全 文 ：角果木 dolabrane型二萜对 Lewis荷瘤
小鼠的抗肿瘤作用
1　通讯作者 , E-mail:liangjun1959@yahoo.com
266003　山东青岛　青岛大学医学院附属医院肿瘤科
孙　蓓 , 王秀美 , 邱文生 , 张红军 , 梁　军 1
　　【摘　要】　目的　研究角果木 dolabrane型二萜对 Lewis荷瘤小鼠皮下移植瘤的抑制作用 , 并初步探讨其作用机制。方
法　建立 Lewis荷瘤小鼠皮下移植瘤模型 , 随机分为角果木 dolabrane型二萜低 、中 、高剂量组(5、10、 20mg/kg)、生理盐水组及
环磷酰胺组(CTX10mg/kg), 各组连续给药 10天 , 停药后 24小时处死小鼠 , 称取各组瘤重 ,计算抑瘤率 , 观察抑瘤作用。应用
流式细胞技术测定肿瘤细胞凋亡率 ,免疫组化方法检测肿瘤相关转录因子 NF-κBp65的表达水平。结果　角果木 dolabrane型
二萜对肿瘤生长有明显的抑制作用 ,高 、中 、低剂量组抑瘤率分别为 44.12%、 25.74%和 22.59%,与生理盐水空白对照组比较
差异有统计学意义(P<0.05), 而与 CTX阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。角果木 dolabrane型二萜各剂量组均
未出现明显的脏器毒性。肿瘤细胞的凋亡率随着角果木 dolabrane型二萜剂量的增加而增高 ,而 NF-κBp65的表达水平则随其
剂量的增加而降低 , 差异具有统计学意义(P<0.05)。结论　角果木 dolabrane型二萜对 Lewis荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长具
有较明显的抑制作用 ,且其作用机制可能与肿瘤凋亡和相关转录因子 NF-κBp65的表达水平降低有关 。
　　【关键词】　角果木 dolabrane型二萜;　Lewis荷瘤小鼠;　抑瘤作用;　凋亡;　NF-κBp65
中图分类号:R734.2　　文献标识码:A　　文章编号:1009-0460(2010)02-0127-05
Anti-tumorefectofthedolabranediterpenesofceriopstagalinLewislungcarcinomamice
　　SUNBei, WANGXiu-mei, QIUWen-sheng, ZHANGHong-jun, LIANGJun.DepartmentofOncology, theAfilia-
tedHospitalofMedicalColege, QingdaoUniversity, Qingdao266003, China
　　Correspondingauthor:LIANGJun, E-mail:liangjun1959@yahoo.com
　　【Abstract】　Objective　Topreliminarilystudytheanti-tumorefectofdolabranediterpenesofceriopstagalinLewislungcar-
cinomamiceanditsmechanism.Methods　AftertheestablishmentofsubcutaneouslytransplantedsolidtumormodelswithLewislung
carcinomacel, allthemodelswererandomlydividedinto5groups:5, 10and20mg/kgdolabranediterpenesgroups, salinegroupas
tumorcontrolgroupandCTX(10 mg/kg)groupaspositivegroup, respectively.Then10dayssuccessiveadministrationweregivento
allthecarcinomamodelsandthemicewerekilled24 hoursafterthelastmedication.Thenthetumorsofeachgroupwereweightedand
thetumorinhibitionrateswerecalculated, aswelasdetectingtheapoptosisratesusingflow-cytometryandtheexpressionlevelofthe
tumor-associatedtranscriptionfactorNF-κBp65 usingimmunohistochemistryrespectively.Results　Thetumorinhibitionratesofthe
20, 10 and5mg/kgdolabranediterpenesgroupswere44.12%, 25.74% and22.59%.Comparedtothetumorcontrolgroup, there
wereobvioustumorinhibitionefectsindolabranediterpenesgroupsandeachgroupdidnothaveobviousorgantoxicity(P<0.05).
Theapoptosisratespositivelycorrelatedwiththedosageofdolabranediterpenes.AndtheexpressionlevelsoftheNF-κBp65 intheex-
perimentalgroupswerelowerthanthatinthecontrolgroup(P<0.05).Conclusion　Thedolabranediterpenesofceriopstagalhas
significantanti-tumorefectintheLewislungcarcinomamiceandthemechanismmayassociatewiththeinducedapoptosisoftumorcell
andthelowerexpressionlevelsofthetumor-associatedtranscriptionfactorNF-κBp65.
　　【KeyWords】　Dolabranediterpenesofceriopstagal;　Lewislungcarcinomamice;　Anti-tumorefect;　Apoptosis;　
NF-κBp65
　　肺癌是最常见的恶性肿瘤之一 ,近年来其发病 率和死亡率都有逐年增加的趋势 ,总的 5年生存率
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仅为 10% ～ 14%。尽管现在应用于临床治疗肺癌
的化疗药物种类繁多 ,但由于存在药物毒性 、作用差
异和交叉耐药等问题不易解决 ,急需开发新型抗肿
瘤药物 。植物来源的抗肿瘤药物的发现及抗癌机理
的研究一直是最活跃的研究领域之一 ,目前多种抗
肿瘤天然药物已用于临床治疗 [ 1] 。天然萜类化合
物 ,尤其是某些二萜化合物以其较强的抗肿瘤 、抗炎
活性越来越受到研究者们的关注 [ 2] 。角果木(ceri-
opstagal)为红树科(Rhizophoraceae)角果木属(Ceri-
ops)的常绿植物 ,主要分布在亚洲热带地区 、非洲
东部和大洋洲 ,在我国主要分布于海南岛 、台湾岛 、
广东和广西 。近年来 ,关于角果木中二萜化合物的
化学成分研究日益增多[ 3-4] ,已有研究分离出一种
新型 dolabrane型二萜 ,但尚无关于该化合物的抗肿
瘤活性研究 。本实验拟探讨 dolabrane型二萜对
Lewis荷瘤小鼠皮下移植瘤的抑制作用及可能机制 ,
为进一步的临床研究提供初步实验依据。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂　角果木 dolabrane型二萜由北京
大学天然药物及仿生药物国家重点实验室提供(图
1);兔抗人 NF-κBp65多克隆抗体购自美国 CelSig-
nalingTechnology公司;PV-9000二步法免疫组化试
剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其它主
要试剂均购自美国 Gibco公司 。
图 1　角果木 dolabrane型二萜化学结构图
1.2　细胞株与实验动物　Lewis肺癌细胞株购自中
国科学院上海细胞生物研究所细胞库;C57BL/6小鼠
购于中科院实验动物研究所(50只 ,雌雄各半 , 4 ～ 5周
龄 ,体重 19 ～ 20g),许可证号:SCXK(京)2004-0001。
1.3　实验方法
1.3.1　细胞培养与动物模型建立　Lewis肺癌细胞
株培养于含 10%标准胎牛血清的 RPMI-1640培养液
中 ,在 37℃、5%CO2的条件下常规培养。收集对数生
长期的细胞并制备成浓度为 3×107 /ml的单细胞悬
液 ,在 C57BL/6小鼠腋窝区皮下注射 0.2ml的单细胞
悬液 ,注射局部出现明显皮丘 , 7天后所有小鼠均出
现直径大于 5mm的皮下结节 ,移植瘤模型成功建立。
1.3.2　分组干预及抑瘤作用观察　于接种后第 8
天将已建立移植瘤模型的 50只小鼠随机分为生理
盐水空白对照组 、环磷酰胺(CTX)阳性对照组和 5、
10、20mg/kg角果木 dolabrane型二萜实验组。阳性
对照组给予腹腔注射 CTX10mg/kg,生理盐水组与
角果木高 、中 、低剂量组给予灌胃 , 均连续给药 10
天。给药期间密切观察小鼠的一般状况 ,包括精神
状态 、大小便 、饮食及活动 ,并隔日称量小鼠体重。
于停药后 24h处死小鼠 ,剥离瘤组织并称重 ,根据公
式:抑瘤率 =(1 -实验组平均瘤重 /对照组平均瘤
重)×100%, 计算抑瘤率。然后将瘤组织固定于
4%多聚甲醛溶液以备免疫组化检测 。同时剥离心
脏 、肝 、肺 、肾 、脾脏及胰腺 ,观察脏器毒性。
1.3.3　细胞凋亡率的检测　于移植瘤周边取部分
肿瘤组织 ,固定于 70%的冰乙醇 ,通过研磨及胃蛋
白酶消化后制备成长单细胞悬液 ,低速离心去细胞
碎片 、PBS洗涤 ,离心分离部分细胞 ,于室温避光 PI
染色后上流式细胞仪进行细胞凋亡率的测定 。
1.3.4　NF-κBp65表达水平检测　采用免疫组化
PowerVisionTM二步法进行 NF-κBp65蛋白表达的
检测 ,操作步骤按试剂盒要求进行。以 PBS代替一
抗作阴性对照 ,已知的阳性切片作阳性对照。采用
双盲法阅片。 NF-κBp65蛋白染色阳性信号颗粒呈
棕黄色 ,位于胞核和胞质中 。高倍镜下(10×40)每
张片随机选 20个视野 ,计数阳性细胞数 。结果判
断:染色强度与背景无明显差别为(-),阳性细胞
数 <25%为(+), 25% ～ 50%为 (++), >50%为
(+++)。
1.4　统计学分析　数据以 x±s表示 ,采用 SPSS
12.0统计软件进行分析。多样本均数比较采用方
差分析 ,计数资料采用非参数检验(H检验法)。以
P<0.05为差异有统计学意义。
2　结　果
2.1　角果木 dolabrane型二萜的抑瘤作用　通过对
各组给药 10天后停药 24h瘤重分析 。角果木 dola-
brane型二萜高 、中剂量组移植瘤的重量显著低于空
白对照组 (P<0.05),其高 、中 、低剂量组的抑瘤率
分别为 44.12%、 25.74%及 22.59%, 与 CTX阳性
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对照组的抑瘤率(36.53%)比较 ,差异无统计学意 义(P>0.05)。见表 1。
表 1　角果木 dolabrane型二萜对 Lewis荷瘤小鼠体重 、瘤重及抑瘤率的影响( x±s)
组别 剂量(mg/kg)
动物数(只) 体重(g)
实验开始 实验结束 实验开始 实验结束 瘤重(g)
抑瘤率
(%)
空白对照组 - 10 10 19.64±0.36 20.84±0.43 1.04±0.18 -
低剂量组 5 10 10 19.91±0.39 20.69±0.79 0.90±0.16 22.59
中剂量组 10 10 10 19.76±0.45 20.50±0.48 0.77±0.21＊ 25.74
高剂量组 20 10 10 19.81±0.55 20.71±0.47 0.59±0.17＊＊ 44.12
阳性对照组 10 10 10 19.69±0.47 16.82±1.93 0.63±0.25＊＊ 36.53
　注:与空白对照组比较 , ＊P<0.05;＊＊P<0.01
2.2　角果木 dolabrane型二萜的脏器毒性　计算各
重要脏器的脏器系数 ,结果显示角果木 dolabrne型
二萜不同剂量组对各脏器无明显毒性 ,与空白对照
组比较 ,差异无统计学意义(P>0.05)。而 CTX阳
性对照组的肝系数较空白对照组明显升高 (P<
0.05),肝脏增大 ,其他脏器在实验观察时间内未见
明显异常 。见表 2。
表 2　角果木 dolabrane型二萜对 Lewis荷瘤小鼠脏器系数的影响( x±s)
组别 剂量(mg/kg) 胸腺系数 脾系数 心脏系数 肝系数 肾系数 肺系数
空白对照组 - 3.62±0.64 6.76±1.07 4.67±0.76 43.96±2.37 5.63±1.11 6.61±1.22
低剂量组 5 3.56±0.78 6.68±1.17 5.10±0.94 49.06±3.26 4.72±0.90 6.60±0.86
中剂量组 10 3.47±0.81 6.44±1.68 4.82±0.95 48.16±4.05 5.32±0.52 6.74±0.79
高剂量组 20 3.39±0.53 6.30±1.09 4.22±0.98 45.63±3.24 5.22±0.87 5.70±1.04
阳性对照组 10 3.58±0.90 6.57±1.24 4.69±0.74 61.55±4.18＊ 5.56±0.91 6.55±1.37
　注:与空白对照组比较 , ＊P<0.01
2.3　角果木 dolabrane型二萜诱导移植瘤组织的凋
亡作用　流式细胞仪分析显示 ,用药各组均出现典
型的亚 G1 期凋亡峰 。空白对照组和角果木 dola-
brane型二萜低 、中 、高剂量组的凋亡率分别为(5.67
±0.39)%、(13.82±0.62)%、(17.39±0.71)%和
(19.38 ±0.46)%。在肿瘤模型中 , 角果木 dola-
brane型二萜各剂量组凋亡率均高于空白对照组(P
<0.01),且随剂量增加凋亡率增高 ,各组间差别有
统计学意义(P<0.05)。见图 2。
2.4　NF-κBp65的表达水平　光镜下 NF-κBp65的
表达阳性细胞呈棕黄色(图 3)。NF-κBp65蛋白在
空白对照组中阳性表达率显著高于其他各组。随角
果木 dolabrane型二萜剂量的增加 , NF-κBp65蛋白
阳性表达率降低 ,与空白对照组比较 ,差异有统计学
意义(P<0.05),而与 CTX阳性对照组比较 ,差异
无统计学意义(P>0.05)。见表 3。
表 3　NF-κBp65蛋白在不同组别中的表达
组别 n NF-κBp65- + ++ +++
阳性率
(%)
空白对照组 10 0 1 2 7 100
低剂量组 10 2 2 3 3 　80＊
中剂量组 10 3 4 2 1 　70＊
高剂量组 10 3 5 2 0 　70＊
阳性对照组 10 4 4 2 0 60
　注:与空白对照组比较 , ＊P<0.05
3　讨　论
肺癌是当前世界最常见的恶性肿瘤之一 , 2000
年美国临床肿瘤协会 (AmericaSocietyofClinical
Oncology, ASCO)公布的美国肺癌发病人数为 164
100,列恶性肿瘤的第 3位 ,而死亡率则列恶性肿瘤
第 1位[ 5] 。随着工业化进程及人口日益老龄化 ,我
国肺癌的发病率及病死率呈逐年上升趋势 ,许多地
区特别是城市 ,肺癌已成为第 1位死亡原因 。化学药
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图 2　角果木 dolabrane型二萜不同剂量处理移植瘤组织的流式细胞检测图
图 3　NF-κBp65蛋白在 Lewis肺癌细胞移植瘤组织中的表达(PowerVision×400)
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物治疗是治疗肺癌的主要手段之一 ,随着科技的不
断进步 ,各种新型化疗药物的研制层出不穷 ,但由于
存在化学药物毒性 、作用差异以及交叉耐药等问题
不易解决 ,急需开发新型的抗肿瘤药物。二萜类化
合物在自然界中广泛存在 ,生物活性多样 ,具有较强
的抗微生物 、抗氧化和清除自由基等作用 。近年来
在抗肿瘤药物的筛选过程中发现 ,许多植物中的二
萜类物质具有抗肿瘤作用 [ 6-8] 。
角果木 (ceriopstagal)为红树科(Rhizophorace-
ae)角果木属(Ceriops)植物 ,主要分布在非洲沿海 、
南亚及南太平洋岛 ,富含鞣质和五环三萜 、二萜 [ 9] 。
在我国民间角果木的树皮捣碎可以止血 、收敛 、通便
和治疗恶疮;种子榨油可以止痒 、治疗疥癣及冻疮;
叶煎汁曾作为奎宁替代品治疗疟疾。近期研究发现
角果木代谢物中含有一种 dolabrane型二萜 ,是一种
新型二萜化合物 ,但目前尚无该化合物抗肿瘤活性
的相关研究。通过本实验证实 , 该二萜化合物对
Lewis荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长具有较明显的抑
制作用 ,诱导肿瘤细胞发生了凋亡。
核因子 -κB(nuclearfactorkappaB, NF-κB)于
1986年首先从成熟 B淋巴细胞核抽取物中检出
的 [ 10] ,广泛存在于真核生物中 ,属于一个由复杂的
多肽亚单位组成的蛋白家族 ,最常见的二聚体是
p50/ReLA(p65)异源二聚体 , p65是 NF-κB活性形
式中具有转录激活作用的主要成分。目前的研究认
为它与炎症 、免疫反应 、创伤 、细胞增殖 、细胞凋亡以
及胚胎发育等重要事件有着密切联系 。近年来研究
发现 , NF-κB活性的失控导致哺乳动物的系统肿瘤
发生 ,在许多肿瘤中均可见到 NF-κB的异常活化 。
免疫组化检测出 NF-κB在正常组织中可出现微弱
表达或不表达 ,证实正常情况下 NF-κB处于不断地
激活和失活的有序调控中 ,是细胞调节正常生理功
能 、维持生理平衡所必需的 。而在胃癌 、胰腺癌 、结
肠癌 、乳腺癌等恶性肿瘤组织中均检测到 NF-κB的
高表达 [ 11-12] 。
本实验结果表明 , NF-κBp65在角果木 dolabrane
型二萜不同剂量组的阳性表达率较空白对照组低 ,
提示在角果木 dolabrane型二萜的作用下 ,抑制了
NF-κB介导的肿瘤生长途径 ,具体的作用机制还需
要进一步的研究探讨。
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收稿日期:2009-09-08;　修回日期:2009-11-05
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