全 文 ：植物研究 2015，35(4):612 ～ 617
Bulletin of Botanical Ｒesearch
基金项目:国家“十二五”支撑项目“水曲柳和白桦种子园 1． 5 代种子园及优良繁殖材料规模化生产技术研究”(2012BAD21B0201-
08);国家基础科学人才培养基金(J1210053)
第一作者简介:任小龙(1992—)，男，本科生，主要从事植物生物学的研究。
* 通信作者:E-mail:qifenghui2001@ 126． com
收稿日期:2014 － 12 － 10
水曲柳花发育过程中 AG、SOC1 基因表达的 qＲT - PCＲ分析
任小龙1 詹亚光1，2 梁 雪1 齐凤慧1，2*
(1．东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040;2．东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)
摘 要 以水曲柳(Fraxinus mandshurica Ｒupr．)不同时期的雌雄花为材料，应用实时荧光定量 PCＲ技术，分析了
18S rＲNA、GAPDH、β-actin和 TU 4 个常用内参基因在水曲柳花中的表达情况。经 NormFinder软件分析选择出 TU
作为内参基因，并对水曲柳中的开花相关基因 AG和 SOC1 在开花不同时期的表达情况进行了分析，结果表明:在
水曲柳花发育期间 AG、SOC1 表达量在雌雄花间存在差异，AG基因在雌花初期表达量最高，之后逐渐降低，到了成
熟胚囊时 AG表达量又有所增加;而在雄花中 AG在减数分裂时最高为 1． 53。SOC1 基因在雌花中的表达量低于雄
花。这一研究结果为深入了解水曲柳花发育过程中相关基因的表达提供理论依据。
关键词 水曲柳;AG基因;SOC1 基因;QＲt-PCＲ
中图分类号:Q949． 776． 2 文献标志码:A doi:10． 7525 / j． issn． 1673 － 5102． 2015． 04． 021
qＲT-PCＲ Analysis of Gene Expression of AG and SOC1 During Flower
Development of Fraxinus mandshurica Ｒupr．
ＲEN Xiao-Long1 ZHAN Ya-Guang1，2 LIANG Xue1 QI Feng-Hui1，2*
(1． Life Science College，Northeast Forestry University，Harbin 150040;2． State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry
University，Harbin 150040)
Abstract We analyzed the temporal expressions of four housekeep genes，18S rＲNA，GAPDH，β-actin and
TU，in ash(Fraxinus mandshurica Ｒupr．)flowers with real-time quantitative PCＲ． With NormFinder software，
TU could be selected as inner reference genes to study the expression of two genes，AG and SOC1，related to the
flowering of ash． The expressions of both AG and SOC1 were different between male and female． The expression
of AG started with a peak in female during the early period of flowering，followed by a decrease till mature
embryo sac stage． In male，the expression of AG reached the peak(1． 53)at meiosis stage． The expression of
SOC1 in female was lower than that in male． Our results would provide evidence to study the expressions of
flowering-related genes during the period of flower development in ash．
Key words Fraxinus mandshurica Ｒupr．;AG gene;SOC1 gene;qＲT-PCＲ
目前，多个物种基因表达的绝对定量和相对
定量的研究主要采用实时荧光定量 PCＲ 技术［1］。
为了获得可靠的基因相对表达量时，通常需要引
入一个表达相对稳定的看家基因作为内参基因［2］
进行数据校正和标准化，以消除不同样品之间的
反转录效率等可能存在的差别。在植物学研究
中，常用的稳定表达的管家基因有肌动蛋白基因
(actin)［3］，甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAPDH)［4］和
18s ＲNA［5］。
花器官的发生是植物营养生长向生殖生长转
变的关键重要阶段。近年来对拟南芥(Arabidopsis
thaliana)、金鱼草(Antirrhinum majus)等模式植物
的花发育机理已有深入的研究，花芽发育包含着
形态生理、细胞水平以及基因表达调控等多个层
次。目前，至少有 80 个以上与拟南芥开花有关的
基因和位点被识别出来［6］。并且在拟南芥、水稻
以及其他高等植物之间的成花发育相关基因具有
极高的保守性［7 ～ 8］。基于此，大量关于模式植物
拟南芥的研究成果为水曲柳成花的分子生物学研
究提供了依据。
水曲柳(Fraxinus mandshurica Ｒupr．)以材质
优良而著称，是珍贵的用材树种。目前水曲柳的
繁殖主要是种子进行有性繁殖，但水曲柳 3 ～ 5 年
才会开花结实 1 ～ 2 次，结实率也较低，而且由于
水曲柳种子种皮坚韧，腊质层厚，种子含油量高，
导致了水曲柳种子休眠期较长，这给育苗生产带
来一定困难。而水曲柳腋芽无性繁殖技术目前还
不成熟，还没有用到生产实践中。已有学者对水
曲柳的大、小孢子的发生及雌、雄配子体发育进行
了研究［9 ～ 10］。但对水曲柳开花调控相关基因的研
究目前还没有报导。SOC1 (SUPPＲESSOＲ OF
OVEＲEXPＲES-SION OF CONSTANS 1)基因是植
物开花途径中的整合子基因之一，和成花诱导关
系密切，而且植物成花途径中的光周期途径、春化
途径、自主途径、赤霉素途径四种途径均能激活
SOC1 基因，最终导致花原基的形成［11］。AG(AG-
AMOUS)是最早克隆的花发育调控基因，与植物花
器官(心皮、胚珠、果实等)的发育有密切关系。
因此，本研究以水曲柳雌雄花为研究对象，分
析 18S rＲNA、GAPDH、β-actin 和 TU 4 个常用内参
基因在水曲柳花中的表达情况，并对 SOC1 和 AG
基因在水曲柳雌雄花不同开花时期的表达情况进
行分析，为深入了解水曲柳花发育过程及成花机
理提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
材料来自黑龙江省苇河青山种子园 20 多年
生的嫁接水曲柳，于 2012 年 4 月下旬到 5 月中旬，
每日采集水曲柳主花序上不同发育时期的花蕾，
在雌雄花中各挑选出 5 个时期花蕾(表 1) ，于
－ 80℃冷冻保存。
1． 2 研究方法
1． 2． 1 水曲柳雌雄花总 ＲNA的提取
采用 EASYspin植物 ＲNA 快速提取试剂盒提
取水曲柳雌雄花总 ＲNA。用 1． 0%的琼脂糖凝胶
电泳检测 ＲNA 完整性。用紫外可见分光光度计
测定 260 和 280 nm 的吸光值，估算总 ＲNA 纯度，
其值在 1． 8 ～ 2． 1 表示纯度较高，可用于定量检测
等后续实验。
表 1 水曲柳雌雄花实验材料
Table 1 Sampling date for ash flowers
编号
No．
取材日期
Date
花发育时期
Development stage of flower
1 ♂4． 28 小孢子母细胞 Microspore mother cell
2 ♂4． 30 减数分裂 Meiosis
3 ♂4． 30 单核小孢子 Uninucleate microspore
4 ♂5． 2 单核靠边期小孢子Vacuolate period of uninucleate microspore
5 ♂5． 3 二细胞花粉 2-celled pollen
6 ♀5． 4 孢原细胞—大孢子母细胞Archesporial cell or megasporocyte
7 ♀5． 7 减数分裂 Meiosis
8 ♀5． 8 大孢子四分体—二核胚囊Tetrad，to 2-nucleate embryo sac
9 ♀5． 11 二核胚囊—八核胚囊2-to 8-nucleate ernbryo sac
10 ♀5． 11 成熟胚囊 Mature embryo sac
1． 2． 2 目的片段的普通 PCＲ扩增及纯化测序
1． 2． 2． 1 PCＲ引物设计及基因片段大小
根据定量 PCＲ 要求的引物设计原则，利用
Premier5． 0 软件，分别设计出内参基因 18S rＲNA、
GAPDH、β-actin和 TU 4 对定量 PCＲ引物(表 2)。
在水曲柳转录组测序分析结果中找到 AG、
SOC1 的基因序列，遵从引物设计原则，利用 Prem-
ier5． 0 软件设计特异引物(表 3)。引物序列由上
海生工公司合成。
表 2 内参基因引物
Table 2 Primers for housekeep genes
基因名称
Gens
引物序列
Sequences of primers(5→3)
扩增目的片段长度
Expected length
(bp)
温度
Temperature
(℃)
18S rＲNA F:CGGCTACCACATCCAAGGAAＲ:GCTGGAATTACCGCGGCT 191
59． 8
59． 6
GAPDH F:TTGGCATCGTTGAGGGTCTＲ:CAGTGGGAACACGGAAAGC 206
57． 6
59． 7
β-actin F:GCCATCTTTGATTGGAATGGＲ:GGTGCCACAACCTTGATCTT 175
55． 8
57． 8
TU F:AGGACGCTGCCAACAACTTTＲ:TTGAGGGGAAGGGTAAATAGTG 239
59． 8
58． 0
表 3 水曲柳 AG、SOC1 的基因引物
Table 3 Primers for AG and SOC1
基因名称
Gens
引物序列
Sequences of primers(5→3)
扩增目的片段长度
Expected length
(bp)
温度
Temperature
(℃)
AG F:AGACTGATTGAAGAGGTGGCTＲ:AGCCTGCTCAGATTCCTC 467
56． 1
57． 3
SOC1
F:TCTTTCTCGCCCTTATGC
Ｒ:TTCGGTTCTTTGCGATGC
Ｒ:CCTTCGTGGTTCAATCGT
322
55． 0
52． 7
55． 0
3164 期 任小龙等:水曲柳花发育过程中 AG、SOC1 基因表达的 qＲT-PCＲ分析
1． 2． 2． 2 普通 PCＲ扩增
随机选择水曲柳某一时期花为材料，反转录
得到的 cDNA作为模板，PCＲ 反应体系为 20 μL，
包括 Primer1(10 μmol·L －1)各 1 μL，10 × PCＲ
Buffer(Mg2 + Plus)2 μL，dNTPs Mix(2． 5 mmol·L －1)
1． 5 μL，Template 2 μL，Taq(5 U·μL －1)0． 5 μL，
ddH2O 12 μL。退火温度可设定为比引物对中最
低的 Tm值低 3℃。若扩增效果不好，可以 2℃为
增量设置梯度退火温度进行 PCＲ 扩增，以探索最
佳反应条件。扩增反应程序为 94℃，5 min，94℃，
45 s;X℃，45 s;72℃，1． 75 min;共 35 个循环，
72℃，10 min，4℃，10 min。PCＲ结束后用 1． 0%琼
脂糖凝胶检测。
1． 2． 3 实时荧光定量 PCＲ分析
1． 2． 3． 1 内参基因的筛选
将制备的水曲柳雌雄花各 5 个时期，即十个
cDNA样品稀释 10 倍作为模板，利用合成的 18S
rＲNA、GAPDH、β-actin 和 TU 4 个常用内参基因引
物，进行实时定量 PCＲ 反应。将 QＲt-PCＲ 仪生成
的数据利用 NormFinder 分析内参基因的稳定性。
设置 3 个平行反应，反应体系 25μL 包括 Forward
Primer(10 μmol·L －1)各 0． 5 μL，2 × TransStart 
Top Green qPCＲ SuperMix 12． 5 μL，Passive Ｒefer-
ence Dye(50 ×)0． 5 μL，Template 2 μL，ddH2O。
在 BIO-ＲAD iQ5 多通道实时定量 PCＲ 仪上设置
热循环反应程序为 94℃，30 s，94℃，5 s;59℃，15
s;72℃，10 s;45 个循环，扩增反应后进行55 ～ 94℃
的溶解曲线分析。
1． 2． 3． 2 目的基因的定量检测
将制备的水曲柳雌雄花各 5 个时期，即十个
cDNA样品稀释 10 倍作为模板，利用合成的开花
特异基因 AG、SOC1 引物，进行实时定量 PCＲ 反
应。记录实时荧光定量仪检测到的十个样品的 Ct
值，运用相对定量的 2 －△△Ct法(2 －△△Ct =(CT目的基因 －
CT管家基因)实验组 －(CT目的基因 － CT管家基因)对照，其
中 CT是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的
强度值)计算得到水曲柳雌雄花在不同花期 AG、
SOC1 基因的相对表达量。
2 结果与分析
2． 1 总 ＲNA纯度及浓度检测
水曲柳雌雄花的总 ＲNA 用 1%的琼脂糖凝
胶电泳检测，可见 28S rＲNA，18S rＲNA 和 5S
rＲNA三条带较为清晰无降解现象，28S rＲNA 和
18S rＲNA 两条主带亮度比约为 2 ∶ 1(图 1)，
且 A260 /A280为 2． 0 左右，说明提取的总 ＲNA 完
整性较好，并且无 DNA 残留，可用于后续实验的
研究。
图 1 总 ＲNA电泳图
Fig． 1 Total ＲNA electrophoresis
2． 2 AG、SOC1 目的基因片段的确定
以一个反转录 cDNA 为模板进行 PCＲ 扩增，
以 2℃为增量设置退火温度梯度，结果显示 AG、
SOC1 片段在 49℃时效果相对较好(图 2)，将获得
的片段测序、比对，确定了扩增片段即为 AG、SOC1
的基因片段。
图 2 AG、SOC1 基因片段 PCＲ产物电泳图 A． AG 基因
扩增电泳图;B． SOC1 不同退火温度的电泳图 1 ～ 6． 温度分别
为 45℃，47℃，49℃，51℃，53℃，55℃
Fig． 2 PCＲ product electrophoresis． A． AG gene;B．
SOC1 gene 1 － 6:Tm of 45℃，47℃，49℃，51℃，53℃，55℃，re-
spectively．
2． 3 内参基因的溶解曲线及稳定性分析
以水曲柳不同开花时期的雌雄花为材料来源
的第一链 cDNA 为模板，进行实时荧光定量 PCＲ
分析。结果表明(图 3)，4 个内参基因引物来源的
各材料的熔解曲线都只有明显的单一峰，说明所
用引物都能特异性地扩增各内参基因的相应产
物，不存在引物二聚体，说明实时荧光定量 PCＲ的
结果是准确可信的。
416 植 物 研 究 35 卷
图 3 内参基因的溶解曲线图 A． 18S rＲNA;B． TU;C． β-actin;D． GAPDH
Fig． 3 Melt curve of housekeep genes A． 18S rＲNA;B． TU;C． β-actin;D． GAPDH
图 4 水曲柳花的内参基因稳定性分析
Fig． 4 Expression of housekeep genes in flowers of ash
采用 NormFinder软件分析以水曲柳雌雄花 5
个时期为材料的 4 个常用管家基因，获得 18S
rＲNA、GAPDH、β-actin 和 TU 的表达稳定值 M，TU
＜ 18S rＲNA ＜ GAPDH ＜ β-actin(图 4)。TU 的 M
值为 1． 362 ＜ 1． 5，符合内参基因的标准。
2． 4 AG与 SOC1 基因的表达分析
为分析水曲柳 AG和 SOC1 基因在雌雄花不同
发育时期的表达特性，分别选择 5 个时期花的总
ＲNA为模板，进行实时荧光定量检测。分析结果
显示(图 5) ，AG基因在雌雄花中的各个时期均有
表达，以雌花的孢原细胞—大孢子母细胞时期为
对照，AG基因在雌花中的表达是逐渐降低，到二
核胚囊—八核胚囊时期最低为 0． 106，在成熟胚囊
时期又升高到 0． 323。AG基因在雄花中的表达量
是先升高再降低，其中雄花初期即小孢子母细胞
时期表达量最低为 0． 008 3，到减数分裂期达到第
一个峰值最高为 1． 53，之后逐渐降低，到二细胞花
粉时期又升高到第二个峰值为 0． 98。由 AG 在水
曲柳雌雄花不同发育时期的表达特性比较分析发
现，AG在花的雄蕊和雌蕊发育和花器官形成中起
到一定的调控作用。在水曲柳花发育减数分裂之
前 AG的表达量是雌花高于雄花，在减数分裂期和
减数分裂之后，AG 的表达量是雌花低于雄花。如
图 6，在水曲柳雌雄花不同发育时期 SOC1 基因的
变化趋势有所不同，其中在雌花中，SOC1 基因随
着雌花的发育在减数分裂期之后有小幅的降低，
到成熟胚囊时期又有所回升。而在雄花中，SOC1
5164 期 任小龙等:水曲柳花发育过程中 AG、SOC1 基因表达的 qＲT-PCＲ分析
图 5 水曲柳雌雄花不同发育时期 AG基因表达情况
雌花:1．孢原细胞—大孢子母细胞时期;2． 减数分裂时期;3．
大孢子四分体—二核胚囊时期;4．二核胚囊—八核胚囊时期;
5．成熟胚囊时期 雄花:1．小孢子母细胞时期;2．减数分裂时
期;3．单核小孢子时期;4．单核靠边期小孢子时期;5． 二细胞
花粉时期
Fig． 5 Expression of AG in ash flowers Femala:1． Ar-
chesporial cell or megasporocyte;2． Meiosis;3． Tetrad，to 2-nu-
cleate embryo sac;4． 2-to 8-nucleate ernbryo sac;5． Mature em-
bryo sac Male:1． Microspore mother cell;2． Meiosis;3． Uninu-
cleate microspore;4． Vacuolate period of uninucleate microspore;
5． 2-celled pollen
基因的表达随着雄花的发育逐渐升高，在单核靠
边期小孢子时期最高为 1，发育到二细胞花粉时期
降到 0． 62。雌雄花相比较发现，SOC1 的表达量是
雌花低于雄花。
3 讨论
已有许多研究表明，同一个内参基因在同一
植物不同组织中的表达量是不同的，在不同环境
的影响下基因的表达量也不相同。齐飞艳等［12］从
9 个候选内参基因中筛选出在毛竹的叶、幼嫩
花序、花序轴、枝、竹青等 11 个组织器官中稳定表
达的基因为 PP2A。蒋晓梅等［13］以鸭茅根组织为
材料，在不同非生物胁迫环境下对 6 个候选内
参基因的表达情况进行分析，结果显示在干旱胁
迫、盐胁迫、涝胁迫、热胁迫与 ABA 处理条件下，
表达最稳定的基因是 SAMDC。本研究对水曲柳雌
雄花的 4 个候选内参基因筛选，表达相对稳定的
是 TU。
植物 MADS-box 基因家族编码高度保守的转
录因子，参与了包括花器官发育和开花在内的多
种发育进程。在被子植物中调控花发育的不同阶
段，并调节花发育的整个过程，它们构成复杂的网
图 6 水曲柳雌雄花不同发育时期 SOC1 基因表达情
况 雌花:1．孢原细胞—大孢子母细胞时期;2．减数分裂时
期;3．大孢子四分体—二核胚囊时期;4． 二核胚囊—八核胚
囊时期;5．成熟胚囊时期 雄花:1．小孢子母细胞时期;2．减
数分裂时期;3．单核小孢子时期;4．单核靠边期小孢子时期;
5．二细胞花粉时期
Fig． 6 Expression of SOC1 in ash flowers Femala:
1． Archesporial cell or megasporocyte;2． Meiosis;3． Tetrad，to
2-nucleate embryo sac;4． 2-to 8 － nucleate ernbryo sac;5． Ma-
ture embryo sac Male:1． Microspore mother cell;2． Meiosis;
3． Uninucleate microspore;4． Vacuolate period of uninucleate
microspore;5． 2-celled pollen
络来决定花原基和花器官的特征［19］。AG 和 SOC1
基因均属于 MADS-box转录因子家族，在拟南芥中
AG决定花的雄蕊和雌蕊的发育，并与心皮、胚珠
和果实的发育密切相关。SOC1 基因在植物的茎
顶端分生组织和叶片中都有表达，和成花诱导有
关，在开花过程中起着重要的调控作用［18］，有研究
表明，SOC1 基因在拟南芥的茎尖中表达，在由营
养生长到生殖生长转变过程中大量表达，与下游
花分生组织属性基因共同作用完成成花转变［14］。
SOC1 在双子叶植物的各个组织中广泛表达［15］，
而在单子叶植物中，SOC1 在营养组织中表达并促
进开花时间［16］。AG 的同源基因目前在很多植物
中都已经得到，如铁炮百合、风信子、蝴蝶兰等，这
些植物中都含有 AG家族的 C 类和 D 类两个同源
基因，在惠兰中克隆得到 AG 家族的 C 类基因，在
花芽、子房和蕊柱中表达，在其他组织中不表
达［17］。本研究实时定量分析也证实了 AG 和
SOC1 基因对水曲柳开花具有一定的调控作用，其
中 AG基因在水曲柳雌花初期表达量最高，之后逐
渐降低，到了成熟胚囊时 AG 表达量又有所增加;
而在雄花中 AG在减数分裂时最高为 1． 53。SOC1
基因在雌花中的表达量低于雄花。
616 植 物 研 究 35 卷
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