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满山红中黄酮类成分液相色谱指纹图谱研究



全 文 :DOI:10. 13463 / j. cnki. cczyy. 2016. 04. 017
满山红中黄酮类成分液相色谱指纹图谱研究
李红梅1,佟志军2* ,孙 丽2,王安波2,张 雷3
(1.通化东宝药业股份有限公司,吉林 通化 134123;2.吉林天力泰药业有限公司,吉林 长白 134400;
3.长春中医药大学 长春 130117)
摘要:目的 利用反相高效液相色谱法建立满山红中黄酮类成分的指纹图谱,为科学评价及有效控制满山
红药材质量提供新的方法。方法 分析 10 个不同产地满山红样品的色谱图,采用国家食品药品监督管理局推
荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版)”计算处理,建立由 18 个共有峰及其他指纹峰组成对照
指纹图谱,确定 2 个主要指纹峰。结果 通过夹角余弦法和相关系数法计算满山红 10 个样品与对照指纹图谱
的相似度,得到满意结果。结论 所建立的对照指纹图谱可以用来区别不同产地满山红药材的优劣,为进一步
控制满山红质量提供依据。
关键词:高效液相色谱;满山红;指纹图谱;质量控制
中图分类号:R284. 3 文献标志码:A 文章编号:2095 - 6258(2016)04 - 0708 - 03
基金项目:吉林省科学技术厅项目(20130727101YY)。
作者简介:李红梅(1970 -) ,女,大学本科,副高级检验师,主要从事中药化学成分及质量标准研究。
* 通信作者:佟志军,电话 - 15844955777,电子信箱 - jlcbsyy@ 126. com
Rhododendron dauricum L. flavonoids ingredients in HPLC fingerprint
LI Hongmei1,TONG Zhijun2* ,SUN li2,WANG Anbo2,ZHANG Lei3
(1. The Tonghua Dongbao Pharmaceutical co.,LTD.,Tonghua 134123,Jilin Province,China;
2. Tianlitai Pharmaceutical co.,LTD.,Changbai 134400,Jilin Province,China;
3. Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)
Abstract:Objective The chromatographic fingerprint was established for evaluating and controlling the quality
of Rhododendron dauricum L. by reversed-phase high performance liquid chromatog-raphy (RP-HPLC). Methods
Ten different original samples were analyzed,and the chromatographic fingerprint of Rhododendron dauricum L. was
constructed with 18 fingerprint peaks,among which peaks were common fingerprint peaks and 2 main compounds were
identified using the Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine
(Version 2004A)recommended by State Food & Drug Administration. Results Methods of vectorcosine and correla-
tion coefficient were used to calculate the similarity of ten samples,and sat-is factory results were obtained. Conclu-
sion The chromatographic fingerprint can be used to differentiate the raw materials from different sources and be
served as a powerful tool for the further quality control of Rhododendron dauricum L.
Keywords:Liquid chromatography (LC) ;Rhododendron dauricum L;fingerprint;quality control
满山红为杜鹃花科植物兴安杜鹃 Rhododendron
damricum L. 的干燥叶。主要分布于黑龙江、吉林、内
蒙古。满山红主要有效成分为挥发油和黄酮类成分,
后者主要有金丝桃苷、杜鹃素、山奈酚、槲皮素杨梅
酮、黄梅素等。具有止咳、祛痰作用[1]。目前《中国
药典·1 部》满山红项下只有鉴别和测定杜鹃素含量
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(大于 0. 08%)[2],这种单一成分的检测并不足以表
明药材质量。中药指纹图谱是控制中药材质量的有
效方式之一,已日益成为国内外广泛接受的中药质量
评价模式[3]。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 高效液相色谱仪 A111iane2695(Waters
公司) ;AG245 型电子天平(瑞士梅特勒公司) ;
SK3200 型超声波清洗仪(上海科导超声有限公司)。
1. 2 药品与试剂 金丝桃苷,批号:141211,供含量
测定用,购于上海融禾医药科技有限公司;杜鹃素,批
号:1108-2006041,供含量测定用,购于中国食品药品
检定研究院。满山红叶于 2014 年 9 月末—10 月初
采于黑龙江省和吉林省不同 10 个地区。经长春中医
药大学鉴定教研室鉴定为兴安杜鹃叶。甲醇、石油醚
(30 ~ 60 ℃)、乙酸乙酯、乙醇均为分析纯。甲醇、乙
腈为色谱纯(美国 Fisher公司) ;乙酸为色谱纯(美国
Fedia公司) ;水为哇哈哈纯净水。
2 方法与结果
2. 1 色谱分析 Weters Cortees C18柱(100 mm ×
4. 6 mm,2. 7 μm) ,以甲醇为流动相 A,以 0. 3%醋酸溶
液为流动相 B,梯度洗脱:0 ~ 15 min,15% A ~ 25% A,
30 ~50 min,25%A ~45%A,60 ~ 70 min,45%A ~ 85%
A,85 ~90 min,85%A ~ 100%A,流速:0. 6 mL /min;柱
温:30 ℃;检测波长:300 nm。理论板数按杜鹃素峰
计应不低于 5 000。
2. 2 参照物溶液的制备 取杜鹃素对照品和金丝桃
苷对照品适量,精密称定,分别加甲醇制成每 1 mL含
杜鹃素 0. 52 mg、金丝桃苷 0. 59 mg的溶液,即得。
2. 3 供试品溶液的制备 取满山红细粉约 2 g,精密
称定,置具塞锥形瓶中,加 60%甲醇 70 mL,超声处理
(功率 250 W,频率 33 kHz)40 min,滤过,用 60%甲醇
洗涤滤渣,洗液并入滤液中,滤液蒸干,残渣加水
30 mL,转移置分液漏斗中,用石油醚(30 ~ 60 ℃)
30 mL提取,弃去石油醚,用乙酸乙酯提取 3 次(30、
25、25 mL) ,合并提取液,残渣用甲醇溶解转移至
25 mL量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,即得。
2. 4 测定 精密吸取对照溶液及供试品溶液各10 μL,
注入液相色谱仪,测定,记录 90 min色谱图,即得。
2. 5 方法学考察
2. 5. 1 精密度试验 取同一批样品,按供试品溶液制
备方法制成供试品溶液,连续进样 6 次,记录色谱图。
结果表明各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的
RSD分别在 1%和 5%以内,说明精密度良好。
2. 5. 2 重复性试验 取同一批样品,平行制备 6 份
供试品溶液,连续进样 6 次,记录色谱图,结果表明各
主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD分别
在 2%和 5%以内,说明重复性很好。
2. 5. 3 稳定性试验 取供试品溶液,分别在 0、2、8、
16、24 h进样,记录色谱图,结果表明各主要色谱峰相对
保留时间和相对峰面积的 RSD分别在 1%和 5%以内,
说明供试品溶液中成分在 24 h内是稳定的。
2. 6 满山红中黄酮类成分指纹图谱的建立 在优化
的色谱条件,对 10 个不同产地满山红药材供试品溶
液进行 HPLC 测定,记录 HPLC 色谱图。将 10 批样
品的指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色
谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A 版) ,生成
指纹图谱共有模式。在 90 min 内出现 18 个共有峰,
通过与对照品的 HPLC色谱比较,确定 8 号峰为金丝
桃苷、16 号峰为杜娟素峰,以杜娟素峰为参照峰,即 S
峰,依次标记为 1 ~ 18。
满山红中黄酮类成分共有模式指纹图谱,见图 1。
图 1 满山红黄酮类成分共有模式指纹图谱
对照品的 HPLC色谱图,见图 2。
图 2 前峰为“金丝桃苷”,后峰为“杜鹃素”
特征指纹峰的共有模式的 10 批供试品的叠加
图,见图 3。
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图 3 10 批供试品的叠加图
2. 7 不同产地的满山红药材中黄酮类成分相似度比
较 以共有模式作为对照指纹图谱,采用“中药色谱
指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A 版)对 10 批
不同产地样品指纹图谱进行相似度评价,利用夹角余
弦法和相关系数法计算每个样品与基本样本,得到每
个样品的色谱与对照指纹图谱的相似度,结果 10 批
满山红药材大部分指纹图谱的相似度良好,均在0. 90
以上,符合要求。这表明存在这种共有模式基础上的
个体差异是常见现象,因为药材生长过程中受多因素
影响,因此需要对药材进行规范化种植,保证药材质
量的稳定性。
3 小结
首先考察回流法和超声法,结果二者指纹图谱相
似,但回流法供试品中叶绿素多,故采用超声法。其
次考察提取溶剂:甲醇和乙醇,结果甲醇提取供试品
溶液色谱峰多,叶绿素少,又进一步考察甲醇浓度及
甲醇用量,最终确定 60%甲醇,超声处理 40 min,用
量为 70 mL为宜。本试验选用 3 个公司反相 C18柱,
最终选择 Weters Cortees C18柱(100 mm × 4. 6 mm,
2. 7 μm)色谱柱分离度较好,峰谱信息丰富,保留时
间适中。实验中分别对乙腈-0. 3%醋酸水溶液、乙
腈-水溶液、甲醇-0. 3%醋酸水溶液等流动相系统进
行梯度洗脱,结果表明,后者分离效果好。实验中对
20、30、35 ℃ 3种柱温进行选择,结果选择柱温30 ℃为
宜。流速考察了 0. 5、0. 6、0. 8 mL /min 3 种流速,结果
显示流速为 0. 6 mL /min时,各色谱峰分离度较好。
对不同产地满山红药材中黄酮类成分的指纹图
谱分析可以看出:共有峰的相对保留时间非常接近,
RSD 很小(1%) ,但相对峰面积相差较大,RSD 为
5%,即不同产地满山红药材中总黄酮的含量差异较
大,为保证药材质量,应建立药材栽培基地。
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2005:124. (收稿日期:2015 - 12 - 28
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2. 2. 6. 5 回收率试验 取已知含量的样品 20 片,除
去包衣,精密称定,研细,取约 1. 0 g,精密称定,加入
对照品溶液,按 2. 2. 3 方法进行测定,回收率平均值
为 97. 5%,RSD值为 2. 95%,证明此方法可行。
3 小结
采用高效液相色谱法测定补骨脂素、异补骨脂素
的总和,实验中进行了系统适用性实验,包括不同色
谱柱、不同流动相、不同流速等条件,表明在一定实验
条件下测定结果没有显著性差异,实验方法稳定,可
靠,能够控制制剂的内在质量。
参考文献:
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