全 文 ：《癌症》1998年第 17卷第 3期 191
半边旗抗肿瘤有效成分 6F对 HL-60细胞
周期的影响及体外增效作用*
何承伟 梁念慈 莫丽儿 张 晓 李金华
*本文由广东省高教局重点学科专款资助(9306号)
作者单位:广东医学院医用生化研究所(湛江 , 524023)
第一作者:男 ,1972年 3月出生 ,硕士
摘 要 目的:研究半边旗抗肿瘤有效成分 6F对 HL-60细胞周期的影响及对常用抗肿瘤药的体外增效作
用 。方法:应用流式细胞光度术(FCM)测定细胞周期 ,应用噻唑蓝(MTT)法测定药物对细胞的抑制率 。结果:不同浓度
6F作用 6小时即可使 HL-60细胞 S期及 G2/M期比例升高 ,G1期比例下降 ,并呈一定的剂量效应关系 ,当作用到 24
小时后 , S期比例进一步升高 , 但 G2/M期比例稍有回落 。低浓度 6F分别与 2-氯代脱氧腺苷 (2-CLdAdo), 顺铂
(CDDP),长春新碱(VCR),氟尿嘧啶(5FU)合用可增强它们对 HL-60细胞的杀伤作用 , q值大于 0.85 ,与各药有相加
或协同作用 , 6F对 2-CldAdo ,CDDP ,VCR , 5FU的增效倍数分别为 1.58 , 1.53 , 1.55 , 1.38。结论:6F可明显阻断 HL-
60细胞在 S期及 G2/M期;6F可增强上述药物对 HL-60细胞的杀伤作用 。已知 , 2-Cld Ado阻断细胞在 S期 ,CDDP
和 VCR阻断 G2/M期 , 5FU阻断 G1期 。鉴于所试药物对细胞周期的影响不同 , 提示 6F的体外增效作用可能与此有
关 。
主题词 半边旗/药理学 细胞周期/化学诱导 增效作用 二萜/药理学
中图号 R963
半边旗(Pteris semipinnata L.PsL)为凤尾蕨科植
物 ,广泛分布于我国南方 ,民间用于治疗菌痢 ,肝炎 ,
毒蛇咬伤等〔1〕。我们课题组在筛选抗肿瘤药的过程
中发现 ,半边旗提取物有强的抗肿瘤作用〔2〕。实验结
果表明 , 半边旗提取物在体外对人早幼粒白血病细
胞 HL-60 , 胃癌细胞 MGC-803 , 肺癌细胞 SPC-
A-1 , 人鼻咽癌细胞 CNE-2Z , 人肝癌细胞 HepG2 ,
BEL-7402有很强的杀伤作用 , 对小鼠肉瘤 S180细
胞有抑制作用(另文待发表)。本课题组研究了半边
The effect of a diterpenoid isolated from pteris semipinnata on the HL-60
cell cycle and its enhanced in vitro cytotoxicity by anticancer drugs
He Chengwei Liang Nianci Mo Lier , et al.
Medical Biochemistry Institute , Guangdong Medical College , Zhangjiang 524023
Abstract Objective:To observe the effect of 6F , one of the diterpenoids isolated from Pteris semipinnata L.
(PsL), on the HL-60 cell cycle kinetics and its enhanced cytotoxicity when combined with other antitumor agents.
Methods:Cell cycle was determined using F1ow Cytometry (FCM)analysis , Cytotoxici ty assay was tested by MTT
method.Results:The FCM data showed that the distribution of HL-60 cells among phases of the cell cycle was changed
when treated with 6F.After exposure of the cells to various concentration of 6F for 6h , the S and G2/M phase ratio was
increased significantly in a dose-dependent manner.After 24h of exposure , S hpase ratio increased further.The in-
hibitory rates of 6F combined with 2-CldAdo or CDDP or VCR or 5FU were higher than that of these drugs used alone ,
q values were more than 0.85.Their enhancement times by 6F were 1.58 , 1.53 , 1.55 , 1.38 , respectively.Conclu-
sion:The results indicated that 6F could arrest HL-60 cells in S and G2/M phase , 6F could enhanced the cytotoxicity
of the drugs mentioned above.it is known that 2-CldAdo arrests cells in S phase , CDDP and VCR arrest cells in G2/M
phase , 5FU arrests cells in G1 phase.Thr different effect of these agents on the various phases of cell cycle kinetics may
be partially explained the enhanced effect of 6F.
Key words Pteris semipinnata Cell cycle Cytotoxicity Diterpene
192 何承伟 ,等 .半边旗抗肿瘤有效成分 6F对 HL-60细胞周期的影响及体外增效作用
附图 化合物 6F的结构
旗抗肿瘤有效成分之一 6F(一种二萜化合物)对
HL-60细胞周期的影响及体外增效作用。现将结果
报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 受试药物:半边旗提取物 6F(化学命名是:
对映-7α, 9-二羟基-15-羰基-16-烯-贝壳杉
烷-19 , 6β -内脂)(见附图)由我所药物化学室分离
提纯鉴定 , 2-氯代脱氧腺苷 , 长春新碱为 Sigma产
品 , 5氟尿嘧啶 , 顺铂购于广东医学院附属医院药
房。
1.1.2 细胞株:人早幼粒白血病细胞 HL-60由军
事医学科学院惠赠。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞周期测定:参照 Gong等〔3〕的方法。1×
10 6 ～ 2×10 6细胞经 800 g 离心 5分钟 , 细胞团用
PBS洗涤 3次 ,最后一次剩 0.3 ml ,注入冷 85%乙醇
中迅速混匀 , 室温或-20℃固定 24小时以上(约可
放置 1个月), 1000 g离心 5分钟 ,完全去除乙醇 ,重
悬于 40μl磷酸 ———柠檬酸缓冲液中 (192份 0.2
mol/L Na2HPO4 , 8份 0.1 mol/L柠檬酸 , pH 7.8),室
温放置 30分钟 , 1000 g 离心 5分钟 ,细胞团悬于 0.3
ml PBS中 , 加 0.7 ml 50μg/ml碘化丙啶(内含 0.05
μg/ml的 RNase),避光染色 30分钟 , 用 Coulter Epics
XL-31240流式细胞仪测定细胞 DNA含量并分析
细胞周期。
1.2.2 细胞毒实验:MTT法参照 Hansen等〔4〕的方
法。对数生长期 HL-60细胞 1×10 5 ～ 2×10 5/ml ,
分装入 96孔板中 ,每孔 90μl ,用药组加 10μl药液 ,
对照组加 10 μl 相应溶剂 , 均设 4个平行孔 , 于
37℃, 5%CO2饱和湿度孵箱中保温 24小时后 , 加 5
mg/ml MTT试剂 20μl , 孵箱中反应 5小时 , 再加
20%SDS 50%DMF甲月赞溶解液 37℃3～ 5小时后用
Bio-Rad M450酶标仪测定吸光度(A), 测定波长是
570 nm ,参考波长是 450 nm ,按下式计算药物对细胞
生长的抑制率(IR),并按改良 Kä rber公式计算 IC50 。
抑制率=(1-[ A5 70 -A450 ]用药组/[ A570 -A45 0 ]对照组)×100%
为判断两药合用是拮抗 , 相加或协同效应 , 按金氏公式求 q
值〔5〕。
q=(EA+B)/[ EA+(1-EA)·EB]
EA+B为两药合用的抑制率
EA和 EB各药单用时的抑制率
q<0.85表示两药合用有拮抗作用
q>1.15表示两药合用有协同作用
1.15≥q≥0.85表示两药合用有相加作用
2 实验结果
2.1 6F对 HL-60细胞周期的影响
如表 1所示 , 不同浓度 6F作用 HL-60细胞 6
小时 , 与对照组比较 , 细胞周期即已发生变化 , 表现
为 G1/G0期细胞比例下降 , S期及 G2/M期升高 , 并
呈一定的剂量效应关系 。当作用到 24小时 , S期比
例继续升高 , G2/M期稍有回落 ,但 231.2 nmol/浓度
的 6F作用于 HL-60细胞 24小时后 , G2/M期降至
1%, 同时在 G1期前出现一个亚倍体峰 , 可能是 6F
对 G2/M期细胞敏感的缘故 , 导致该细胞内 DNA含
量减少(是否为凋亡细胞?待证实)。从以上结果得
知 , 半边旗提取物 6F可阻断 HL-60细胞在 S期及
G2/M期。
2.2 6F与抗癌药合用的体外增效作用
本实验用 MTT法测定了半边旗提取物 6 F单用
及分别与 2-CldAdo , CDDP , VCR , 5FU合用对HL-
60细胞的杀伤作用 。结果见表 2。用 57.8 nmol/L与
115.6 nmol/L 6F 对 HL-60细胞的杀伤率分别为
10.7%和 41.7%, 分别与各药合用均可不同程度增
强杀伤作用 , q 值在 0.85 ～ 1.15之间 , 个别大于
1.15 , 提示 6F具有体外抗肿瘤相加或协同作用(见
表 2)。
表 1 6F对 HL-60细胞周期的影响
药物浓度(nmol/L)
0
28.9
57.8
115.6
173.4
231.2
%G0/G1
24.7
18.1
15.9
16.0
8.6
4.5
%S
54.2
63.1
65.0
63.4
62.4
60.6
%G2/M
21.1
18.8
18.3
20.5
29.0
34.9
%G0/G1
31.8
21.0
20.7
7.4
8.4
11.9
%S
52.3
56.1
58.8
71.0
69.1
87.5
%G2/M
15.6
22.9
20.8
21.7
22.5
0.6
作用 6小时 作用 24小时
《癌症》1998年第 17卷第 3期 193
表 2 6F单独使用及与各药物合用对 HL-60细胞生长的
抑制作用
注:#以上结果均为 3至 4次重复试验的均值
药物处理
(μmol/L)
0
2-CldAdo
5
10
20
40
80
CDDP
0.17
0.67
2.67
10.67
42.67
VCR
0.04
0.16
0.63
2.50
10.00
5FU
9.61
19.22
38.43
76.86
153.73
单用 6F
IR(%)
—
4.3
24.8
61.1
68.9
73.8
15.2
18.7
42.8
68.0
90.5
38.1
44.0
46.8
49.9
54.4
18.8
33.8
56.6
58.0
71.8
合用 57.8 nmol/L
6F IR(%)
10.7
14.4
33.5
68.6
84.2
89.1
21.8
24.1
52.5
76.3
91.2
46.8
54.0
58.9
61.9
69.2
37.2
44.8
60.9
60.0
78.1
q
值
—
0.99
1.02
1.05
1.17
1.16
0.90
0.88
1.07
1.07
1.00
1.05
1.08
1.12
1.12
1.17
1.35
1.10
0.99
0.96
1.04
合用 115.6 nmol/L
6F IR(%)
41.7
34.7
54.1
72.1
88.1
91.4
41.9
48.8
68.2
86.1
93.1
54.8
58.8
60.9
64.5
71.2
56.1
64.3
71.3
80.1
84.2
q
值
—
0.79
0.96
0.94
1.08
1.08
0.83
0.93
1.02
1.06
0.99
0.86
0.87
0.88
0.91
0.97
1.07
1.05
0.95
1.06
1.01
1
2
3
4
5
6
7
8
9
参 考 文 献
丁恒山 .中国药用孢子植物 .第一片 ,上海:上海科技出
版社 ,1982:104
张 晓 , 崔 燎 , 田中信寿 , 等 .半边旗有效成分及抗肿
瘤活性研究 .药物化学杂志 , 1997 , 32(1):37
Gong JP , Traganos F , Darzynkiewicz Z , et al.A selective
procedure for DNA extraction from apoptotic cells applicable for
gel electrophoresis and flow -cytometry.Anal.Biochem ,
1994 , 218:314
Hansen MB , Nielsen SE , Berg K , Re-examination and fur-
ther development of a precise and rapid dye method for mea-
suring cell growth/cell kill.J.Immunol.Methods , 1989 ,
119:203
金正均 .论 LINEWEAVER-BURK 直线化公式的应用 .
中国药理学报 , 1980 , 1(1):3
Hall IH , Lee KH , Mar EC.Antitumor agents , a proposed
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Steel GG.Growth kinetics of tumours.lst et , Oxford , Claren-
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Dethlefsen LA.Cell cycle effects of drugs.lst , Oxford , New
York , Toronto , Sydney , Frankfurt , Pergamon Press , 1986:44
Huang MC , Ashmum RA , Avery TL , et al.Effects of cyto-
toxicity of 2-chloro-2-deoxyadenosine and 2-bromo-
2-deoxyadenosine on cell growth , clonogenicity , DNA syn-
thesis , and cell cycle kinetics.Cancer Res , 1986 , 46:2362
(收稿:1997-01-14 修回:1997-07-15)
3 讨 论
半边旗抗肿瘤作用的发现令人鼓舞 , 关于其抗
肿瘤的特性及作用机理正在进一步深入研究之中 。
本文的实验结果表明:1.半边旗提取物 6F可阻断
HL-60细胞在 S期 ,对 G2/M也有轻度阻断作用;2.
半边旗提取物 6F可增强 2-CldAdo , CDDP , VCR ,
5FU对 HL-60细胞的抑制作用 。已知〔7 ～ 9〕 , 2-
CldAdo作为腺苷类似物抑制 DNA的合成 ,杀伤 S期
细胞 ,CDDP可与 DNA交联 ,引起 DNA复制障碍 ,阻
断G2/M期 ,对晚 G1期细胞敏感 , VCR的作用靶点是
微管 ,阻断 G2/M期 ,对 S期细胞敏感 , 5FU为抗代谢
药 ,阻断 G1期 ,对 S期敏感 。药物对细胞周期的影响
及对各时相细胞的敏感性不同 ,且与 6F的敏感时期
不同 , 可能是 6F 具有增强所合用药物对 HL-60细
胞抑制作用的原因之一 。
6F是一含α, β -亚甲基环戊酮结构的对映贝
壳杉烷类化合物(如附图所示),据文献报道〔6〕 ,含此
结构的化合物可经 Michael加成反应与含巯基的酶
结合 ,导致酶失活 。我们在实验过程中发现 ,还原型
谷胱甘肽(GSH)可抑制 6F 的体外抗肿瘤作用(资料
未列出), 从侧面证实 6F可作用于细胞内巯基化合
物而起抗肿瘤作用 , 但 6F却不能直接降低细胞内
GSH水平(资料未列出)。因此 , , 6F不是通过直接降
低 GSH水平而起增效作用 。另据我们的实验结果表
明 ,半边旗提取物可抑制拓扑异构酶活性 ,升高细胞
内钙离子(另文待发表)。以上因素也可能是 6F增效
作用的原因。