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研 究 报 告
DOI:10． 3724 /SP． J． 1096． 2011． 00781
采用核磁共振 /液相色谱-质谱异相关谱方法开展
药用植物草棉活性提取物中多组分的
同步结构分析研究
代冬梅1，2 贺玖明2 刘 超3 孙瑞祥3 张瑞萍2
阿吉艾克拜尔·艾萨4 再帕尔·阿不力孜* 2
1(浙江大学宁波理工学院，分子设计和营养工程重点实验室，宁波 315100)
2(中国医学科学院 /北京协和医学院 药物研究所，中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京 100050)
3(中国科学院计算技术研究所，北京 100080) 4(中国科学院新疆理化技术研究所，乌鲁木齐 830011)
摘 要 基于不完全分离分析策略，建立了 NMR/LC-MS 异相关谱(NMR/LC-MS HCS)方法对系列混合物样
品的 LC-MS和 NMR谱数据的整合分析，发掘混合物图谱中来自同一组分的 LC-MS和 NMR谱数据间的内在
相关性。以新疆维吾尔民族药用植物草棉(Gossypium herbaceam L．)花瓣的乙醇提取物(AB-8-2)为研究对象，
以多通道组合闪式色谱技术为分离手段，不完全分离并获取了组分含量呈连续动态变化的系列混合物，运用
NMR/LC-MS HCS方法对提取物中的黄酮苷类成分进行了同步结构分析研究。由于随组分浓度动态变化的多
种谱学信号强度间具有强的正相关性，通过 NMR/LC-MS HCS图可以获得系列提取物中同一组分的互补性的
LC-MS 和 1H NMR 谱数据，包括保留时间(Rt)、质荷比 (m/z)和化学位移值 (δ)等关键数据。以已解析的关
键谱学信号为线索，引入 LC-MS /MS谱和二维 NMR 谱进行综合分析，成功地从 AB-8-2 中鉴定出 12 个黄酮
醇苷类化合物，其中还包括 2 组共流出的同分异构体。结果表明:通过该新型分析方法可以在离线的情况下
通过“数学联用的方式”实现与在线 LC-NMR-MS联用技术相似的分析功能，这种新型谱学分析方法可以简化
复杂混合物的分离分析过程，实现结构复杂成分以及多组分无需完全分离的快速同步结构鉴定;尤其对于常
规分离条件下难以获得单体的微量成分或极性相近组分群显示出独特的解析能力。
关键词 核磁共振 /液相色谱-质谱异相关谱;混合物不完全分离;多组分同步结构鉴定;草棉植物;黄酮苷
类
2010-11-21 收稿;2011-01-05 接受
本文系国家自然科学基金(No． 20775091)资助项目
* E-mail:zeper@ imm． ac． cn
1 引 言
质谱和核磁共振谱是鉴定化合物结构必需的两种谱学方法。随着两者联用技术 LC-NMR-MS［1 ～ 3］
的出现与发展，显著加快了天然产物及药用植物混合物成分的分离与结构鉴定的进程。它具有先分离
后分析的特点。目前，由于 NMR自身检测灵敏度的限制，导致其与 LC 技术联用时还存在一系列的兼
容问题［4 ～ 6］，且该仪器较昂贵，使用成本较高。
除了上述联用技术之外，广义二维相关谱技术［7］的出现为数据的综合分析提供了新思路。利用化
学计量学中相关性的原理对混合物体系的同种或不同种谱学数据进行关联分析，从而获得互补性的谱
学信息用于分析鉴定。Hua等［8］采用二维红外相关谱技术对中药贝母的产地进行区别分析;李钊等［9］
采用基于核磁共振的统计全相关谱(STOCSY)对肾脏中代谢物质系列1H高分辨魔角旋转 NMR 谱数据
进行归属。Corcoran 等［10］采用统计异相关谱 (SHY) ，对复杂生物混合物样品的 MS 谱与1H NMR
谱［10］、CE谱数据［11］进行分析，寻找潜在的生物标志物。广义二维相关谱技术在复杂混合体系的分析
中，运用数学分离代替化学分离，具有不分离分析的特点，这对于混合物体系或色谱共流成分的分析鉴
第 39 卷
2011 年 6 月
分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第 6 期
781 ～ 787
定发挥了重要作用。本研究组曾依据广义二维相关谱技术的原理，提出了基于不完全分离的分析策略，
建立了 LC-MS与1H NMR 的平行动态谱(NMR/LC-MS parallel dynamic spectroscopy，NMR/LC-MS
PDS)［12］。目前，该方法已成功应用于常用中药连翘水提物的分析［13］。
本研究在 NMR/LC-MS PDS 谱的基础上进行了新的研究和探索，使用 MATLAB 软件编写及优化数
据处理程序，获取系列混合物组分的 LC-MS 和 1H NMR 谱信号强度间的相关系数，并设定合适的相关
系数截取值来产生 NMR/LC-MS 异相关谱(NMR/LC-MS hetero-correlation spectroscopy，NMR/LC-MS
HCS)。混合物中同一组分两种信号间的相关称为自相关，两个不同组分信号间的相关称为伪相关。由
于同一组分的两种信号随组分的浓度变化而具有相似的强度变化趋势，因此自相关系数要高于伪相关
系数，通过设定相关系数截取值可将两者加以区分。通过 NMR/LC-MS HCS谱的可视化结果，可以更直
观地获得混合物中属于同一组分的质荷比(m/z)和化学位移值(δ)的相关性信息，从而进一步获得有关
分子离子、碎片离子、化学位移值和偶合裂分等结构信息。NMR/LC-MS HCS 方法的原理及实验流程见
图解 1。
图解 1 基于不完全分离策略建立 NMR/LC-MS异相关谱的原理及实验流程示意图
Scheme 1 Schematic diagram of theory and experimental processes of the NMR/LC-MS hetero-correlation
spectroscopy (NMR/LC-MS HCS)established based on an incompleted separation strategy
287 分 析 化 学 第 39 卷
新疆维吾尔民族药用植物草棉(Gossypium herbaceam L．)为棉属锦葵科 (Oleaceae)植物。本研究
以其花瓣的乙醇提取物(AB-8-2)为研究对象。药理学研究表明，AB-8-2 组分具有明显的抗老年痴呆活
性和一定的抗血栓活性［14，15］。采用多通道组合闪式色谱技术为分离手段，制备组分浓度呈动态变化的
系列混合物流分，运用 NMR/LC-MS HCS 谱方法，并结合 LC-MS /MS 和二维 NMR 谱分析，开展了系列
混合物中黄酮苷类化合物的无需完全分离的高效、快速的同步结构分析研究。
2 实验部分
2． 1 仪器与试剂
1100 系列高效液相色谱仪(美国 Agilent公司) ;QTRAPTM型四极杆-线性离子阱串联质谱仪(美国 AB公
司)，配有电喷雾离子源(ESI)及Analyst 1．4．2数据处理系统;INOVA-600型核磁共振仪(美国Varian公司)。
甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，德国 Merk公司) ;甲醇(色谱纯，天津永大化学试剂开发中心) ;氘代二
甲基亚砜(含 0． 03% (V /V)四甲基硅烷，Cambridge Isotope Laboratories 公司)。实验用水为饮用纯净
水，所有液相分析用溶剂均经抽滤、超声脱气处理(津腾公司滤膜:水相，0． 22 μm;有机相，0． 22 μm)。
2． 2 样品及组分浓度呈连续动态变化系列混合物的制备
草棉活性提取物(编号 AB-8-2)由中国科学院新疆理化技术研究所阿吉艾克拜尔研究员提供。其
分离提取的步骤概略如下:将原药材花瓣粉碎，用 70%乙醇提取、浓缩后混悬于适量水中，用大孔树脂
柱富集分离，收集 50% ～70%乙醇洗脱液，减压回收溶剂获得 AB-8-2。
称取 0． 6 g草棉活性提取物 AB-8-2，加适量甲醇溶解，用 2． 3 g 反相硅胶拌样且干燥后，采用多通
道组合闪式色谱分离系统:sq 16 ×(Isco)Combi Flash，RP C18(40 ～ 60 μm，Isco 公司) ，23 g C18反相闪
式色谱柱 (Isco patent pending，RediSepTM) ，梯度分离。流动相为甲醇(A)和水(B) ，梯度洗脱:0 ～ 180
min，5% ～30% A，180 ～ 240 min，30% ～ 35% A，240 ～ 340 min，35% ～ 50% A，340 ～ 560 min，50% ～
80% A。流速为 5 mL /min;检测波长为 370 nm。以每 10 mL为一管自动收集流分并编号，备用。
2． 3 测试条件
色谱条件:YMC-Pack Pro C18色谱柱 (150 mm ×3． 0 mm i． d．，5 μm，美国 Agilent 公司) ;以乙腈和
0. 1%甲酸为流动相进行梯度洗脱:0 ～ 40 min，15% ～55% 乙腈;流速为 0. 3 mL /min;紫外吸收检测波
长为 370 nm。
质谱条件:负离子检测方式。喷雾电压:－ 4． 5 kV;DP电压:－ 80 V / － 130 V;EP电压:－ 9 V / － 10
V;源温度:350 ℃;GS1(雾化气) :4 MPa;GS2 (干燥气) :5 MPa。碰撞能量(CE) :－ 10 eV / － 35 eV。
均选用线性离子阱模式扫描，扫描速度为 1000 Da /s;使用的各种气路均为氮气;数据采集及处理软件采
用 Analyst software 1． 4． 2。
1H NMR谱测定条件:操作温度 298 K;采用 z 梯度三共振探头;操作软件为 Varian Vnmr 6． 0 C;
1H NMR谱测定的谱宽:－ 1 × 10 －6 ～ 14 × 10 －6;弛豫延迟:20 s;采样时间:3． 533 min;采样次数:32;采样
数据点:64 K。1D TOCSY谱混合时间为 120 ms;NOESY实验的预饱和时间为 1． 6 s，混合时间为 800 ms。
2． 4 LC-MSn 及1H NMR谱测定
LC-UV-MS及 LC-MSn谱测定:根据多通道组合闪式色谱分离的结果及溶液颜色的深浅变化，从获
得的所有流分中选出 42 个系列提取物(间隔 3 ～ 6 个样品) ，每份提取物取出 0． 5 mL溶液，经微孔滤膜
过滤，进行 LC-MSn 谱分析，进样量 10 μL。
1H NMR谱测定:根据上述 LC-UV-MS谱的测定结果，提取物 AB-8-2 中的组分主要分布在中间一段
流分中。从上述 42 个样品中挑选出 25 个样品，经旋转蒸发后，用适量甲醇溶解转移到 5 mm NMR谱用
测试管中，用氮气吹干，然后加入 0． 5 mL氘代二甲基亚砜溶解，进行1H NMR谱测定。
2． 5 原始数据处理及相关计算
LC-MS谱数据处理:采用 Markerview1． 1 软件对原始 LC-MS谱数据(ms． wiff)进行峰对齐、去噪音处
理后，转换成文本文件(ms． txt) ，其中包括质荷比-保留时间(m/z-R t)和峰强度的信息。将这些文本文
件导入 MATLAB软件，通过编写的程序处理，保存为质谱数据矩阵( ［MS］)。
387第 6 期
代冬梅等:采用核磁共振 /液相色谱-质谱异相关谱方法开展
药用植物草棉活性提取物中多组分的同步结构分析研究
1H NMR谱数据处理:将原始的1H NMR谱数据在MestReC 4． 9． 9． 6软件中依次进行傅立叶变换、相较
正、基线校正处理，并输出为文本文件(ASCII 格式的文件) ，其中包括化学位移值和峰强度的信息。然后
将这些文本文件导入 MATLAB软件，经简化处理后得到的数据保存为1H NMR 谱数据矩阵( ［NMR］)。
相关系数计算:采用 MATLAB 软件中的 Corrcoef 函数计算相关系数矩阵(C:correlation coefficient
matrix)。计算公式为:C = corrcoef［MS］［NMR］。通过设定合理的相关系数截取值(Cutoff) ，并用“十”
字型标志将 MS与1H NMR 谱信号强度间的相关系数矩阵可视化，构成 NMR/LC-MS HCS图。
3 结果与讨论
3． 1 提取物 AB-8-2 的不完全分离结果分析
图 1 为提取物 AB-8-2 的 HPLC-UV谱，这 12 个成分依次被洗脱到不同的流分中，且每个成分的含
量在系列流分中呈动态变化。此外，通过比较峰面积可以看出成分之间的含量差异较大。
图 1 提取物 AB-8-2 系列流分的 HPLC-UV谱(λ = 370 nm)
Fig． 1 HPLC-UV chromatogram of series of fractions of gossypium herbocean eoctract，AB-8-2，at
λ 370 nm
图 2 组分 7 的1H NMR /LC-MS 异相关图(相关系数
截取值为 0． 6)。其中 δ 6． 19 的1H NMR谱信号因与其
它组分的信号相重叠，而没有出现在相关图中
Fig． 2 1H NMR /LC-MS hetero-correlation spectroscopy
(HCS)spectrum of constituent 7 with a cutoff of 0． 6． The
signal at δ 6． 19 was overlapped by other signals and was
not showed in NMR/LC-MS HCS map
3． 2 组分 7 的结构解析
以组分 7 为例，阐述 NMR/LC-MS HCS 方法在
混合物结构鉴定中的作用及分析流程。图 2 为组分
7 的1H NMR /LC-MS HCS图。横坐标为1H NMR 谱
的化学位移值(δ) ，纵坐标为某一保留时间(R t)处
的质荷比(m/z) ，“十”字型标识代表了系列混合物
样品中 m/z 与 δ 值信号间的相关关系。其中，不同
类型的重叠“十”字型标识代表了不同峰型的1H
NMR 信号，如单峰、双峰、多重峰等。在保留时间
18． 8 min 处的离子与一组1H NMR谱信号之间的相
关标识，包括［M － H］－(m/z 463) ，同位素离子(m/
z 464 和m/z 465)与 δ 7． 96 单峰，δ 7． 85，6． 97，6． 49
和 4． 77 的双峰之间存在相关性，这组相关标识表明
这一组 MS与1H NMR 谱信号是来自混合物中组分
7 的谱学信号。同时，将这些识别出来的氢谱信号
与混合物的1H NMR谱(图 3)进行比对，可进一步确定δ 7． 96 处的1H NMR谱信号为双峰(J = 1． 8 Hz) ，
487 分 析 化 学 第 39 卷
δ 7． 85 为双二重峰(J = 8． 4 Hz，1． 8 Hz)。此外，根据现有1H NMR 谱信号间的积分比例及偶合裂分关
系，将出现在同一样品范围内(119 ～ 163 号流分)的 δ 6． 19 的双峰(分布在 82 ～ 169 号流分，是一个多
组分信号的重叠峰)也归属为组分 7 的1H NMR信号。
由图 2 可知，芳香区域的1H NMR谱信号构成了黄酮化合物 B 环典型的 ABX 偶合系统和 A 环的
AB偶合系统，一个糖的端基质子信号出现在 δ 4． 77 处。因此，可以推断组分 7 为具有槲皮素母核的单
糖苷类化合物。由［M － H］－(m/z 463)的 LC-MS /MS 谱(图 4)可知，组分 7 的［M － H］－(m/z 463)裂
解丢失 162 Da 基团产生 m/z 301 的子离子，表明结构中存在一个六碳糖基和槲皮素母核结构。同时，
根据前期研究结果［16，17］，在碰撞能量(CE)35 eV下，组分 7 产生了强度很高的 Y0 (m/z 301)和强度非
常弱的［Y0H］
·(m/z 300) ，可以判断组分 7 为槲皮素-3＇-O-糖苷类化合物。照射已经归属的糖端基质
子信号(δ 4． 77)获得糖基部分的 1D TOCSY 谱(图 5) ，从而确定糖基为葡萄糖。通过上述综合分析，组
图 4 组分 7 的［M － H］－离子 (m/z 463)的 LC-MS /
MS谱。其中苷元离子 (Y0 ，m/z 301)的相对强度远
远大于自由基苷元离子( ［Y0H］
·，m/z 300)的相对
强度，因此确定组分 7 为 3位糖苷化
Fig． 4 LC-MS /MS spectrum of［M － H］－ ion at m/z 463
of constituent 7． The glycosylation position was determined
by comparing the relative abundances of aglycone ion
(Y0 ，m/z 301)and radical aglycone ion( ［Y0 H］
·，
m/z 300)
分 7 被鉴定为 Quercetin-3＇-O-glucoside。
图 3 AB-8-2 的 131 号流分的混合1H NMR 谱。根据
NMR/LC-MS 异相关图的相关性信息从中挖掘出属于
组分 7 的信号，并进行了归属
Fig． 3 Downfield regions of the 1H NMR spectrum of No．
131 fraction from crude extract AB-8-2． The 1H NMR sig-
nals were correlated and assigned to constituent 7 by using
NMR/LC-MS HCS method
3． 3 其它成分的结构解析
利用 NMR/LC-MS HCS 谱进行结构鉴定时，可
以遵循从易到难的顺序，解析时先从色谱分离度较
好的组分入手(如组分 7 ～ 12) ，通过 NMR/LC-MS
图 5 组分 7 的 1D TOCSY 谱(a)和提取物 AB-8-2 的
151 号流分的混合1H NMR谱(糖残基部分)
Fig． 5 1D total correlation spectroscopy (TOCSY)spec-
trum (a)of constituent 7 and 1H NMR spectrum of sugar
moiety of No． 151 fraction from crude extract AB-8-2 (b)
HCS图依次将每个组分1H NMR 谱信号在混合物
的1H NMR谱中归属。对相邻较复杂的1H NMR 谱
信号进行解析。解析时可以剔除那些已归属明确
的1H NMR 谱信号，降低混合物1H NMR 谱的复杂
性。具体的结构解析思路总结如下:首先根据
NMR/LC-MS HCS谱提供的相关信息，初步确定化
合物的母核结构(如 m/z 301 提示有槲皮素母核，
m/z 285 提示有山奈酚母核) ，糖的数目(端基质子
的数目) ，特征取代基(如甲氧基) ;再根据 LC-MS /
MS 谱提供的裂解信息，推测糖的种类(如丢失
162Da提示有六碳糖) ，取代基种类(丢失 15Da 提
示有甲氧基) ，糖基的取代位置(黄酮母核的 3 位取
代(如组分 2，4，5，10) ，7 位取代(如组分 1，6，9) ，3＇
位取代(组分 7) ) ;通过照射糖基的端基质子信号获得糖基的 1D TOCSY 谱，确定糖的种类，如葡萄糖
(组分 1，3，5，6，7，8，10) ，半乳糖(组分 2，4)和鼠李糖(组分 9) ;照射已确定归属的质子信号，获得
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代冬梅等:采用核磁共振 /液相色谱-质谱异相关谱方法开展
药用植物草棉活性提取物中多组分的同步结构分析研究
NOESY谱来确定取代基的连接位置(如组分 8 和 9 中的甲氧基) ;对于重叠的1H NMR 谱信号，可以利
用 NMR/LC-MS PDS谱进行解析，同时结合黄酮类化合物的结构特点和信号耦合裂分规律，进行拆分归
属。本研究利用 NMR/LC-MS HCS谱，从 AB-8-2 中鉴定了 12 个黄酮醇苷类化合物，其中还包括 2 组共
流出的同分异构体(组分 1，2，3 和组分 4，5，6) ，这些组分的化学结构见表 1。
表 1 AB-8-2 中 12 个组分的结构
Table 1 Structures of 12 constituents in A-8-2
结构
Structure
组分序号
Constituent
number
支链
Partial chain
组分序号
Constituent
number
支链
帨
師
師
Partial chain

OH
R2
R

3
帪

O
O
R
帨
師
師
1
R

4 R5
1 R1 = R4 = R5 = OH，R2 = OGlc，R3 = H 7 R1 = R2 = R5 = OH，R3 = OGlc
2 R1 = OGal，R2 = R4 = R5 = OH，R3 = H 8
R1 = R2 = OH，R3 = H，R4 = OGlc，R5 =
OCH3
3 R1 = OGlc，R2 = R4 = R5 = OH，R3 = H 9
R1 = R5 = OH，R2 = ORha，R3 = OCH3，R4 =
H
4 R1 = OGal，R2 = R5 = OH，R3 = R4 = H 10
R1 =(6″-p-coumaroyl)-Glc，R2 = R5 = OH，
R3 = R4 = H
5 R1 = OGlc，R2 = R5 = OH，R3 = R4 = H 11 R1 = R2 = R4 = R5 = OH，R3 = H
6 R1 = R5 = OH，R2 = OGlc，R3 = R4 = H 12 R1 = R2 = R5 = OH，R3 = R4 = H
4 结 论
本研究利用 NMR/LC-MS 异相关谱技术，开展了新疆维吾尔民族药用植物草棉活性提取物 AB-8-2
中黄酮醇类成分的同步结构鉴定研究。通过对 NMR/LC-MS HCS 谱中的相关性谱学信息进行综合分
析，基于组分浓度动态变化的多个谱学信号间强度协同变化的规律，将系列组分群中属于同一组分的
LC-MS和1H NMR 谱数据(通过独立测定得到)通过 NMR/LC-MS HCS 的相关计算和可视化处理关联
上，进而获得包括保留时间、质荷比和化学位移值的相关性谱学信息，实现了在不完全分离情况下对活
性提取物中多组分的同时结构鉴定。
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Simultaneous Structural Identification of Constituents in Active
Herbal Extract of Gossypium Herbaceam Using Nuclear
Magnetic Resonance /Liquid Chromatography-Mass
Spectrometry Hetero-Correlation Spectroscopy
DAI Dong-Mei1，2，HE Jiu-Ming2，LIU Chao3，SUN Rui-Xiang3，ZHANG Rui-Ping2，
Haji Akber AISA4，Zeper ABLIZ* 2
1(Key Laboratory for Molecular Design and Nutrition Engineering，
Ningbo Institute of Technology，Zhejiang University，Ningbo 315104)
2(Key Laboratory of Bioactive Substances and Resource Utilization of Chinese Herbal Medicine，
Ministry of Education，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking
Union Medical College，Beijing 100050)
3(Institute of Computing Technology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100080)
4(Xinjiang Technological Institute of Physics and Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Urumqi 830011)
Abstract To simplify and accelerate the analytical routes for structure identification of constituents in com-
plex mixture，based on an incomplete separation strategy，MS /NMR hetero-correlation spectroscopy (MS /
NMR-HCS)was developed as a new analytical method to discover the intrinsic correlation between LC-MS and
NMR data of the same constituent from mixture spectra． The ethanol crude extract of the petals of Gossypium
herbaceam was separated into a series of fractions with the concentration of constituent dynamic variation by
flash column chromatography． NMR /LC-MS HCS method was applied to identify the flavonol glycosides in
these fractions． The complementary spectral information of the same individual constituent in the crude extract
was simultaneously obtained from the spectra of mixtures，including retention time (R t) ，mass /charge (m/z)
and chemical shift (δ)． And combined the LC-MS /MS and 2D NMR analysis，twelve constituents including
two groups of co-eluted isomers were identified successfully． The results demonstrated that NMR /LC-MS HCS
combined with the incompleted separation strategy could achieve the similar function of on-line LC-MS-NMR in
an off-line mode by such a“mathematics hyphenated approach”． The new analytical strategy has the potential
advantages for simplifying and accelerating the analytical routes for structure identification of constituents in
complex mixture． Especially，this method is suitable for analysis and identification of minimum-quantity con-
stituents and constituents with similar polarity which are hardly obtained in routine experimental conditions．
Keywords Nuclear magnetic resonance / liquid chromatography-mass spectrometry hetero-correlation spectros-
copy;Incomplete separation strategy;Simultaneous structural identification in mixture;Gossypium herbaceam;
Flavonol glycosides
(Received 21 November 2010;accepted 5 January 2011)
787第 6 期
代冬梅等:采用核磁共振 /液相色谱-质谱异相关谱方法开展
药用植物草棉活性提取物中多组分的同步结构分析研究