人，实验师，硕士，主要研究方向为细胞生物学研究 .
文章编号：1004-3918（2013）12-2170-04
细裂辽藁本愈伤组织培养及试管苗分化的研究
王晓炜 1， 孙 媛 2
（1. 大连医科大学 基础医学院形态实验室，辽宁 大连 116044；
2. 大连医科大学 基础医学院细胞生物学教研室，辽宁 大连 116044）
摘 要：为保护野生药用植物资源，以细裂辽藁本的茎段为材料，采用组织培养方法，进行了愈伤组织诱导培养、分
化培养，不定芽试管苗培养、试管苗生根继代繁殖培养，以及试管苗的移栽与定植的研究 . 结果证明：2，4-D 2.0 mg/L，
ZT 0.4 mg/L，6-BA 0.8 mg/L是愈伤组织诱导培养的适宜生长调节剂组合；NAA 0.05 mg/L与 ZT 0.6 mg/L是愈伤组
织不定芽分化培养的适宜生长调节剂组合；1/2MS＋蔗糖 16 g/L+NAA 0.1 mg/L+IAA 0.3 mg/L是试管苗繁殖培养的适
宜培养基 . 试管苗移栽成活率为 96.2%；定植成活率为 99.1%；定植的试管苗保持了野生细裂辽藁本的植物学性状 .
关键词：细裂辽藁本；愈伤组织；试管苗
中图分类号：S 682.3 文献标识码： A
The Callus Culture and Differentiation of Tube Seedlings with
Ligusticum jeholense Nakai et Kitag var tenuisectum
Wang Xiaowei1， Sun Yuan2
（1． Morphology Laboratory，Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian 116044，Liaoning China；
2． Department of Cell Biology，Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian 116044，Liaoning China）
Abstract：For the protection of the wild resources，tissue culture methods were used to study the induction culture
and differentiation culture of callus，adventitious bud of test－tube seedling culture，subculture，transplanting and
colonization． The results showed that 2，4－D 2．0 mg/L，ZT 0．4 mg/L and 6－BA 0．8 mg/L was suitable growth regulator
group of induction of callus culture；NAA 0．05 mg/L and ZT 0．6 mg/L was appropriate growth regulator group of
differentiation culture；1/2MS＋ sucrose16 g/L＋NAA 0．1 mg/L＋IAA 0．3 mg/L was the suitable culture medium to
propagation of test－tube seedling． The survival rate of test－tube seedling was 96．2％，and the colonization survival
rate was 99．1％． The colonization of test－tube seedling maintained all biological characters of wild of cracking of
Ligusticum jeholense Nakai et Kitag var tenuisectum．
Key words：Ligusticum jeholense Nakai et Kitag var tenuisectum； tissue culture； tube seedlings
细裂辽藁本（Ligusticum jeholense Nakai et Kitag var tenuisectum）是辽藁本的变种，属于伞形科藁本属多
年生草本植物 . 生长于山坡、林地、林缘、林下及阴湿地等环境中，在辽宁地区的凌源、本溪、桓仁和长海等
地有分布[1] . 同辽藁本一样，细裂辽藁本的根作为中药用，具有祛风解毒、散寒止疼等功效，能治风寒头疼、
颠顶疼痛、风湿痹痛、风寒泄泻、周身疼痛、疥癣、腹痛等疾病[2] . 由于藁本属中的多种植物都具有重要的药
用功效，多年来人们已经对其化学成分进行了分析研究[3-4] . 又因为辽藁本与细裂辽藁本具有多种相同的药
用价值，因此，人们在大量采集辽藁本作药用时，也一并采集细裂辽藁本作药用 . 由此使这一分布和数量都
很少的辽藁本变种药用植物的野生资源遭到了严重破坏 . 现在，细裂辽藁本在大连地区仅在长海县有分布，
已经处于濒危状态 . 为了保护这一野生资源，对细裂辽藁本进行了愈伤组织培养及试管苗分化的研究，虽
然已有伞形科植物组织培养研究的报道[5]，但迄今未见藁本属植物组织培养研究的报告 .
DOI:10.13537/j.issn.1004-3918.2013.12.030
2013年 12月
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
2010年 6月上旬，将大连市大长山岛林缘旁生长旺盛的细裂辽藁本植株采回实验室，把叶片和根去掉，
将嫩茎在 6 mg/L的庆大霉素溶液浸泡约 2 min取出，用吸水纸吸干附着的溶液，装到塑料袋中，放到光照强
度 1000 Lx左右的条件下保存 8 h后，转移到超净工作台上作为本研究的实验材料 .
1.2 材料灭菌
将经过前处理的嫩茎转移到超净工作台后，放于磨口广口瓶中用无菌水浸泡 10 min，再用无菌水洗涤
2次并沥干，接着，将材料浸入 75%的乙醇，振荡灭菌 8~10 s后，迅速用无菌水洗涤 2次，再将材料浸入 0.04%
的 HgCL2溶液灭菌 9 min，再用无菌水洗涤 7次，至此就获得细裂辽藁本的无菌嫩茎 .
1.3 培养条件
以 MS或 1/2MS为基本培养基，培养基的 pH5.8；恒温 26 ℃培养；光照 2800 Lx；不定芽分化繁殖培养的
培养基加蔗糖 35 g/L，不定芽繁殖培养基加蔗糖 20 g/L，生根培养基加 16 g/L；琼脂固体培养基胨力强度为
250 g·cm2 . 培养材料均在加棉塞封口的 100 mL锥形瓶中培养，其他培养条件见参考文献［6］.
1.4 试验方法
1.4.1 不同生长调节剂组合对愈伤组织诱导培养的影响 将已经灭菌的茎段端部切掉 0.4 cm左右，再将其切
成长约 0.5 cm茎段，作为愈伤组织诱导培养的材料 . 以 MS为愈伤组织诱导培养的基础培养基，向其中分
别添加以下 3种不同浓度生长调节剂组合：2，4-D 1.0，2.0，3.0 mg/L，ZT 0.4，0.8 mg/L，6-BA 0.8，1.2 mg/L，进
行不同生长调节剂对愈伤组织诱导培养的影响试验 . 此试验间隔 30 d，试验重复 2次 . 第一次试验每种培
养基接种培养 30个茎段，重复试验每种培养基接种培养 50个茎段 .
1.4.2 不同生长调节剂组合对愈伤组织分化培养的影响 将由茎段培养的愈伤组织用镊子在培养瓶内分散
为较均匀的、大小约为 0.3 cm的块状后，在以 MS+AgNO3 2.0 mg/L为基础培养基，并向其中分别添加不同浓
度生长调节剂的培养基上，进行不同浓度生长调节剂组合对愈伤组织分化培养的影响试验 . 其生长调节剂
组合如下：NAA 0.05，0.1，0.2 mg/L，KT 0.6，1.2 mg/L，或者 ZT 0.6，1.2 mg/L . 此试验间隔 50 d，重复 2次 . 每
次试验每种培养基接种 80块愈伤组织 .
1.4.3 不同培养基对不定芽繁殖培养的影响 将愈伤组织分化培养的不定芽用无菌手术剪子从愈伤组织块
上剪下，再分别接种到 8种不同的培养基上，进行不同培养基对不定芽繁殖培养的影响试验，试验重复 2次 .
每次试验每种培养基培养 100个不定芽 . 获得适宜的不定芽繁殖培养基后，再在适宜的培养基上进行继代
繁殖培养 . 8种不同的培养基如下：①MS+AgNO31.0 mg/L+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.1 mg/L+蔗糖 20 g/L；②MS+
AgNO31.0 mg/L+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 20 g/L；③MS+AgNO31.0 mg/L+ZT 0.6 mg/L+IAA 0.1 mg/L+蔗
糖 20 g/L；④MS+AgNO31.0 mg/L+ZT 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 20 g/L；⑤MS+AgNO31.0 mg/L+6-BA 0.6 mg/L+
IAA 0.05 mg/L+蔗糖 20 g/L；⑥MS+AgNO3 1.0 mg/L+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖 20 g/L；⑦MS+
AgNO31.0 mg/L+ZT 0.6 mg/L+IAA 0.05 mg/L+蔗糖 20 g/L；⑧MS+AgNO31.0 mg/L+ZT 0.6 mg/L+NAA 0.05 mg/L+
蔗糖 20 g/L .
1.4.4 不定芽生根培养及试管苗生根继代繁殖培养 将基部连在一起的不定芽切割成单个不定芽，接种到
以 1/2MS＋蔗糖 16 g/L 为基础培养基，分别添加浓度为 0.05，0.1 和 0.2 mg/L NAA 与浓度为 0.05，0.1，0.3，
0.6，0.9 mg/L的 IAA组合的培养基上，进行不定芽的生根培养试验 . 在这一由 15个处理组成的试验中，每
种处理以 50个不定芽为材料，试验重复 2次 .
1.4.5 试管苗移栽与定植 当第 5次生根继代繁殖培养的试管苗培养到 27～29 d时，选取 470株在培养瓶
中培养的试管苗，由培养室转移到温室中，敞开培养瓶口炼苗 3 d后，再用镊子拔出试管苗，用浓度为 2 mg/L
的庆大霉素溶液洗净根部的培养基，马上移栽到上半层为干净河沙、下半层为肥沃树下土的营养钵中 . 移
栽后除要浇足水分之外，前 10 d要保持 18 ℃以上的温度、85%以上的湿度、用遮阴网遮蔽直射光的环境条
件 . 继而温室环境进行管理 .
2012年 5月上旬，把在温室营养钵中移栽成活无损伤的 450株试管苗，定植于大连郊区山下的乔木林
旁 . 定植 1个月内除了浇 2次透水和除草外，后期生长环境按照野生环境进行管理 .
王晓炜，等：细裂辽藁本愈伤组织培养及试管苗分化的研究 2171- -
第 31卷 第 12期河 南 科 学
2 结果与分析
2.1 不同生长调节剂组合对愈伤组织诱导培养的影响
接种培养 55 d后，统计观察 2次重复试验的平均结果在表 1中显示 . 在 2，4-D 2.0 mg/L，ZT 0.4 mg/L，
6-BA 0.8 mg/L这种组合时茎段的愈伤组织诱导率最高，达到了 77.5%，并且观察表明，在这种组合的生长调
节剂的培养基上，愈伤组织外观上长势好 . 在对培养过程的观察还表明，在这种生长调节剂组合培养基上培
养生长的愈伤组织长得快且大，诱导培养生长的愈伤组织呈不规则的块状，其 2/3左右生长在培养基上部，约
1/3生长在培养基中，愈伤组织外观上为嫩绿色 . 以上结果说明：2，4-D 2.0 mg/L，ZT 0.4 mg/L，6-BA 0.8 mg/L
这3种浓度的生长调节剂组合是细裂辽藁本茎段愈伤组织诱导培养的适宜生长调节剂组合 .
表 1 不同生长调节剂组合对愈伤组织诱导培养的影响
Tab.1 The effect of different growth regulators on callus’s induction
注：++长势好；+长势一般；-不生长 .
2.2 不同生长调节剂组合对愈伤组织分化培养的影响
愈伤组织块接种培养后 60 d，统计观察 2次重复试验的平均结果在表 2中显示 . 在 NAA 0.05 mg/L与
ZT 0.6 mg/L的生长调节剂组合的培养基上愈伤组织的分化率最高，达到了 94.38%，分化的不定芽数最多，
每块培养的愈伤组织能分化出 6.2个不定芽，并且分化的不定芽茎较粗、叶片多而伸展，外观上长势好 . 对
培养过程的观察还表明，在这种生长调节剂组合培养基上培养的愈伤组织，培养到第 7 d时即可见在愈伤组
织快的上部开始分化出不定芽，为分化最早的培养基；同时，在这种培养基上分化培养的不定芽培养到 60 d
时的高度为 0.5~1.8 cm，也是在所试验生长调节剂组合中分化不定芽长得最高的培养基 . 以上结果说明：
NAA 0.05 mg/L与 ZT 0.6 mg/L这 2种浓度的生长调节剂组合是细裂辽藁本茎段愈伤组织不定芽分化培养
的适宜生长调节剂组合 .
表 2 不同生长调节剂组合对愈伤组织分化培养的影响
Tab.2 The effect of different growth regulators on callus’s differentiation
注：++长势好；+长势一般；-不生长 .
2,4-D/（mg·L-1） ZT/（mg·L-1） 6-BA/（mg·L-1） 接种茎段个数 愈伤组织诱导数 愈伤组织诱导率/% 愈伤组织长势
1.0 0.4 0.8 80 0 0 -
1.0 0.4 1.2 80 0 0 -
1.0 0.8 0.8 80 0 0 -
1.0 0.8 1.2 80 0 0 -
2.0 0.4 0.8 80 62 77.50 ++
2.0 0.4 1.2 80 37 46.25 +
2.0 0.8 0.8 80 21 26.25 +
2.0 0.8 1.2 80 15 18.75 +
3.0 0.4 0.8 80 53 66.25 +
3.0 0.4 1.2 80 16 20.00 +
3.0 0.8 0.8 80 15 18.75 +
3.0 0.8 1.2 80 8 10.00 +
NAA/（mg·L-1） KT/（mg·L-1） ZT/（mg·L-1）接种愈伤组织块数 愈伤组织分化数 愈伤组织分化率/%
0.05 0.6 0 160 0 0
0.05 1.2 0 160 0 0
0.1 0.6 0 160 0 0
0.1 1.2 0 160 0 0
0.2 0.6 0 160 0 0
0.2 1.2 0 160 0 0
0.05 0 0.6 160 151 94.38
0.05 0 1.2 160 104 65.00
0.1 0 0.6 160 110 68.75
0.1 0 1.2 160 32 20.00
0.2 0 0.6 160 18 11.25
0.2 0 1.2 160 11 6.88
平均分化不定芽个数/块
0
0
0
0
0
0
6.2
2.3
4.1
1.8
1.4
1.2
分化不定芽长势
-
-
-
-
-
-
++
+
+
+
+
+
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2.3 不同培养基对不定芽繁殖培养的影响
培养至 55 d时，统计观察 2次重复试验的平均结果表明，在②号培养基上不定芽繁殖培养的效果最好，不
仅分化率为 97.5%，每个分化培养的不定芽能分化出 6.3个基部连在一起的不定芽，并且 2次重复试验的结果
几乎一致. 把在②号培养基上由不定芽分化培养的不定芽再剪成独立的不定芽，并再接种到②号培养基上进
行不定芽继代繁殖培养，每次试验连续繁殖培养 4代. 结果证明：经过 50 d为一个周期的培养，就会繁殖出一
代平均高度为 1.6 cm、繁殖系数为 6.3个不定芽、外观生长旺盛的不定芽. 以上结果说明：MS+AgNO3 1.0 mg/L+
6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 20 g/L这种培养基是细裂辽藁本不定芽分化繁殖培养的适宜培养基.
2.4 不定芽生根培养及试管苗生根继代繁殖培养
对 2次重复试验的培养过程统计结果证明：在 0.1 mg/L NAA与 0.3 mg/L的 IAA组合的培养基上进行培
养，33 d为 1个生根培养周期，培养的不定芽生根率为 97%，平均每株试管苗生根 8.1条、株高 4.7 cm，并且
外观上试管苗生长旺盛、根系洁白 . 将 2次试验的第一代生长旺盛的试管苗切割为具有 2个叶片的茎段，
再接种到相同生长素组合的培养基上进行试管苗生根继代繁殖培养 . 2次试验各分别继代繁殖培养 5代，
前 4代培养 100个茎段，第 5代培养 500个茎段 . 观察统计的结果表明，继代繁殖培养的培养周期缩短为
31 d，试管苗长势与以不定芽为材料、经过 33 d为一个培养周期培养生长的试管苗一致 . 其平均的生根率
达到 98.4%，每次继代的繁殖系数为 3.1 . 由此说明，0.1 mg/L NAA与 0.3 mg/L的 IAA 组合使用也是试管苗
生根继代繁殖的适宜生长素组合 . 也就是说，1/2MS＋蔗糖 16 g/L+NAA 0.1 mg/L+IAA 0.3 mg/L这种培养基
是细裂辽藁本试管苗繁殖培养的适宜培养基 .
2.5 试管苗的移栽与定植
移栽 45 d后移栽的 470株试管苗成活了 452株，成活率为 96.2% .
定植 30 d统计表明：定植的 450株试管苗，成活 446株，成活率为 99.1% . 定植成活的试管苗当年 7月
上旬进入旺盛生长状态 . 次年 8月开花，9月结果，与同期播种的实生苗相比，试管苗明具有明显的生长旺
盛、开花时间延迟 20 d左右的特点，但试管苗保持了野生细裂辽藁本的所有植物特征 .
3 讨论
目前，已有野生药用植物组织培养及无性系建立[7]和再生体系建立研究的报道[8-9]，并有川芎等伞形科药
用植物器官再生植株研究的报道[10]，但国内外迄今未见藁本属植物组织培养研究的报告 . 研究者以细裂辽
藁本的嫩茎为材料，完成了其试管苗培养的研究，并且培养的试管苗保持了野生细裂辽藁本的植物学性状 .
这说明本研究所建立的技术，完全可用于细裂辽藁本的种质保存、基因库的建立以及人工栽培细裂辽藁本对
种苗的需求 .
定植的试管苗出现了花期延迟 20 d左右的特点，产生这种特点主要与以下原因有关：一是试管苗是在
含较高浓度生长素的培养基上生长的，当这种试管苗定植后，植株体内仍然含有较高浓度的生长素 . 生长
素的后效作用促进了营养生长，抑制了生殖生长；二是像大多数试管苗具有较长的童龄期一样[11]，裂叶辽藁
本的试管苗童龄期也较长，从而也推迟了开花时间 .
参考文献：
［1］ 李书心． 辽宁植物志［M］． 上册. 沈阳：辽宁科学技术出版社，1988：1322－1323．
［2］ 南京中医药大学． 中药大辞典［M］． 下册. 上海：上海技术出版社，2006：3772－3775．
［3］ 张金兰，周志华，陈若云，等． 藁本药材化学成分质量控制及药效学研究［J］． 中国药学杂志，2002，37（9）：654－657．
［4］ 张 博． 辽本藁化学成分研究［D］． 长春：长春中医药大学，2009．
［5］ 张家菁，于元杰． 伞形科药用植物组织培养的研究进展［J］． 特产研究，2011（1）：63－66．
［6］ 温银元，冯文新，尹美强，等． 不同激素对补血草器官分化的影响［J］． 山西农业科学，2013，41（2）：115－115．
［7］ 赵丹琦，黄光霁，高弘扬，等． 蛇床组织培养及无性系的建立［J］． 山西农业科学，2012，40（11）：1136－1138．
［8］ 吴丽巍，杨 阔，陶 双，等． 东北点地梅下胚轴再生体系的建立［J］． 山西农业科学，2012，40（11）：1136－1138．
［9］ 成智博，钱昱臻，曲艺姣，等． 汉城细辛试管苖繁殖的研究［J］． 河南科学，2013，31（9）：1369－1371．
［10］ 王跃华，雁 霞，王晓蓉，等． 川芎嫩叶片植株再生的研究［J］． 西南农业学报，2009，22（4）：1057－1060．
［11］ 安利佳，姜长阳． 植物组织培养导论［M］． 大连：辽宁师范大学出版社，1996：128－129．
（编辑 郑壮丽）
王晓炜，等：细裂辽藁本愈伤组织培养及试管苗分化的研究 2173- -