全 文 ：第 23卷第 4期
2005年 7月
泉州师范学院学报(自然科学)
Journal of Quanzhou Normal U niversi ty(Natural Science)
Vol. 23　No. 4
Jul. 2005
赤楠种子醇提液抑菌活性及其总黄酮含量测定
黄　晓　冬
(泉州师范学院 教科院 , 福建 泉州　362000)
　　摘　要:对赤楠种子醇提液进行抑菌试验和总黄酮含量测定 ,结果表明:赤楠种子醇提液对金
黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌 、大肠杆菌 、普通变形杆菌 、八叠球菌等具有较强的抑菌活性 , 这可能
与赤楠种子总黄酮含量存在一定的正相关 ,以不同浓度的酒精 、料液比 、提取温度及提取时间等因
子对种子醇提液总黄酮提取进行正交实验 ,并用聚酰胺吸附 -硝酸铝显色法测定其总黄酮含量 ,
得其最佳提取条件为料液比 1 /35 、55%乙醇 70 ℃～ 80 ℃提取3 h ,不同成熟度种子的总黄酮含量
分别为青种子 3. 61%、成熟种子 3. 39%. ①
　　关键词:赤楠;种子醇提液;抑菌活性;总黄酮;正交试验
　　中图分类号:Q949. 741. 5　 文献标识码:A　文章编号:1009 - 8224(2005)04 - 0105 - 05　
赤楠(Sy zygium bux i folium Hook. et. Arn)为桃金娘科蒲桃属的常绿灌木 ,多生于低山
疏林或灌丛中 ,广布于两广 、贵州 、湖南 、台湾 、江西 、浙江 、安徽等省 ,福建各地也极常见[ 1] ,资
源极为丰富.赤楠果实丛生枝顶 ,为浆果核果状 ,内含种子 1枚 ,占果实的比例大.鉴于对赤楠
种子化学成分与生物活性的研究未见报道 ,本文对不同成熟度的赤楠种子醇提液进行抑菌试
验 ,并借鉴赤楠茎 、叶 、果皮黄酮类化合物定性与定量研究的方法[ 2] ,以正交试验的优化条件
测定其含量 ,拟为赤楠种子的开发利用提供基础和科学依据.
1　材料与方法
1. 1　材料
不同成熟期的赤楠果实分期采自福州鼓山 ,若将不同成熟期的果实分为青果(外果皮色
青或青红)、成熟果实(外果皮色紫黑),则对应地将种子分成青种子 、成熟种子等 2类. 2类种
子分别粉碎 、低温烘干备用.
1. 2　供试菌种
细菌:大肠杆菌 (Escherichia col i), 普通变形杆菌(Proteus vulgaris), 枯草芽孢杆菌
(Baci l lus subti l is), 藤黄八叠球菌 (Sarcina lutea), 金黄色葡萄球菌 (Staphy lococcus
aureus). 霉菌:黄曲霉(Aspergi l lus f lavas), 青霉(Penici l lium sp), 黑曲霉(Aspergi l lus
① 收稿日期:2005 - 01 - 05
作者简介:黄晓冬(1973 - 　),男 ,福建南安人 ,讲师 , 硕士 ,从事植物资源研究.
DOI牶牨牥牣牨牰牨牪牭牤j牣cnki牣牨牥牥牴牠牳牪牪牬牣牪牥牥牭牣牥牬牣牥牪牪
niger). 以上菌种均由福建师范大学生物工程学院微生物教研组提供.
1. 3　培养基
细菌用培养基:营养琼脂培养基 ,成分为蛋白胨 10 g , 牛肉膏粉 3 g ,氯化钠 5 g ,琼脂
13 g ,加蒸馏水至 1 000 m l ,pH7. 2 ～ 7. 4.
霉菌用培养基:马铃薯培养基 ,市售新鲜马铃薯 、去皮切成小块 ,称 100 g 加水约 400 ml
煮沸 30 min ,纱布过滤 ,加葡萄糖 10 g ,琼脂条 10 g ,加蒸馏水至 500 ml.
1. 4　菌悬液或孢子悬液制备
采用平板菌落计数法[ 3] .将受试菌在斜面培养基活化 2 - 3代后 ,用接种环从斜面上轻刮
菌苔一环 ,分别收集到内盛 10 ml无菌水的小三角瓶中 ,配成终浓度为 0. 5×107 个 ml - 1的菌
悬液和 104 个 ml -1孢子悬液 ,备用.
1. 5　抗菌活性的测定
1. 5. 1　样液制备　以 95%乙醇抽提赤楠叶 、茎 、种子粉末 ,配成浓度为 100 mg /m l的醇提
液 ,对应乙醇浓度为 38%.
1. 5. 2　管碟法　用无菌移液枪吸取菌液 0. 2 ml均匀地涂布于平板表面 ,在每平皿中等距离
放入四只灭菌的牛津杯(规格 10 mm×7. 8 mm×6 mm),并在每个牛津杯中用无菌移液枪加
入样液 200 μl ,以无菌水CK1与空白 CK2(不含提取物的样液 ,即 38%乙醇)作为对照.按各菌
适合温度恒温培养 ,细菌 37 ℃恒温培养 24 h ,霉菌28 ℃恒温培养48 h ,观察抑菌情况 ,并用游标
卡尺测量抑菌环直径 ,每种菌重复实验 3个平板 ,求平均值 ,以此评价其抑菌效果.
1. 6　种子醇提液总黄酮的测定
1. 6. 1　赤楠种子化学成分预实验　称取青种子 、成熟种子粉末各 1. 0 g ,各加 70%乙醇 ,索
氏抽提 30 min ,得抽提液 ,取抽提液作系列颜色反应的预实验 ,检识黄酮类化合物的有无.
1. 6. 2　芦丁标准曲线的制备　精确吸取 0. 1 mg /ml的芦丁标准液 0 、1. 0 、2. 0 、3. 0 、4. 0 、5. 0
ml于6只具塞试管中 ,各加60%乙醇使成5 m l ,加5%NaNO 2 溶液 0. 3 m l ,摇匀 ,放置6 min;
加 10%Al(NO 3)3 溶液 0. 3 ml ,摇匀 ,放置 6 min;加 1 mol /L N aOH 溶液 4 ml ,加蒸馏水 0. 4
ml ,摇匀 ,放置 15 min ,于最大吸收波长 510 nm 处测定吸光度 ,以吸光度对标样含量作图.
1. 6. 3　样品处理及总黄酮含量测定　提取:精确称取经干燥 、粉碎的不同成熟期种子粉末各
1. 00 g ,置于锥形瓶中 ,用一定体积分数的乙醇 ,水浴加热回流提取 ,收集提取液 ,定容至 50
ml.聚酰胺吸附层离:分别准确吸取滤液 5 ml ,加入 300 mg 聚酰胺 ,搅匀 ,转移到铺有 300 mg
聚酰胺的砂芯漏斗中 ,用少于 50 m l的 60%乙醇洗脱数次 ,定容至 50 ml.
样液显色测定:精确吸取样液 5 ml于具塞试管中 ,加 5%NaNO2 溶液 0. 3 m l ,摇匀 ,放置
6 min ,加 10%Al(NO 3)3 溶液 0. 3 m l ,摇匀 ,放置 6 min ,加 1 mol /LNaOH 溶液 4 ml ,加水
0. 4 ml ,摇匀 ,放置 15 min ,以试剂空白为对照 ,于最大吸收波长 510 nm 处测定吸光度 ,查标
准曲线 ,得所取样液中总黄酮含量.样品中总黄酮含量的计算公式[ 4] 如下:
样品中总黄酮含量(以芦丁计)(%)= CV 1V3
WV2 V4
× 1
10
,
式中:C为样液含总黄酮量(mg);V1 为抽提后定容体积(ml);V2 为聚酰胺处理时取样体积
(ml);V 3 为聚酰胺处理后定容体积(ml);V4 为显色反应测定取用样液体积(ml);W 为称样
量(g).
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1. 6. 4　提取条件的正交优选　由于提取率实际上是受到乙醇体积分数 、料液比 、提取时间 、
提取温度 4个因素交叉影响 , 为全面考察这 4 个因素的影响 ,以成熟种子为样品 ,设计了
L9(34)正交与实验(见表 1),并对结果进行直观分析和方差分析 ,优选最佳提取条件.
表 1　L9(34)因子水平表
水平 A 乙醇浓度 /% B 温度 /℃ C 提取时间 /h D料液比 /g /ml
1 85 50～ 60 3 1∶25
2 55 70～ 80 1 1∶15
3 70 90～ 100 2 1∶35
1. 6. 5　不同成熟期种子总黄酮含量测定与比较　以正交优选的最佳条件提取不同成熟期种
子的总黄酮 ,进行含量测定与比较.
2　结果与分析
2. 1　赤楠种子醇提液的抑菌活性
赤楠叶 、茎 、种子醇提液的抑菌活性比较研究显示(见表 2):对照 CK1 与空白 CK2均无
抑菌活性 ,赤楠种子 、叶 、茎等醇提液在ρ=100 mg /m l时均对 3 种霉菌没有抑菌作用 ,对 5 种
细菌抑菌总体效果以青种子醇提液抑菌活性最强 ,其次分别为成熟种子醇提液 、叶醇提液与
茎醇提液.总体上 ,种子醇提液对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑菌作用 ,具有广谱性.
表 2　赤楠叶 、茎 、种子醇提液的抑菌环直径 /mm
供试菌种 叶 茎 青种子 成熟种子
大肠杆菌 13 - 17 12
金黄色葡萄球菌 13 10 16 13
枯草芽孢杆菌 13 9 17 18
八叠球菌 13 11 16 13
普通变形杆菌 12 11 13 16
　　注:“ -”表示无抑菌环 , 醇提液浓度ρ=100 mg /ml.
2. 2　赤楠种子醇提液的总黄酮含量测定
2. 2. 1　赤楠种子黄酮类化合物的颜色反应　表 3的颜色反应与黄酮类化合物的颜色反应相
似 ,说明不同成熟度的赤楠种子均含有黄酮类化合物.
表 3　赤楠种子总黄酮的检识
试剂名称 盐酸锌粉反应(微加热)
3%AlCl3 乙醇*
(紫外光观察) 1%FeCl3 1%醋酸铅 浓硫酸 1NNaOH
青种子 橙红 黄绿色 蓝绿 橙红色沉淀 橙 棕红
成熟种子 橙 黄绿色 蓝绿 黄色沉淀 橙红 棕色
　　注:*滤纸上进行.
2. 2. 2　芦丁标准曲线　图 1以一元线性回归分析 ,得标准曲线为 Y=1. 245X - 0. 0055 ,线性
范围为 0 ～ 0. 5 mg /10 ml ,相关系数 r=0. 9992.
2. 2. 3　赤楠种子总黄酮最佳提取条件优选　从表 4的直观分析与表 5的方差分析可知 , 4种
因素影响种子总黄酮浸提率的主次顺序依次为 B >A>D>C ,最佳组合为 A 2 B2C1D3 ,即 35
倍原料重的 55%乙醇溶液 ,在 70 ℃～ 80 ℃条件下提取 3 h.
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图 1　芦丁标准浓度与吸光度的关系
表 4　正交设计方案与结果
A B C D
成熟种子
总黄酮含量 /% T i
1 1 1 1 1 0. 70 0. 65 0. 77 2. 12
2 1 2 2 2 1. 93 1. 80 2. 01 5. 74
3 1 3 3 3 1. 84 1. 75 1. 91 5. 50
4 2 1 2 3 1. 83 1. 79 1. 85 5. 47
5 2 2 3 1 3. 09 3. 15 3. 01 9. 25
6 2 3 1 2 2. 30 2. 25 2. 18 6. 73
7 3 1 3 2 1. 04 0. 99 1. 07 3. 10
8 3 2 1 3 3. 03 3. 12 2. 99 9. 14
9 3 3 2 1 1. 97 1. 90 2. 03 5. 90
K 1 13. 36 10. 69 17. 99 17. 27 52. 95
K 2 21. 45 24. 13 17. 11 15. 57
K 3 18. 14 18. 13 17. 85 20. 11
R 8. 09 13. 44 0. 88 4. 54
　　注:K i为对应的 T i之和 , R 为 Kmax与 Kmin之差 .
表 5　方差分析表
方差来源 　　平方和 自由度 均差方 F 值
A 乙醇浓度 3. 676 2 1. 838 459. 50 **
B 温度 10. 074 2 5. 037 1 259. 25 **
C 时间 0. 050 2 0. 025 0. 625　
D料液比 1. 169 2 0. 585 146. 25 **
误差 E 0. 071 18 0. 004
　　注:F0. 05(2 , 18)=3. 55 , F 0. 01(2 , 18)=6. 01 , *代表显著水平 , **代表极显著水平.
2. 2. 4　不同成熟期种子总黄酮含量测定　以最佳提取条件抽提不同成熟度种子总黄酮 ,聚
酰胺吸附 -硝酸铝显色法测定相应总黄酮含量 ,得出平均总黄酮含量:青种子为3. 61%,成熟
种子为 3. 39%.
3　讨论与结论
(1)赤楠种子醇提液具有较强的广谱抗菌性 ,特别是对耐药性强的金黄色葡萄球菌和潜
伏性强的枯草芽孢杆菌均有较强抑制效应.
(2)实验表明 ,赤楠种子可积累一定量的黄酮类化合物 ,虽随着果实的成熟其含量呈微量
递减的动态 ,但仍保持较高的水平. 其中 ,青种子为 3. 61%,成熟种子为 3. 39%.由于赤楠果
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可食 ,果实色素可开发成天然食用色素[ 5] ,种子较高的总黄酮含量和较强抑菌活性意味着果
实综合利用 、种子药用的可能性. 已有研究表明黄酮类化合物具有抗炎 、抗菌及抗病毒的作
用[ 6] ,因而赤楠种子醇提液较强的抑菌活性可能与种子较高的总黄酮含量存在一定的相关
性 ,关于种子醇提液中有效抑菌成分有待进一步深入研究.
(3)探讨 4个因素对种子总黄酮提取率的影响时 ,发现 4种因素对浸提效果影响大小依
次为 B>A>D>C ,最佳组合为 A 2 B2C1D 3 ,即 35倍原料重的 55%乙醇溶液 ,在 70 ℃～ 80 ℃
条件下提取 3 h.从产业开发来讲 ,低体积分数的乙醇提取效果好 ,有利于降低成本;提取时间
各水平间无显著差异 ,因而可采用 1 h 作为优化条件以节约成本;而较高的料液比 、提取温
度 ,虽有利于得到较高提取率 ,但却增加了生产成本 ,对两者适当进行调整是取得较好经济效
益的必然选择.
参 考 文 献:
[ 1] 　福建植物志编写组.福建植物志(第四卷)[ M] .福州:福建科学技术出版社 , 1990. 78 - 100.
[ 2] 　黄晓冬 ,刘剑秋 ,陈炳华.赤楠茎叶果总黄酮提取与含量测定[ J] .泉州师范学院学报 , 2003 , 21(4):72 - 75.
[ 3] 　范秀容 ,李广武 ,沈萍.微生物学实验(第二版)[ M] .北京:高等教育出版社 , 1996. 138 - 262.
[ 4] 　元晓梅 ,蒋明蔚 ,胡正芝. 聚酰胺吸附 - 硝酸铝显色法测定山楂及山楂制品中的总黄酮含量[ J] . 食品与发酵工业 ,
1996 ,(4):27 - 32.
[ 5] 　黄晓冬 ,刘剑秋 ,陈炳华 ,等.赤楠果实红色素的性质及其稳定性[ J] .福建师范大学学报 , 2003 , 19(3):82 - 87 .
[ 6] 　姚新生.天然药物化学(第三版)[ M ] .北京:人民卫生出版社 , 2001. 167 - 208.
Antibacterial Activities and Total Flavonoids Determination
of Alcohol Extracts from Syzygium buxif olium Seeds
HUANG Xiao-dong
(Institute of Educational Science , Quanzhou Normal Unive rsity , Fujian 362000 , China)
Abstract:Antibacte rial expe riments and total f lav ones determination of the alcohol e xt racts
f rom the seeds of Sy z yg ium bu xi f ol ium Hook. et. Arn show ed that the alcohol ex t racts f rom
the seeds had strong antibacterial activit ies against Staphy lococcus aureus ,Baci l lus subt i lis ,
Escherichia coli , Proteus vulgaris and Sarcina lutea , which w ere possibly in po sitive rela-
tion to to tal f lavones content of the Syz ygium bux i folium seeds . Total f lav ones was ext rac-
ted by solid - liquid ratio(1 /35), by 55% ethano l at 70 - 80℃ for 3 hours , which were the
optimum condi tions analyzed f rom the or thogonal experiment , and then purif ied by poly cap-
rolactan , produced color w ith aluminium nit rate , f inally ,determined that f lavonoid content in
the unripe seeds w as 3. 61%, in the ripped seeds w as 3. 39%.
Key words:Sy z ygium bux i folium ;alcohol ex t racts from the seeds;ant ibacterial activity;
to tal f lav onoid;orthogonal experiment
109　第 4期 黄晓冬:赤楠种子醇提液抑菌活性及其总黄酮含量测定