全 文 ：天然药物化学
基于 psbA-trnH序列对广藿香与藿香、广防风的
分子鉴定
黄洁燕1，卢慧娟1，谢晖2，姬生国1
(1．广东药学院 中药学院，广东广州 510006;2．复旦大学 药学院，上海 200120)
摘要:目的 采用叶绿体基因 psbA-trnH间隔区序列探讨广藿香及其常见伪品的分子鉴定方法。方法 分
别提取广藿香及藿香、广防风植物的总 DNA，经 PCＲ扩增 psbA-trnH间隔区序列，产物纯化后测序，采用
Clustal_X 1．8和 MEGA 5．05软件对序列进行分析。结果 广藿香与藿香、广防风的最小种间 K2P 距离
(0．159 2)大于最大种内 K2P 距离(0．004 3)，邻接树中广藿香 9个不同产地来源样品聚为一支。广藿香
与藿香、广防风之间存在多个特异性信息位点。结论 psbA-trnH序列可作为广藿香及藿香、广防风分子
鉴定的依据。
关键词:广藿香;藿香;广防风;psbA-trnH序列;鉴定
中图分类号:Ｒ284．1 文献标志码:A doi:10．3969 / j．issn．1006-8783．2014．06．004
文章编号:1006-8783(2014)06-0683-05
Molecular identification of Pogostemon cablin，Aagastache rugosus and Epimeredi
indica based on psbA-trnH intergenic spacer sequences
HUANG Jieyan1，LU Huijuan1，XIE Hui2，JI Shengguo1
(1．School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，
China;2．School of Pharmacy，Fudan University，Shanghai 200120，China)
Abstract:Objective To perform the molecular identification of Pogostemon cablin，Agastache rugosus and
Epimeredi indica based on psbA-trnH intergenic spacer sequences． Methods Total DNA was extracted and
psbA-trnH intergenic spacer sequences were amplified by PCＲ．PCＲ products were directly sequenced after
purification．Sequences were analyzed with Clustal_X 1．8 and MEGA 5．05 software． Ｒesults The minimum
inter-specific K2P distance was 0．159 2，higher than the maximum intra-specific K2P distance (0．004 3)．
The different samples from nine origin places of P． cablin were clustered into one clade in the Neighbor-
Joining tree． Distinctive variation sites between P． cablin，A． rugosus and E． indica could be identified．
Conclusion The psbA-trnH intergenic spacer sequences can be used to identificate P． cablin，A． rugosus
and E． indica in molecule level．
Key words:Pogostemon cablin;Agastache rugosus;Epimeredi indica;psbA-trnH intergenic spacer;
identification
收稿日期:2014-09-11
基金项目:广东省科技计划项目(2011B031700041)
作者简介:黄洁燕(1988—)，2011级硕士研究生，Email:huangjieyanalice@ 163．com;通信作者:姬生国(1967—)，教授，博士，从
事中药资源、中药质量标准及中药新药研究，电话:020-39352327，Email:shengguo_ji@ 163. com;谢晖(1976—)，讲
师，博士后，从事药用植物种质资源研究，电话:021-51980137，Email:xiehui@ fudan．edu．cn。
网络出版时间:2014-11-26 14:51 网络出版地址:http:/ /www．cnki．net /kcms /detail /44．1413．Ｒ．20141205．1505．023．html
广藿香为常用中药，具有芳香化浊、和中止呕、
发表解暑的功效，用于湿浊中阻、脘痞呕吐、暑湿表
证、胸闷不舒等［1］。广藿香原产于菲律宾、马来西
亚、印度等国家［2］，我国在宋代或更早已引种栽
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Dec． 2014，30(6)
培［3］，在广东栽培也已有百余年的历史［4］。传统的
广藿香商品药材按产地分为“石牌广藿香”(枝香)、
“高要广藿香”(肇香)、“湛江广藿香”(湛香)和“海
南广藿香”(琼香)4 种［5］。因历史渊源与产区的生
态环境、种植条件变迁影响，广藿香各个品种在植物
性状和品质上差异较大。广藿香与同科藿香属植物
藿香及广防风属的广防风植物形态相似，性状较难
鉴定［6］。文献报道，藿香含有致癌性物质甲基胡椒
酚的代谢产物 1-羟基甲基黑椒酚等［7］;另有文献报
道，用唇形科广防风冒充广藿香药材使用［8］，市场
上药材品种间在性状上较难区分，仅利用形态学的
特征鉴定难度大。
随着分子生物学和信息技术的发展，DNA 分子
鉴定技术已被广泛地应用于各个领域。psbA-trnH位
于编码光合系统Ⅱ反应中心的 D1蛋白的 psbA基因和
编码 tＲNA组氨酸的 trnH基因之间，可以用于植物属
间、种间的系统发育研究［9］。本文通过对广藿香、藿
香(样品 10、11的序列来源于基因库)、广防风(样品
15的序列来源于基因库)样品进行遗传距离对比及
构建系统树，探讨 3种植物种间的分子鉴定。
1 材料与方法
1．1 材料来源
本研究所用样品广藿香、藿香、广防风为新鲜样
品植物叶片，经硅胶快速干燥，经广东药学院中药学
院姬生国教授鉴定分别为广藿香 Pogostemon cablin
(Blanco)Benth．、藿香 Agastache rugosus(Fisch． et
Mey．)O． ktze． 和广防风 Epimeredi indica(Linn．)
Ｒothm．，标本保存在广东药学院中药学院生药研究
室。样品信息详见表 1。
表 1 样品信息
Table 1 Samples information
样品名称 样品编号 采集地 标本号 采集日期 基因库序列号
广藿香(P． cablin) 1 广东省潮州市 CZ1 2011-10-08 KC832487
2 海南省万宁市 ZQ3 1996-08-20 KC832492
3 广东省吴川市 LT1 1997-08-01 KC832485
4 广东省莲塘 LT1 1997-11-20 KC832486
5 广东省广州市黄村 HC1 1988-04-04 KC832484
6 广东省湛江市 ZJ30 2011-07-04 KC832491
7 广东省化州市 HZ23 2011-07-04 KC832490
8 广东省阳春市 YC9 2011-07-03 KC832489
9 广东省肇庆市 ZQ3 2011-10-23 KC832488
藿香(A． rugosus) 10 PS0124MT02 JQ339252
11 PS0124MT01 EU590857
12 广东省广州市 HX1 2011-11-01 KC832494
13 河南省郑州市 HX4 2011-12-04 KC832493
广防风(A． indica) 14 广东省广州市 GFF1 2011-10-14 KC832495
15 PS0118MT01 FJ528995
注:10、11、15号样品序列号来源于基因库。
1．2 试剂
DNA提取试剂盒 50、PCＲ 扩增产物纯化试剂
盒 50(AxyPrep，美国);Taq DNA 聚合酶、10×Taq 缓
冲液、dNTP［TaKaＲa 宝生物工程(大连)有限公
司］;PCＲ扩增引物(上海美吉生物技术有限公司);
DL 2000 Marker［TaKaＲa宝生物工程(大连)有限公
司］;化学试剂均为分析纯。
1．3 仪器
D-37520型台式离心机(Eppendof，德国);5331
PCＲ扩增仪(Eppendorf，德国)。
1．4 方法
1．4．1 总 DNA 提取 取试验样品叶片约 0．1 g，在
液氮中研磨成细粉，按基因组 DNA提取试剂盒说明
书操作步骤提取总 DNA。
1．4．2 PCＲ扩增、纯化和测序 psbA-trnH 序列采用
通用引物［10］:psbA-trnH-F 引物为 5-GTTA TGCA
TGAA CGTA ATGC TC-3;psbA-trnH-Ｒ 引物为 5-
CGCG CATG GTGG ATTCA CAAT C-3。反应体系:
486 广东药学院学报 第 30卷
取总 DNA 50 ～ 100 ng 作为模板，加入 dNTP(各 2．5
mmol /L)2 μL，10×PCＲ 缓冲液(plus Mg2+)2．5 μL，
正反向引物(10 μmol /L)各 0．5 μL，r Taq酶 0．2 μL，
补足灭菌水，使最终反应体积达到 25 μL。将上述溶
液置于 PCＲ仪中进行 PCＲ 反应，反应程序为:94 ℃
预变性 3 min;94 ℃变性 1 min，50 ℃退火 1 min，72 ℃
延伸 1 min，30个循环;72 ℃，10 min。扩增产物经胶
回收、纯化，用质量分数 1%琼脂糖凝胶电泳检测
(见图 1)，备用。纯化 PCＲ产物由上海美吉生物技
术有限公司测序。
! # $ % & ’ (
#)))
*+
(&)
&))
)))
#&)
))
M． DL 2 000 DNA Marker;1～3分别为样品 1、12、14;4～7分
别为样品 2、3、4、5。
图 1 总 DNA琼脂糖凝胶检测电泳结果图
Figure 1 The agarose gel electrophoresis figure of total DAN
extraction from P． cablin，A． rugosus and E． indica
1．4．3 序列分析和系统树的构建 所得植物的 psbA-
trnH序列范围参照 Pogostemon cablin (EU590858)、
Agastache rugosus (EU590857)及 Anisomeles indica
(FJ528995)。序列比对用 Clustal_X Version 1．8 软
件［11］完成，个别位点辅助手工校对。用 MEGA 5．10
软件进行系统发育分析并分别计算各个种之间的差
异性(kimum 2-parameter)。空位(Gap)被处理为完
全缺失(complete deletion)，以邻接法(Neighbor-
Joining，NJ)构建系统分枝树，利用 bootstrap(1 000
次重复)检验各分支置信度。
2 结果与分析
2．1 广藿香不同居群 psbA-trnH序列对比
通过对比 9个广藿香样本 psbA-trnH序列，结果
显示 WC-GHX、LT-GHX、HC-GHX、GZ-ZJ30、GZ-
HZ23、GZ-YC9、GZ-ZQ3 这 7 条序列完全相同，GZ-
CZ1 和 HN-102 完全相同。经 Clustal X 1． 8 和
MEGA 5．10软件排序分析，9 个样本有 2 种序列，长
度皆为 236 bp，正向测序在 230～245 bp处具有 1个
Poly (T)结构。其中，碱基组成平均质量分数 T 为
34．7%，C 为 11． 9%，A 为 34． 3% ～ 34． 7%，G 为
18. 6%～19．1%，GC 质量分数为 30．5% ～ 31．0%，GC
的质量分数明显低于 AT，各样品 T、C、A、G 的碱基
质量分数见表 2。可见，共有 2 个碱基变异位点，种
内平均 K2P 距离为 0．001 7，种内最大 K2P 距离为
0．004 3，表明不同居群样本种内变异差别低。
表 2 15个样本中 psbA-trnH序列中碱基的质量分数
Table 2 The base content in psbA-trnH sequence of the fifteen
samples
样品编号 T /% C /% A/% G/% 总长度 /bp
1 34．7 11．9 34．7 18．6 236．0
2 34．7 11．9 34．7 18．6 236．0
3 34．7 11．9 34．3 19．1 236．0
4 34．7 11．9 34．3 19．1 236．0
5 34．7 11．9 34．3 19．1 236．0
6 34．7 11．9 34．3 19．1 236．0
7 34．7 11．9 34．3 19．1 236．0
8 34．7 11．9 34．3 19．1 236．0
9 34．7 11．9 34．3 19．1 236．0
10 37．1 11．7 33．2 18．0 283．0
11 37．1 11．7 33．2 18．0 283．0
12 37．1 11．7 33．2 18．0 283．0
13 37．1 11．7 33．2 18．0 283．0
14 38．4 9．9 34．1 17．5 372．0
15 38．4 9．9 34．1 17．5 372．0
珋x 36．1 11．5 34．0 18．4 266．7
2．2 广藿香与其易混伪品种间序列对比
广藿香及其 2种混伪品种间序列对比，包括 231
个位点(除去插入缺失位点)，保守位点 176 个，变异
位点 79个，简约信息位点 5个，自裔位点 62个，结果
见表 3。可见，广藿香与藿香种间平均遗传距离差异
为 0．160 5，与伪品广防风种间平均遗传距离差异为
0. 228 0，种间 K2P 距离大于种内 K2P 距离。
2．3 广藿香及其易混伪品的 psbA-trnH 序列的邻接
树鉴定
从叶绿体基因 psbA-trnH 序列构建的邻接树
(图 2)可以看出，广藿香药材具有单系性，不同产
地的广藿香皆为同一支，容易与其混伪品区别开
来，因此 psbA-trnH 序列适用于药材广藿香与其混
伪品的鉴定。
586第 6期 黄洁燕，等．基于 psbA-trnH序列对广藿香与藿香、广防风的分子鉴定
表 3 广藿香及其伪品之间 psbA-trnH序列间的遗传距离差异
Table 3 Kimura two-parameter sequence divergences of psbA-trnH intergenic spacers in P． cablin，A． rugosus and E． indica
样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1
2 0．000 0
3 0．004 3 0．004 3
4 0．004 3 0．004 3 0．000 0
5 0．004 3 0．004 3 0．000 0 0．000 0
6 0．004 3 0．004 3 0．000 0 0．000 0 0．000 0
7 0．004 3 0．004 3 0．000 0 0．000 0 0．000 0 0．000 0
8 0．004 3 0．004 3 0．000 0 0．000 0 0．000 0 0．000 0 0．000 0
9 0．004 3 0．004 3 0．000 0 0．000 0 0．000 0 0．000 0 0．000 0 0．000 0
10 0．164 8 0．164 8 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2
11 0．164 8 0．164 8 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．000 0
12 0．164 8 0．164 8 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．000 0 0．000 0
13 0．164 8 0．164 8 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．159 2 0．000 0 0．000 0 0．000 0
14 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．372 4 0．372 4 0．372 4 0．372 4
15 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．228 0 0．372 4 0．372 4 0．372 4 0．372 4 0．000 0
!!#$%
#&!$&’(
)*!#$%
#&!&+(,
&!-.
#&!&/(
$!#$%
#&!&0
$100,’
2(
3(
32
!#$%&’(
,4,’
)*+,-.+.
)’(/’#$
0,,
0,,
56,0’27*,0
$%0
56,0’27*,’
$1!$%
56,0087*,0
-509
注:树枝上数字为 1 000次重复的 bootstrap百分率。
图 2 广藿香与其伪品 psbA-trnH基因序列构建的邻接树
Figure 2 The strict consensus tree constructed based on psbA-
trnH intergenic spacer sequences of P． cablin，A． rugosus
and E． indica
3 讨论
由于历史渊源与产区的生态环境、种植条件、采
收时间和加工方法的不同，不同产地商品药材的性
状和品质有所差异。“枝香”在广东有百余年的栽
培历史，目前产于广东省广州市郊;“肇香”多栽培
于肇庆市各地，尤以高要市种植面积较大，传统认为
这两者是道地药材，质量优，供药用。“琼香”是在
20世纪 40年代时期自原产地印度尼西亚引种，栽
培于海南省万宁等种植地。“湛香”于 20 世纪 50
年代自海南引种，产于广东省湛江市，质量较次，不
供药用，仅用作提取广藿香油(patchouli oil)。本研
究对 9个广藿香样品进行 psbA-trnH DNA序列研究，
涵盖了 4种广藿香品种，但不同居群 psbA-trnH序列
对比共有 2个碱基变异位点，种内平均 K2P 距离为
0．001 7，种内最大 K2P 距离为 0．004 3，说明不同居
群样本种内变异差别低，与文献［5］的广藿香 psbA-
trnH序列存在种内多态性的结果不尽相同。
基于广藿香的栽培技术［3］及种内形态学上的
变异情况［13］来考虑，导致本研究不同居群广藿香种
内变异低的情况的原因可能有以下几点:(1)psbA-
trnH序列用于药用植物种内遗传变异鉴别能力较
弱，不如核基因 ITS序列进化速率快;(2)广藿香作
为一个自然分类群属于亚洲热带种，在我国产区罕
见开花结实，缺少基因多样性且品种单一，遗传基础
也狭窄;(3)在形态学上的考察，很多学者都认为不
同居群的广藿香已经发生了形态学上的变异，甚至
表观遗传学也发生了变异［5］。表观遗传是指 DNA
序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改
变，故植物形态上发生变化，但其基因组序列不一定
会发生相应的改变。
本文结果显示，广藿香样品中碱基的质量分数
基本一致，无论从遗传距离及系统树中均未能有效
分离藿香的 4 个样品及广防风的 2 个样品，说明
psbA-trnH序列不适用于广藿香种内的区分，该结果
686 广东药学院学报 第 30卷
与文献［13］报道的对 103 个不同化学型广藿香样
品的叶绿体基因序列 rbcL、psbA-trnH、rpoB、ndhJ 及
核糖体基因 ITS 序列的分析，认为 ITS 序列能够区
分不同化学型的广藿香，其他的序列则不能区分的
结果一致。本文的藿香及广防风由于试验样品较
少，尚需进一步扩大样本进行研究确证。
从广藿香药材与藿香、广防风的 psbA-trnH序列
的比对构建的邻接系统发育树结果可知，广藿香聚
为一支，藿香与广防风分别聚为一支，广藿香与藿香
之间的遗传距离为 0．159 2 和 0．164 8，广防风与藿
香之间的遗传距离为 0．372 4，与广藿香之间的遗传
距离为 0．228 0，因此，利用 psbA-trnH 序列可以将此
3 个种的植物进行鉴定，说明该基因条形码适用于
种间的鉴定，不适用于不同产地广藿香的鉴别。为
了在基因层面对道地岭南药材广藿香进行鉴别，本
课题组已经采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技
术对广藿香的遗传多样性进行了研究［14］，以期从分
子水平对“肇香”“湛香”“琼香”“枝香”进行鉴定。
参考文献:
［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典:2010 年版一部
［M］．北京:中国医药科技出版社，2010:30．
［2］陈元生．珍稀南药广藿香的研究进展［J］．广东农业科
学，2007(1):109-112．
［3］黄崇坚．广藿香的栽培技术［J］．中国热带农业，2011
(1):63-64．
［4］白晓菊．化湿和胃道藿香［J］．家庭医药，2005(10):18．
［5］刘玉萍，罗集鹏，冯毅凡，等．广藿香的基因序列与挥发
油化学型的相关性分析［J］．药学学报，2002，37(4):
304-308．
［6］张秋燕，张福平．粤东地区唇形科药用植物资源［J］．时
珍国医国药，2010，21(11):2981-2984．
［7］叶卫玲．广藿香与藿香的鉴别［J］．海峡药学，2011，23
(11):43-45．
［8］陈兴兴，杜志敏，张建娜，等．广藿香及其混伪品防风草
的鉴别［J］．中药材，2000，23(5):261-263．
［9］邵世光，韩丽，马艳红，等．枫斗类石斛 cpDNA psbA-trnH
的序列分析与鉴别［J］．药学学报，2009，44(10):1173-
1178．
［10］ JI Shengguo，HUO Keke，WANG Jun，et al． Molecular
identification of twelve medicinal plants of Huperziaceae
［J］．Am J Chinese Med，2007，35(6) :1061-1071．
［11］THOMPSON JD，GIBSON TJ，PLEWNIAK F，et al． The
CLUSTAL_ X windows interface:flexible strategies for
multiple sequence alignment aided by quality analysis
tools［J］．Nucleic Acids Ｒes，1997，25:4876-4882．
［12］冯承浩．不同产地广藿香的比较研究［J］．韶关学院学
报:自然科学版，2006，27(6):100-103．
［13］HE Y，WAN F，XIONG L，et al． Identification of two
chemotypes of Pogostemon cablin (Blanco)Benth． through
DNA barcodes［J］． Z Naturforsch C，2014，69(5 /6) :253-
258．
［14］黄洁燕，卢慧娟，熊燕，等．广藿香 MSAP 分析技术体系
的优化及引物筛选［J］．广东药学院学报，2014，30(1):
29-35．
( 责任编辑: 陈翔)

美国 FDA批准 Gardasil 9可预防 9种人乳头瘤病毒引发的癌症
美国 FDA于 2014年 12月 10日批准 Gardasil 9(Human Papillomavirus 9-valent Vaccine，Ｒecombinant，重组人乳
头瘤病毒 9 价疫苗)，可预防 9 种人乳头瘤病毒(HPV)引发的癌症，比此前 FDA 批准的 Gardasil 多出 5 种。
Gardasil-9可预防约 90%的宫颈癌、外阴癌、阴道癌和直肠癌。
Gardasil-9疫苗适用于 9～26岁的女性和 9～15岁男性。可用于预防由 HPV16、18、31、33、45、52、58 引起的宫
颈癌、外阴癌、阴道癌和直肠癌，还可预防由 HPV6、11 引起的生殖器疣(尖锐湿疣)。与 Gardasil 相比，Gardasil 9
增加了对 5种类型的 HPV的保护，即 HPV31、33、45、52和 58，这 5种 HPV可引发大约 20%的宫颈癌，而且是 FDA
以前批准的 HPV疫苗所从来没有覆盖的。
Gardasil 9疫苗的接种分 3次进行，首次接种 2个月后进行第 2次接种，6个月后进行第 3次。常见毒副作用
主要是注射部位疼痛、红肿和头痛。
Gardasil 9疫苗由默克公司(Merck ＆ Co．，Inc．)旗下默沙东公司(Merck Sharp ＆ Dohme Corp．)生产。
(来源:美国 FDA政府公告，2014-12-10 夏训明 编译)
786第 6期 黄洁燕，等．基于 psbA-trnH序列对广藿香与藿香、广防风的分子鉴定