全 文 ：中国药房 2010年第21卷第47期 China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 47
加入WTO，对中药制剂发展来说，需在继承传统制剂的基础
上，研究发展新剂型，提高中药制剂的科技含量，逐步缩小与
西药制剂的差距，提高中药的竞争力。目前，国家正大力提倡
和促进中药现代化的发展，中药制剂具有广阔的发展前景[7]。
21世纪是以现代科学技术为核心的知识经济逐步占主导
地位的世纪。中药制剂的发展是以现代科技革命为基础，并
将随着高分子化学、医学、生物学等学科以及分析化学和机械
工业的发展而发展。应充分发挥学科结合的优势，不断创新，
不断发展，运用现代科学技术理论和方法，加快我国药物制剂
的发展，推动中药新药的发现和研究，加速我国中药现代化、
国际化的进程，造福于人类。
参考文献
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（收稿日期：2009-12-23 修回日期：2010-07-14）
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·中药研究·
半边旗提取物5F-Na盐溶液的制备及体外抑癌作用研究Δ
吴科锋 1＊，吕应年 1，刘 义 1，李 立 1，GeorgeG. Chen2，赖宝山 2，梁念慈 3（1.广东天然药物研究与开发实验室，湛
江市 524023；2.香港中文大学外科学系，香港特别行政区 999077；3.广东医学院生物化学和分子生物学研
究所，湛江市 524023）
中图分类号 R285；R283 文献标识码 A 文章编号 1001-0408（2010）47-4419-03
摘 要 目的：制备5F-Na盐，并观察其对肺癌细胞株NCL-H460和肝癌细胞株BEL-7402的杀伤作用。方法：加入0.5 mol·L-1
NaOH使半边旗提取物5F完全溶解，稀HCl调节pH值为7.4，加入磷酸盐缓冲液使其pH值稳定，高效液相色谱法测定5F-Na盐溶
液中5F的含量。通过MTT法检测所制备5F-Na盐溶液对肺癌细胞株NCL-H460和肝癌细胞株BEL-7402的杀伤作用。结果：所
制备5F-Na盐溶液中5F为标示量的（100.51±2.18）％，其对NCl-H460细胞株24、48、72 h的 IC50分别为23.7、14.2、7.0 μg·mL-1，对
BEL-7402细胞株24、48、72 h的 IC50分别为157.3、41.5、21.0 μg·mL-1。结论：本研究制备的5F-Na盐溶液能有效抑制癌细胞株生
长增殖。
关键词 半边旗；5F-Na盐溶液；制备；抗肿瘤
Preparation of 5F-Na Solution and Its Inhibitory Effect on Cancer Cells in Vitro
WU Ke-feng，LV Ying-nian，LIU Yi，LI Li（Guangdong Key Lab for Research and Development of Natural
Drugs，Zhanjiang 524023，China）
GeorgeG. Chen，LAI Bao-shan（Dept. of Surgery，The Chinese University of Hong Kong，Shatin，NT，Hong-
Kong，China）
LIANG Nian-ci（Institute of Biochemistry and Molecular Biologry，Guangdong Medical College，Zhanjiang
524023，China）
ABSTRACT OBJECTIVE：To prepare 5F-Na solution and to observe the cytotoxicity of it on lung cancer NCL-H460 and hepa-
tocellular carcinoma BEL-7402 cells. METHODS：5F dissolved in 0.5 mol·L-1 NaOH，pH value was adjusted to 7.4 by diluted
HCl，phosphate buffer solution was added to keep the of stability of pH value. The content of 5F in 5F-Na solution was deter-
mined by HPLC. The cytotoxicity of 5F-Na solution on NCL-H460 and BEL-7402 was investigated by MTT assay. RESULTS：
The labeled amount of 5F in 5F-Na solution was（100.51±2.18）％. After treated with 5F-Na solution for 24 h，48 h，72 h，the
IC50 of lung cancer NCL-H460 was 23.7 μg·mL-1，14.2 μg·mL-1，7.0 μg·mL-1 respectively，and the IC50 of hepatocellular carcino-
ma BEL-7402 was 157.3 μg·mL-1，41.5 μg·mL-1，21.0 μg·mL-1. CONCLUSION：5F-Na solution could inhibit the growth of
lung cancer NCI-H460 cells and hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells effectively.
KEY WORDS Pteris semipinnata；5F-Na solution；Preparation；Antitumor
Δ国家自然科学基金资助项目（39870900）；香港科技创新署粤港
合作计划项目（GHP/ 022/06）
＊助理研究员，硕士。研究方向：抗肿瘤生化药理。电话：
0759-2388405。E-mail：winvee@gdmc.edu.cn
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China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 47 中国药房 2010年第21卷第47期
半边旗（Pteris semipinnata L.，PSL）属凤尾蕨科植物，广
泛分布于南方各省，民间常用于治疗蛇伤、外伤出血、菌痢、肠
炎、肝炎等。本课题组在筛选抗肿瘤植物药时发现，半边旗的
乙醇和水提取物显示出良好的体内、外抗肿瘤活性[1，2]；通过进
一步分离纯化出二萜类化合物 5F（化学结构名为 11α-羟
基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸），发现其对多种癌细
胞均有不同程度杀伤作用[3]。但该化合物难溶于水，为将来临
床应用带来极大的困难，因此如何增加该化合物水溶性是我
们所必须解决的问题。通常增加化合物水溶性有加入表面活
性剂进行助溶、使化合物成盐或做成包合物等方法[4，5]。从 5F
的结构上看其存在一个羧基，因此将其做成盐溶液的方法简
单易行。
1 仪器与材料
1.1 仪器
LC-1200型高效液相色谱（HPLC）仪（美国Agilent公司）；
磁力搅拌器（上海医械专机厂）；320-S型 pH计（瑞士Mettler
Toledo公司）；ELX 800型酶标仪（美国Bio-Tek公司）。
1.2 试药
二萜类化合物5F样品及5F标准品（含量：＞99％）均由广
东天然药物研究与开发实验室提供；RPMI-1640培养基（美国
Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青工程有限公司）；甲醇为色
谱纯，其余试剂均为分析纯。
1.3 细胞株
肺癌细胞株NCL-H460和肝癌细胞株BEL-7402由广东
天然药物研究与开发实验室保存。
2 方法与结果
2.1 处方筛选
2.1.1 成盐剂的选择：分别比较氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠
等几种成盐剂与5F在水中的反应情况。结果表明，5F几乎不
与碳酸氢钠、碳酸钠发生反应，因此只能使用氢氧化钠与之反
应，但反应过程不易控制，滴加时需小心谨慎。
2.1.2 pH范围的选择：由于氢氧化钠的碱性很强，反应溶液
pH值偏高，易发黄变色。因此以适量稀HCl回调使 pH值至
7.4左右，加入与此 pH值相当的磷酸盐缓冲液（PBS）使其稳
定。
2.2 5F-Na盐溶液的制备
精密称取5F 0.50 g，置于50 mL烧杯中，加20 mL 0.1 mol·
L-1 PBS，磁力搅拌器搅拌，边搅拌边滴加 1.0 mol·L-1 NaOH至
5F完全溶解，用适量稀HCl回调，至 pH值为 7.4左右，用 PBS
定容至50 mL，分装。所制备的5F-Na盐溶液为无色透明澄清
液体，其标示量为10 mg·mL-1。
2.3 HPLC分析
5F-Na盐溶液HPLC图中的物质峰保留时间，与标准品
5F完全相同；且在同一浓度下，进样相同体积，峰面积基本相
当，证明5F-Na盐溶液中主要成分仍为5F。色谱见图1。
2.4 标准曲线的制备
精密称取5F标准品，用甲醇溶解，配成浓度为1 mg·mL-1
的贮备液。吸取该贮备液，用甲醇稀释成5、10、20、40、80、160
μg·mL-1系列浓度的标准品溶液，按上述色谱条件进行测定。
以峰高（Y）为纵坐标，对应的浓度（X）为横坐标进行，线性回
归，得回归方程为Y＝578.241 91X+ 2.500 22（r＝0. 999 7）。结
果表明，5F浓度在 5～160 μg·mL-1范围内与峰高线性关系良
好。
2.5 5F-Na盐溶液中5F的含量测定
取制备好的 5F-Na盐溶液，用 HPLC法测定其中 5F含
量。色谱条件：色谱柱为Hypsel C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），
流动相为甲醇-1％醋酸（55 ∶ 45），流速为1.0 mL·min-1，紫外检
测波长为 242 nm，柱温为室温，进样 10 μL。制备 5F-Na盐溶
液 6批，按上述色谱条件测定，测得的峰高代入线性方程计算
样品含量，结果见表1。
表1 5F-Na盐溶液含量测定结果（n＝6）
Tab 1 Content determination of 5F-Na solution（n＝6）
样品
1
2
3
4
5
6
标示量/mg·mL-1
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
10.00
5F含量/mg·mL-1
9.882
10.054
10.122
10.450
9.934
9.862
相对标示量/％
98.82
100.54
101.22
104.50
99.34
98.62
x/％
100.51
RSD/％
2.18
2.6 长期稳定性考察
取分装好的3批5F-Na溶液样品，在室温条件下放置，进
行12个月的留样考察。分别于第0、第3、第6、第9、12个月取
样，考察其性状、pH值及含量。结果，其澄明度及 pH值无变
化。5F-Na盐溶液的稳定性考察结果见表2。
表2 5F-Na盐溶液的稳定性考察结果（n＝3）
Tab 2 Stability experiment of 5F-Na solution（n＝3）
样品
1
2
3
含量（相对标示量/％）
0月
99.34
101.22
100.54
3月
99.34
101.21
100.52
6月
99.32
101.23
100.56
9月
99.35
101.26
100.51
12月
99.31
101.23
100.52
2.7 MTT法测定5F-Na盐溶液抗肿瘤作用
分别考察5F-Na盐溶液作用24、48、72 h对NCL-H460和
BEL-7402细胞增殖的影响。选取对数生长期NCL-H460和
BEL-7402细胞，经胰酶消化、台盼蓝染色后在血球计数板上
计数，确保活细胞在 97％以上。调整细胞为每孔 3×107个·
L-1，加到96孔培养板中。将培养板放入37℃、5％ CO2孵箱中
培养。待细胞贴壁后取出培养板，加入不同浓度 5F-Na盐溶
液，使其终浓度分别为5、10、20、40、80 μg·mL-1，每个浓度设
8个平行孔；同时设置空白对照组、溶剂对照组和调零孔。培
养板放回孵箱分别继续培养24、48、72 h，取出培养板，每孔加
入MTT 20 μL（5 g·L-1），孵育4 h。吸出上清液，加入150 μL
DMSO。在平板摇床振摇 5 min使甲 赞完全溶解。用酶标仪
测 570 nm 波长处每孔的吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制
率。细胞增殖抑制率（％）＝（溶剂对照组A值－处理组A值）/
溶剂对照组A值×100％。
0 2 4 6 8 10 12 14
t/min
A
0 2 4 6 8 10 12 14
t/min
B
图1 高效液相色谱图
A.5F溶液；B. 5F-Na盐溶液
Fig 1 HPLC chromatograms
A. 5F solution；B. 5F-Na solution
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中国药房 2010年第21卷第47期 China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 47
2.8 统计学方法
数据以x±s表示，采用 SPSS 13.0 统计软件包One Way
Anova进行统计学处理。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.9 5F-Na盐溶液对NCL-H460细胞的生长抑制作用
不同浓度 5F-Na盐溶液（5～80μg·mL-1）分别作用于
NCI-H460细胞后 24、48、72 h，细胞增殖抑制率呈明显的时
间-剂量依赖性。5F-Na盐溶液对NCL-H460细胞作用 24、
48、72 h的 IC50分别为 23.7、14.2、7.0 μg·mL-1。5F-Na盐溶液
对NCI-H460细胞的生长抑制作用见图2。
2.10 5F-Na盐溶液对BEL-7402细胞的生长抑制作用
不同浓度 5F-Na盐溶液（5～80μg·mL-1）分别作用于
BEL-7402细胞后 24、48、72 h，抑制率呈明显的时间-剂量依
赖性。5F-Na盐溶液对BEL-7402细胞作用24、48、72 h的 IC50
分别为157.3、41.5、21.0 μg·mL-1。5F-Na盐溶液对BEL-7402
细胞的生长抑制作用见图3。
3 讨论
半边旗二萜类化合物 5F在水中的溶解性不好，其溶解度
仅为 1.24 mg·L-1，在体内生物利用度较低，不利于临床应用。
由于其结构上有羧基的存在，故采用加碱成盐的办法，增大其
在水中的溶解度。在制备盐溶液的过程中，考虑到化合物在
强碱溶液中结构易被破坏，因而在制备时，先将化合物用少量
水混匀，然后再缓缓滴加氢氧化钠溶液，降低该化合物结构被
破坏的可能性。制备后，经HPLC检测表明 5F在制备过程中
几无损失，证明该方法能有效地增加5F在水中的溶解性，且简
单易行。
笔者过去研究发现，半边旗提取物 5F能有效杀伤多种癌
细胞，其抗肿瘤机制与抑制核转录因子（NF）-kappaB活性，从
而抑制B细胞淋巴瘤/白血病（Bcl）-2和Bcl-xL的表达，促进
iNOS的表达有关；同时还发现其可下调NF-kappaB及血管内
皮生长因子（VEGF）的表达，能抑制高转移卵巢癌细胞的侵袭
转移能力[5～7]，这与已知的肝癌和肺癌的部分治疗靶点VEGF、
NFκB（IκB）、Bcl-2、Bcl-xL和凋亡期Bax等相吻合 [8～10]。但
5F制成Na盐溶液后，是否会使其抗肿瘤作用失活是该制剂工
艺成败的关键。本研究通过考察5F-Na盐溶液对肺癌细胞株
NCL-H460和肝癌细胞株 BEL-7402的体外抑制作用，发现
5F-Na盐溶液对这 2种类型的肿瘤细胞株的增殖都有较强抑
制作用，且对肺癌细胞株的杀伤作用要强于肝癌细胞株的杀
伤作用。这说明5F制成5F-Na盐溶液仍然能保持其原有的抗
肿瘤活性，解决了5F难溶于水而不利于进行体内实验的难题。
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（收稿日期：2010-02-10 修回日期：2010-07-24）
100
80
60
40
20
0
0 5 10 20 40 80
浓度/μg·mL-1
抑
制
率
/％
24 h
48 h
72 h
图2 5F-Na盐溶液对NCL-H460细胞的生长抑制作用
Fig 2 Inhibitory effect of 5F-Na solution on the growth of
NCL-H460 cells
100
80
60
40
20
0
抑
制
率
/％
0 5 10 20 40 80
浓度/μg·mL-1
24 h
48 h
72 h
图3 5F-Na盐溶液对BEL-7402细胞的生长抑制作用
Fig 3 Inhibitory effect of 5F-Na solution on the growth of
BEL-7402 cells
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