全 文 ：伯 仲 论 坛
狼毒大戟中巴豆烷型二萜的抗肿瘤活性研究
王蒙，魏晴，王秋红，夏永刚，杨炳友，匡海学*
(黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，黑龙江省中药及天然药物
药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的: 研究狼毒大戟( Euphorbia fischeriana Steud． ) 中巴豆烷( Tigliane) 型二萜的抗肿瘤活性。方
法: 采用硅胶柱色谱、ODS、Sephadex LH － 20 分离化学成分，根据理化性质和波谱数据确定化合物结
构，并对得到的化合物进行抗肿瘤活性研究。结果: 从狼毒大戟中共分离鉴定了 3 个巴豆烷型二萜化
合物，分别为: prostratin( 1) 、Langduin A( 2) 和 13 － O － Acetylphorbol( 3) ，同时利用肝癌 HepG － 2 细胞、
胃癌 SGC －7901 细胞和乳腺癌 MCF － 7 细胞进行抗肿瘤实验。结论: 在 MTT 抗肿瘤实验中，化合物
prostratin对肝癌和乳腺癌有显著的抗肿瘤活性、Langduin A 对胃癌和乳腺癌有抗肿瘤活性、13 － O －
Acetylphorbol仅对乳腺癌有抗肿瘤活性。
关键词:狼毒大戟;巴豆烷型二萜;抗肿瘤活性; MTT
中图分类号:Ｒ284． 1;Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1002 － 2392(2013)04 － 0011 － 04
收稿日期:2013 － 03 － 20 修回日期:2013 － 04 － 15
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973 计划) (No． 2013CB531801)
作者简介:王蒙(1987 －) ，男，硕士研究生，主要从事中药药效物质基础
及新药研究。E － mail:wangmenghlj@ sina． com
* 通讯作者:匡海学(1955 －) ，男，教授，博士研究生导师。研究方向:
中药及天然药物药效物质基础、中药性味理论研究。
狼毒大戟是大戟科 Euphorbiaceaev 大戟属 Eu-
phorbia植物狼毒大戟 Euphorbia fischeriana Steud．的干
燥根，为药典规定中药狼毒的品种之一。广泛分布于
黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等省，资源丰富。狼毒大戟
始载于《神农本草经》，味苦、辛，性平，有大毒，具有祛
痰逐水，破积杀虫之功效。该药主要用于治疗水肿腹
胀，痰食虫积，心腹疼痛，症瘕积聚，结核，疥癣等，民间
多用来治疗肿瘤、结核等病［1 － 4］。近年来有关狼毒大
戟的报道也较多集中在抗肿瘤方面，并从中分离出一
系列有抗肿瘤活性的化学成分，因而引起人们的广泛
关注［5 － 7］。
1 仪器与材料
1． 1 药材
实验药材于 2010 年 9 月采于黑龙江省林甸县，经
黑龙江中医药大学生药教研室王振月教授鉴定为植物
(Euphorbia fischeriana Steud．)狼毒大戟，原植物标本
保存于黑龙江中医药大学药学院中药化学教研室。
1． 2 仪器和试药
Bruker － 400 型核磁共振光谱仪，Delta 600 － 2487
制备型 HPLC(美国 Waters 公司) ;制备型色谱柱 Hy-
persil － ODSⅡ(10μm，20mm ×300mm) (大连依利特公
司) ;硅胶(青岛海洋化工厂，80 ～ 100，200 ～ 300 目) ;
酶标仪(PerkinElmer 公司，VICTOＲ X3 型) ;倒置显微
镜(ZEISS公司，Vert． A1) ;二氧化碳培养箱(上海力申
科学仪器有限公司，HF 151UV) ;超净工作台(北京王
堂蓝翼科技有限公司，WT － IND) ;低速台式离心机
(上海安亭科学仪器厂，TDL －4) ;电热恒温水浴锅(上
海一恒科技仪器有限公司，HWS －24)。
人肝癌细胞 HepG －2、人胃癌细胞 SGC － 7901 和
人乳腺癌细胞 MCF － 7(哈尔滨医科大学附属肿瘤医
院) ;Hylcone改良型 ＲPMI － 1640 培养液(赛默飞世尔
生物化学制品(北京)有限公司) ;FCS 胎牛血清(美国
Gibco公司) ;胰蛋白酶(美国 Sigma 公司) ;MTT 噻唑
蓝(北京泛基诺生物技术有限公司) ;DMSO 二甲基亚
砜(北京化学试剂厂) ;青霉素、链霉素(华北制药厂) ;
五氟尿嘧啶 5 － fluorouracil(广州宝芝林大药房)。
1． 3 样品制备
狼毒大戟乙酸乙酯有效部位经硅胶柱层析分成五
个部分(Fr．Ⅰ ～ Fr． Ⅴ) ，采用硅胶、ODS 反相柱色谱、
Sephadex LH －20 柱色谱以及 HPLC 等分离方法进行
分离，所得巴豆烷型二萜 prostratin、Langduin A和 13 －
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O － Acetylphorbol。将以上获得的单体化合物减压干
燥，挥干溶剂后，分别用 DMSO 溶解，无血清培养液配
制成 200μM 的储备液置于 － 20℃保存。临用前用
ＲPMI － 1640 培养液稀释至所需浓度(2． 5μM，5μM，
10μM，25μM，40μM，80μM，150μM，200μM) ，DMSO 终
浓度控制在 0． 1%以下，试液现用现配。此过程需在
超净工作台内无菌操作完成。
2 提取分离
将狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud．)干燥的
根 3kg，用 95% EtOH 回流提取 3 次，每次 2h，滤过，合
并乙醇液，减压回收，得乙醇提取物(250g) ，提取物用
适量水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃
取，回收溶剂分别得石油醚部分、乙酸乙酯部分及正丁
醇部分。将乙酸乙酯层部分(125g)经过硅胶柱(二氯
甲烷 －甲醇)得组分 Fr． Ⅰ ～ Fr． Ⅴ，然后反复采用硅
胶柱色谱、ODS 反相柱色谱以及 HPLC 等现代分离技
术与方法进行分离，共分离得到 3 个单体化合物。化
合物 1(33mg) ，化合物 2(25mg) ，化合物 3(22mg)。
3 结构鉴定
化合物 1 为白色粉末，EI － MS m /z:379(C21 H31
O6)。
1H － NMＲ(CDCl3)δ:7． 58(1H，s，1 － H) ，5． 66
(1H，d，J = 4． 8Hz，7 － H) ，4． 04(d，1H，J = 12． 8Hz，
20 － H) ，3． 97(d，1H，J = 12． 7Hz，20 － H) ，3． 26(1H，
s，10 － H) ，3． 00(1H，t，J = 5． 4Hz，8 － H) ，2． 53(1H，
d，J = 19． 0Hz，5 － H) ，2． 50(1H，d，J = 19． 0Hz，5 －
H) ，2. 08(1H，d，J = 7． 0Hz，12 － H) ，2． 06(3H，s，
22 － H) ，1． 96(1H，m，11 － H) ，1． 76(3H，dd，J = 1． 3，
2． 8Hz，19 － H) ，1． 56(1H，，dd，J = 11． 2，14． 5Hz，12 －
H) ，1． 19(3H，s，16 － H) ，1． 06(3H，s，17 － H) ，0． 88
(3H，d，J = 6． 4Hz，18 － H) ，0． 84(1H，d，J = 5． 3Hz，
14 － H) ;13C － NMＲ(CDCl3)δ:161． 2(C － 1) ，132． 8
(C －2) ，209. 2(C －3) ，73． 8(C － 4) ，38． 6(C － 5) ，
139． 9(C － 6) ，130． 2(C － 7) ，39． 1(C － 8) ，76． 7
(C －9) ，55. 8(C － 10) ，36． 3(C － 11) ，31． 8(C －
12) ，63． 6(C － 13) ，32． 4(C － 14) ，23． 2(C － 15) ，
22． 6(C － 16) ，15． 3(C － 17) ，18． 5(C － 18) ，10． 1
(C －19) ，68． 2(C － 20) ，173． 2(C － 21) ，21． 2(C －
22)。以上数据与文献报道的 prostratin［8］进行对照，
鉴定化合物 1 为 prostratin。1 H － NMＲ 和13 C － NMＲ 数
据归属见表 1 和表 2。
化合物 2 为白色粉末，EI － MS m /z:363(C21 H31
O7)。
1H － NMＲ(MeOD)δ:7． 56(1H，s，1 － H) ，5． 46
(1H，d，J = 4． 6Hz，7 － H) ，3． 94(2H，d，J = 4． 6Hz，
20 － H) ，3． 73(1H，m，8 － H) ，3． 04(1H，t，J = 2． 4Hz，
10 － H) ，2． 71(1H，dd，J = 7． 1，14． 8Hz，11 － H) ，2． 55
(1H，m，5 － H) ，2． 47(1H，m，5 － H) ，2． 43(1H，d，J =
1． 9Hz，12 － H) ，2． 40(1H，s，14 － H) ，2． 07(1H，dd，
J = 7． 0，13． 7Hz，12 － H) ，1． 94(1H，m． 15 － H) ，1． 77
(3H，s，16 － H) ，1． 09(3H，d，J = 6． 9Hz，17 － H) ，
0. 98(3H，d，J = 4． 6Hz，18 － H) ，0． 89(3H，d，J =
6. 8Hz，19 － H) ;13C － NMＲ(MeOD)δ:159． 0(C － 1) ，
136． 3(C － 2) ，210． 0(C － 3) ，75． 0(C － 4) ，38． 17
(C －5) ，142． 3(C －6) ，128． 6(C －7) ，45． 8(C －8) ，
77． 4(C － 9) ，58． 9(C － 10) ，38． 1(C － 11) ，48． 1
(C －12) ，217． 0(C － 13) ，56． 8(C － 14) ，30． 0(C －
15) ，17． 9(C － 16) ，22． 1(C － 17) ，18． 5(C － 18) ，
10． 3(C － 19) ，68． 3(C － 20)。以上数据与文献报道
的 Langduin A［9］进行对照，两者基本一致。综上，鉴定
化合物 2 为 Langduin A。1 H － NMＲ 和13 C － NMＲ 数据
归属见表 1 和表 2。
表 1 化合物 1、2、3 的1H － NMＲ数据归属
δH(J /Hz)
1 2 3
1 7． 58(1H，s) 7． 56(1H，s) 7． 56(1H，dd，J = 1． 4，2． 0Hz)
2
3
4
5
2． 53(1H，d，J = 19． 0Hz)
2． 50(1H，d，J = 19． 0Hz)
2． 55(1H，m) ，
2． 47(1H，m)
2． 52(1H，d，J = 19． 0Hz) ，
2． 44(1H，d，J = 18． 9Hz)
6
7 5． 66(1H，d，J = 4． 8Hz) 5． 46(1H，d，J = 4． 6Hz) 5． 58(1H，d，J = 4． 4Hz)
8 3． 00(1H，t，J = 5． 4Hz) 3． 73(1H，m) 3． 24(1H，t，J = 5． 4Hz)
9
10 3． 26(1H，s) 3． 04(1H，t，J = 2． 4Hz) 3． 1(1H，t，J = 2． 6Hz)
11 1． 96(1H，m) 2． 71(1H，dd，J = 7． 1，14． 8Hz) 2． 01(1H，dd，J = 6． 5，9． 8Hz)
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12
2． 08(1H，d，J = 7． 0Hz)
1． 56(1H，，dd，J = 11． 2，14． 5Hz)
2． 43(1H，d，J = 1． 9Hz) ，
2． 07(1H，dd，J = 7． 0，13． 7Hz)
3． 90(1H，s) ，
13
14 0． 84(1H，d，J = 5． 3Hz) 2． 40(1H，s) 1． 05(1H，s)
15 1． 94(1H，m)
16 1． 19(3H，s) 1． 77(3H，s) 1． 22(3H，s)
17 1． 06(3H，s) 1． 09(3H，d，J = 6． 9Hz) 1． 24(3H，s)
18 0． 88(3H，d，J = 6． 4Hz) 0． 98(3H，d，J = 4． 6Hz) 1． 06(3H，s)
19 1． 76(3H，dd，J = 1． 3，2． 8Hz) 0． 89(3H，d，J = 6． 8Hz) 1． 74(3H，dd，J = 1． 3，2． 8Hz)
20
4． 04(d，1H，J = 12． 8Hz)
3． 97(d，1H，J = 12． 7Hz)
3． 94(2H，d，J = 4． 6Hz) 3． 93(2H，s)
21
22 2． 06(3H，s)
表 2 化合物 1、2、3 的13C － NMＲ数据归属
δC
1 2 3
1 161． 2 159． 0 161． 0
2 132． 8 136． 3 134． 4
3 209． 2 210． 0 210． 5
4 73． 8 75． 0 74． 7
5 38． 6 38． 17 38． 6
6 139． 9 142． 3 142． 4
7 130． 2 128． 6 129． 9
8 39． 1 45． 8 40． 0
9 76． 7 77． 4 79． 7
10 55． 8 58． 9 57． 7
11 36． 3 38． 1 46． 1
12 31． 8 48． 1 77． 5
13 63． 6 217． 0 69． 3
14 32． 4 56． 8 36． 6
15 23． 2 30． 0 27． 0
16 22． 6 17． 9 17． 4
17 15． 3 22． 1 24． 1
18 18． 5 18． 5 15． 4
19 10． 1 10． 3 10． 2
20 68． 2 68． 3 68． 1
21 173． 2
22 21． 2
化合物 3 为无色晶体，EI － MS m /z:407(C22 H31
O7)。
1H － NMＲ(MeOD)δ:7． 56(1H，dd，J = 1． 4，
2. 0Hz，1 － H) ，5． 58(1H，d，J = 4． 4Hz，7 － H) ，3． 24
(1H，t，J = 5． 4Hz，8 － H) ，3． 1(1H，t，J = 2． 6Hz，10 －
H) ，3． 90(1H，s，12 － H) ，2． 52(1H，d，J = 19． 0Hz，
5 － Ha) ，2． 44(1H，d，J = 18． 9Hz，5 － Hb) ，2． 01(1H，
dd，J = 6． 5，9． 8Hz，11 － H) ;13C － NMＲ(MeOD)δ:
161. 0(C － 1) ，134． 4(C － 2) ，210． 5(C － 3) ，74． 7
(C －4) ，38． 6(C －5) ，142． 4(C －6) ，129． 9(C －7) ，
40． 0(C －8) ，79． 7(C －9) ，57． 7(C －10) ，46． 1(C －
11) ，77． 5(C －12) ，69． 3(C － 13)。以上数据与文献
报道的 13 － O － Acetylphorbol［10 － 11］进行对照，两者基
本一致，综上，鉴定化合物 3 为 13 － O － Acetylphor-
bol。1H － NMＲ和13C － NMＲ数据归属见表 1 和表 2。
4 抗肿瘤活性研究
各肿瘤细胞均用含有 10%胎牛血清、100U /mL青
霉素和 100μg /mL 链霉素的 ＲPMI － 1640 培养液于
37℃，5%CO2培养箱中培养，每隔 2 天传代 1 次。取对
数生长期的各肿瘤细胞，用胰蛋白酶消化后，细胞计
数。将 100μL(约 10 000 个细胞 /孔)肿瘤细胞接种于
96 孔培养板中，置于含有 5% CO2的 37℃恒温培养箱
中培养 24h，细胞完全贴壁后，每孔分别加入 100μL不
同浓度的待测样品溶液，同时设无药物干预的阴性对
照组、只加完全培养基而不加细胞的空白对照组和阳
性对照组(五氟尿嘧啶，5 － Fu) ，每组平行设 6 个复
孔。培养 48h后，每孔加入 MTT 液 20μL(5 mg /mL) ，
继续培养 4h，弃去培养液，每孔加入 150μL DMSO，待
结晶完全溶解后，用酶标仪于 570nm 处测吸光度，计
算各增殖抑制率和 IC50值。
细胞增殖抑制率 ={［(阴性组 OD 值的平均值 －
空白组 OD值的平均值)－(实验组 OD 值的平均值 －
空白组 OD值的平均值) ］/(阴性组 OD值的平均值 －
空白对照组 OD值的平均值) }× 100%;
IC50值:肿瘤细胞被 50% 抑制所需的药物浓
度［12］。实验结果以(珋x ± s)表示，用 SPSS10． 0 软件包
进行统计分析。
MTT法染色后，采用分光光度法测定各样本的
OD值，计算各单体化合物的肿瘤抑制率及 IC50值。对
HepG － 2，SGC － 7901，MCF － 7 细胞株的抑制率见表
3、表 4、表 5，IC50值见表 6。
表 3 化合物对肝癌 HepG － 2 的抑制率
化合物
抑制率(%)
2． 5μM 5． 0μM 10． 0μM 25． 0μM 40． 0μM 80． 0μM
prostratin 23． 9 39． 18 49． 97 71． 9 91． 01 96． 13
Langduin A 8． 91 13． 01 32． 23 42． 09 63． 30 84． 09
13 － O － Acetylphorbol 8． 43 12． 89 30． 37 41． 67 60． 64 82． 38
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表 4 化合物对胃癌 SGC － 7901 的抑制率
化合物
抑制率(%)
2． 5μM 5． 0μM 10． 0μM 25． 0μM 40． 0μM 80． 0μM
prostratin 8． 23 16． 78 31． 45 49． 96 70． 16 92． 13
Langduin A 7． 51 12． 23 20． 56 48． 12 79． 95 95． 28
13 － O － Acetylphorbol 8． 90 17． 00 33． 24 50． 02 71． 31 93． 52
表 5 化合物对乳腺癌 MCF － 7 的抑制率
化合物
抑制率(%)
2． 5μM 5． 0μM 10． 0μM 25． 0μM 40． 0μM 80． 0μM
prostratin 17． 5 27． 18 45． 79 66． 66 79． 95 95． 28
Langduin A 7． 51 18． 44 47． 37 72． 67 82． 64 92． 38
13 － O － Acetylphorbol 11． 35 23． 74 46． 45 70． 52 83． 41 94． 32
表 6 3 个化合物对三种细胞的 IC50值
化合物
IC50(μM)
HepG － 2 SGC － 7901 MCF － 7
prostratin 11． 77 ± 2． 40 25． 4 ± 5． 92 17． 4 ± 3． 72
Langduin A 35． 0 ± 2． 21 21． 3 ± 5． 43 19． 4 ± 3． 32
13 － O － Acetylphorbol 32． 3 ± 6． 4 24． 91 ± 4． 9 18． 1 ± 2． 15
5 － Fu 8． 3 ± 2． 65 5． 4 ± 2． 32 8． 4 ± 3． 02
在用肝癌 HepG － 2 细胞的筛选实验中，单体化合
物作用 48h 后，发现化合物 prostratin 的 IC50值小于
20μM，有较显著的细胞毒活性。在用胃癌 SGC － 7901
细胞的筛选实验中，单体化合物作用 48h后，发现 3 个
化合物的 IC50值均小于 30μM，表现出一定的抗肿瘤活
性，3 种化合物对胃癌 SGC － 7901 细胞的抗肿瘤活性
按大小顺序依次为:Langduin A ＞ 13 － O － Acetylphor-
bol ＞ prostratin。在用乳腺癌 MCF － 7 细胞的筛选实验
中，发现 3 种化合物的 IC50值均小于 20μM，有较显著
的抗肿瘤活性;此 3 种化合物对 MCF － 7 细胞的细胞
毒活性按大小顺序依次为:prostratin ＞ 13 － O －
Acetylphorbol ＞ Langduin A。
参考文献:
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Antitumor activity of Tigliane Type Diterpene from Euphorbia Fischeriana Steud
WANG Meng，WEI Qing，WANG Qiu － hong，XIA Yong － gang，YANG Bing － you，KUANG Hai － xue
(Key Laboratory of Chinese Materia Medica(Heilongjiang University of
Chinese Medicine) ，Ministry of Education，Heilongjiang Key Laboratory of TCM
Pharmacodynamic Material Bases，Harbin 150040，China)
Abstract:Objective:To study the antitumor activity of Tigliane type diterpenes from Euphorbia fischeriana Steud． Meth-
ods:Separated and repeatedly purified used silica gel，ODS，Sephadex LH －20，HPLC column chromatographic meth-
od． The chemical structures of the isolated components were further elucidated by the physicochemical characters and
spectroscopic methods． Ｒesults:Three compounds were isolated and elucidated as prostratin A，Langduin A as well as
13 － O － Acetylphorbol． Conclusion:In vitro anti － tumor experiments it shows that the prostratin is a certain degree of
anti － tumor activity of HepG －2 and MCF －7，and Langduin A has the antitumor activity to SGC －7901 and MCF －7，
13 － O － Acetylphorbol has the antitumor activity to MCF －7．
Key words:Euphorbia fischeriana Steud．;Tigliane type diterpene;Antitumor activity;MTT
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中 医 药 学 报
Acta Chinese Medicine and Pharmacology
2013 年第 41 卷第 4 期
Vol. 41，No. 4，2013
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