全 文 ：四川林业科技 19 9 1 . 1 2 (1 )
蓝大按组织培养初报
罗建勋 刘和林 袁仕学 付良发 (四川省挤科院 )
前 - -〕 ~4口
用人工选育的优良自然杂交按一蓝按 义大叶按无菌苗下胚轴及器官培养 ,均得到分化能力较
强的细胞团和绿芽 ,继代培养获得大量的完整植株 , 已移栽成活一定数量的组培苗 。
按树是我省主要速生树种之一 ,也是很好的再生能源 , (称石油树 )和造纸 、 人造纤维 、 提取精油
的重要原料 。 按属 (肠ca 勿tP us )是异花授粉的多年生木本植物 ,种间天然杂交产生杂种现象非常频
繁 。 但多代采用有性繁殖方法或继续让其夭然杂交 ,对 已选择出的优株也必然会引起品种的混杂 、
分离与退化 ,不能继续保持已有的优良形状 。 因此 ,无性繁殖在按树生产上占有重要地位 。 蓝大按
是杂交种 ,体内成分复杂 ,成年树组织内存在着抑制生根的内源物质 。 林木组织培养提供了一个新
的途径 。 有关按树组培 ,国际上早在 1 9 6 5 年就开展了研究〔 1, , 1 9 6 9 年从愈伤组织诱导出小植株〔 2 , ,
到 目前为止 , 已从许多种类的不同外植体诱导出了不定芽或体细胞胚胎发生 ,并相继在许多实验室
开展了快速繁殖的研究 ,成功地摸索出一套建立无性繁殖方法 。 〔 ,一 5〕
材料和方法
供试材料 3 年 、 8 年生树龄新枝节段 、无菌苗的下胚轴 。
无菌苗获得 F , 种子在 7 0% A ze 处理 1 0 1 , 无菌水洗 2 ~ 3 次 ,再用 0 . 1% H s c l Z 消毒 6一 7m in ,
无菌水彻底冲洗 ,吸干 , 接种到 。. 8% ( A g ar )白培养基上 , 5~ 6 天 ,苗高 2~ 4c m 。
接种 在超净台内 ,将新枝节段用 1 0 P Pm 的 A A 预处理 30 m in ,无菌水洗 3 次 , 吸干 , 70 % A L C
漂洗 一0 , ,无菌水冲洗 2~ 3 次 ,再用 0 . 1% H s c 一2 消毒 6一 7 m i n ,无菌水冲洗 5一 6 次 ,切成 5 ~ l o m m
节段接种 ;将 3 ~ s m m 无菌苗下胚轴接种到诱导培养基上 。
培养墓 基本培养基为 H ( oB u咫 zn 和 N i st e h , 1 9 6 7 ) 、 M S (M u r a交 i s e 和 s k o o s , 1 9 62 ) 、 改 良 H 和改
良 M s 。 所有培养基的 P H值均调至 5 . 8 ,在 1 . Zk g / e m Z~ 1 . s k g / e m , ( 0 . 12~ 0 . 1 5M p a )压力下 ,灭菌 1 5
~ 2 0 分钟 。 本试验所用培养基列表 1 。
表 1 . 培养基成份表 单位 : ( m g / )L
培养 荃 本 水 解 肌醇 . 蔗糖 腺嗦岭 琼脂 V B Z 2 . 4一D B A P N A A K T IB A
基号 培养基 乳蛋 白
M l 改 良 H / 1 0 0 3 0 0 0 0 / 4 5 0 0 0 / 1 / / 0 . 8 /
M 2 改良 H 5 0 0 1 0 0 2 0 0 0 0 4 0 4 5 0 0 0 4 / 0 . 5 0 . 1 / /
M 3 H 5 00 1 0 0 2 0 0 0 0 40 6 0 0 0 4 / 0
.
5 0 1 0
.
1 /
0 6试验简报 1 (2卷 )
续表 1
培养 基 本 水 解 肌醇 蔗糖 腺嗦 p令 琼脂 V BZ 2 .4一 D B A A A N PKT IB A
基号 培养基 乳蛋白
M4改良 H00 5 10 02 0 0 0 0 4 0 0 60 0 4 /0 . 50 .0 1. 1/
M5改 良 M S0 50 0 12 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 64 /0。 0 5 . 10 . 1/
M 6M S500 10 02 0 0 0 0 4 0 60 0 0 4 /0
.
0 5
.
10
.
1/
M 7改良 H/2 0 30 0 00 4 0 60 0 0 / / / / /0 . 5
M 8改良 H/2 02 0 0 0 0 4 0 0 0 0 6/ / / / /0 5
M分 改 良 H/2 0 5 10 0 0 4 0 0 60 0 / / / / /0 . 5
M 10改 良 H/2 0 0 0 0 0 4 0 60 0 0 / / / / / /
LM改良 M S2 0 0 0 0 05 0 0 4 0 /4 /0, 3 / / /
注 : 1 . 生根培养基采用 1/ 2 大量元素 , 1/ 5 有机物 , 2 倍铁盐 。
2
. 琼脂 4 . 5 8 / L (进 口 ) , 6 s/ (L 国产 )
培养条件 培养温度 2 5 ~ 2 9 ℃ , 湿度 7 0~ 8 5写 ,光照时间 9 ~ 14 h ,光强 15 0 0~ 2 0 0 0 lu x 。
试验结果和分析
不同来源的外植体对出愈率和芽分化率的影响
从表 2 可以看出 : 随着树龄增加 , 出愈率明显减少 ,无菌苗下胚轴的出愈率为 1 0 % 。 离体培养
7 ~ 15 天即可观察到切 口处形成紫红色 、 白色和绿色的愈伤组织 , 质地有疏松 ,也有紧密 。 将上面
表 2 . 外植体和出愈率的关系
试验号 培养基 树龄 取材部位 接种外植体数 形成愈伤组织 出愈率 愈伤组
(年 ) (个 ) 外植体数 (个 ) ( % ) 织归类
l M 1 8 新枝节段 9 6 4 5 4 6 . 8 8 C l
2 M 1 3 新枝节段 2 3 19 8 2 . 6 1 C 2
3 M 1 无菌苗 下胚轴 3 7 0 3 7 0 1 0 0 , 0 0 C 3
的 3 类愈伤组织转到分化培养基上 ,经 3 次继代培养 。 从表 3 观察到 , 芽分化率 c 3 > c Z> c , ,并且 lC
和 c Z 褐化严重 。 c : 随着继代培养的次数增多 ,芽分化率增加 。 但这只属于胚性愈伤组织 。 胚性愈
伤组织指那种较硬 、 易脆表面凹凸不平 ,且光滑透明 。
表 3 . 不同来源的愈伤组织和 芽分化率的关系
试 培 愈 伤 第一次继代培养 第二次继代培养 第三次继代培养
验 养 组织的号 墓 来 源 愈伤组 形成芽 芽分化 愈伤组 形成芽 芽分化 愈伤组 形成芽 芽分化
织块数 外植体数 率 (% ) 织块数 外植体数 率 ( % ) 织块数 外植体数 率 (% )
l M 2 C 1 1 2 0
2 M 2 C 2 1 0 4 0
,
0 0 6 8 0 O 4 3 4
,
0 9
.
3 0
3 M 2 C 3 9 2
-
12 1 3
.
0 4 1 4 0 2 4 1 7 1 4 14 4 3 2 2 2
.
2 2
注 : ① “ 一 ”褐化 。
②继代培养时间为 20 ~ 25 天 。
愈伤组织转入分化培养基 ,对激素配 比非常敏感 。 当 K T 2/ . 4一 D < 0 . 4 时 , 85 %以上的愈伤组织
分化出白色绒毛根 。 一旦根先形成 , 就不能再分化出芽 。 当细胞分裂素过高时 , 只在愈伤组织上分
化出肉质的叶原基 , 继代培荞易出现玻璃化现象 ( vi itr fl ca iot n) 。 这种肉质芽苗在 生根培养基上严
试验 简报 ( 1期 )
重褐化 。 -
芽的增殖和生长 芽一旦分化出来 ,就应从愈伤组织上切下 ,以便使芽增殖和抽茎长叶 。 我们
通过正交试验和单因子对比试验 , 设计几十种不同培养基 ,但只见芽的增殖 , 抽茎长叶效果始终不
理想 。 于是 ,着手调整培养基的无机成分 , 找到一个蓝大按继代培养基 ,使增殖 系数明显提高 (表
4 )
,且有效苗壮实 ( 图 1)
表 .4 不同培养基对芽增滩的效应
试验号 培养基 起始芽数 培养 29 天的结果
(个 ) 有效芽 (个 ) 增殖率 (% ) 增殖系数
1 M s 14 4 3 3 1 1 2 9
.
8 0 1
.
30
2 M 刁 5 1 2 6 9 3 7 1
,
4 0 3
,
7 0
3 M 5 4 8 2 5 4 4 2 9
.
10 4
.
3 0
4 M . 6 8 2 3 1 2 3 9
.
7 0 2
.
4 0
从表 4 可以看出 : 改 良 H 和改良 M s 使芽的增殖系数明显增大 ,为探求原因 , 我们对 4 种基本
培养基进行无机成分的定量比较分析 (表 5) 从表 5 可初步看出 : 蓝大按芽的分化和生长 ,特别是对
提高有效苗数 ,增加总氮量 、磷和钙的含量是非常必要的 。 其中芽的抽茎展叶对磷非常敏感 。 磷酸
盐被植物吸收后 ,少数以离子状态存在体内 ,大多数同化为有机物 ,同化部位位于根和地上部分 ,磷
酸盐在大多数细胞中都是通过氧化磷酸化同化为 A T P , 即 A D P + iP 、 A T P + H Z o 这个过程与线粒
表 5 . 不同培养基的无机含量比较 单位 ( m s/ )L
项 目 M S 改 良 M S . H 改良 H
总氮量 8 4 0 . 8 6 6 3 5 8 1 . 0 7 6 0 3 82 . 5 7 3 4 5 2 1 . 7 49 5
按态氮 N H 心N 0 3 2 8 8 75 0 0 6 3 , 0 0 0 0 1 25 . 4 5 5 2 1 7 4 . 2 43 3
( M H ` ) 2 5 0 -
硝态氮 N H弓N o s 28 8 . 7 5 0 0 6 3 , 0 0 0 0 12 5 . 4 5 5 2 1 7 4 . 2 43 3
K N 0 3 26 3
.
3 6 6 3 2 5 0
.
1 98 0 13 1
.
6 6 3 0 1 7 3
.
2 60 9
臼 ( N 0 3 ) : 2 0 4 . 8 78 0
差 值 2 6 3 . 3 6 6 3 4 5 5 . 0 75 0 13 1 . 6 6 3 0 1 7 3 . 2 60 9
含碑量 3 8 . 7 5 0 6 6 1 . 5 4 4 1 1 5 . 5 0 0 0 3 3 . 6 9 57
含钾量 5 36 . 9 5 6 5 5 10 . 1 0 8 7 3 86 . 3 3 17 4 8 2 . 6 7 3 3
含钙量 1 19 . 7 2 7 9 2 0 3 . 3 89 8 4 5 . 17 0 1 4 5 1 7 0 1
体的 N A D H (或唬拍酸 )氧化有联系 ,也与绿叶的光合磷酸化有联系 ,这对于获得壮实的有效苗是非
常重要的 。 通过改良基本培养基 , 已初步摸索出蓝大按芽的分化 、 增殖和生长与无机盐含量的相关
性 ,为下一步筛选较佳培养基奠定基础 。
生根试验 蓝大按组培苗的生根 , 只要短枝健壮 ,一般都能生根 。 当 IBA 浓度在 0 . 5一 I P M 枝
芽的基部总是先形成一团愈伤组织 ,随着 BI A 浓度增大 ,愈伤组织体积越大 ,然后从愈伤组织上长
出的根原基 ,愈伤组织的维管结节和茎的维管束是否连接 , 这对以后移栽成活率的影响很大 ; 当
BI A O~ 0
.
4P P M
,根原基直接从枝的基部长出 ,不产生愈伤组织 。 上面两种情况下根原基的确切起源
及形态发生过程 。 从表 6看出 ,糖浓度为 30 s/ L 时 ,生根率为 0 , 1 s s/ L 时 ,生根率为 84 . 91 % ,不加糖
和 BI A 的培养基上也有 30 %短枝生根 ,这说明根的分化主要依靠内源激素的自身调节 。
试验 简报 (1 2卷 )
表 6诱导生根试验
试验号 培养基 枝芽数 (个 )培养二周 培养四周 生根率 (% )
1 M? 3 8 0O
2 M .67 3 37 1 86
.
1 2
3 Mg 6 3 3 58 9 4
.
91
4M
1 0 43 1 21 3 0
.
23
壮苗 健壮的短枝在适宜的生根培养基上 , 12 ~ 14 天根长便达到 2一 4 c m ,这时加入液体壮苗
培养基 LM ,经 7天的培养 , 叶片变得深绿 ,茎粗壮 ,根系增多 ,且根的尖端呈紫红色 ,透 明发亮 (图
2 )
。 这样优质组培苗移栽成活的可能性很大 。
移栽 将根苗齐全的小植株从培养瓶中移出 , 用清水洗净根部的培养基 , 植入培养基质中 (基
质成分为泥碳土 、 黄沙 , 比例为 2 : l ) ,植后滴少量定根水 。 用玻璃杯保持高湿 , 养护 7 天除去覆盖
物 ,移入大灌木丛下 ,逐步移入大田 ,成活率为 70 纬以上 (图 3) 。
讨论
蓝大按是蓝按 ( E . 娜ob ul us )和大叶按 ( E . 、 b us ot ) 的自然杂交种 , 具有父母本的优 良特性且树
干通直 ,年高生长量 比大叶按和蓝按大 ,如年轮宽度 ,大叶按 8 . 7 6m m , 蓝校 8 . 6 1m m ,而蓝大按则为
12
.
g m m
。 我省科技人员对蓝大按与亲本进行形态特征 、 抗寒性 、 同功酶和材性等方面的详细研究 ,
证明蓝大按在四川比大叶按和蓝按更具发展前途 ,是我省人工选择的优 良自然杂交种 。 它的组培成
功 ,是该树种无性系繁殖的有价值手段之一 。
目前 ,用组织培养法快速繁殖优良树种的苗木已成为林业上种苗生产的一条重要途径 。即采用
优株的芽或枝茎段在组培中繁殖的芽作物产生芽的材料 ,通过多次继代培养增殖芽的数量 ,最后诱
导绿芽生根而形成小植株 ,这种方法又叫 “ 微型繁殖 ”或 “ 微型杆插 ” 。 使杆插的微型化 ,繁殖的扩大
化 , 由于没有经过脱分化过程 ,保证优株优 良特性 ,使组培苗 “ 株株优 ” ,这在无性系林业生产上有广
阔的前景 。 蓝大按组培技术得到最优化之后 ,便可以应用到优良单株的快速繁殖 。
参考文献 :
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〔5〕 D e F o sa dr
.
R
.
A
.
N i t s e h e
.
C r es s w e l l R
.
T
.
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E
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C
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.
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.
F o r e s t s e i
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2 6 7一 2 78 .