全 文 ：收稿日期:2013-11-12
作者简介:耿果霞(1961 －)，女，高级实验师，硕士，gengguoxia
2785@ aliyun． com．
通信作者:李青旺(1956 －)，男，教授，博士，博士生导师，liqing-
wangysu@ aliyun． com．
地锦草水提物对小鼠子宫颈癌的抑制
作用研究
耿果霞1，玮 罕2，陈华丽2，石美虹2，李青旺2
(1．西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨陵 712100;2．西北农林科技大学 动物科技学院，
陕西 杨陵 712100)
中图分类号:S853． 75 文献标识码:B 文章编号:1004-7034(2013)12 － 0152 － 03
宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，占女性生殖系统
恶性肿瘤的 50%以上，病死率居妇女恶性肿瘤的首
位，对女性造成很大危害。中草药对于癌症方面的治
疗因其不良反应较小而越来越受到关注，在肿瘤治疗
方面，中药单方和复方都取得了很好疗效［1］。地锦
草和其他中草药的复方清肠解毒汤对结肠直肠癌治
愈率很高［2］。
地锦草是一年生匍匐植物，属于大戟科，也称地
锦、血见愁、铺地红、奶浆草等。该草药常生长在田
野、路边等处，我国大部分地区都有，资源较丰富。地
锦草单方可用于急慢性肝炎治疗，并且效果显著，而
其在临床应用方面主要表现为防治传染病，如菌痢腹
泻等，另外其针剂也用于急慢性支气管炎的治疗［3］。
高迎春等［4］研究发现，地锦草颗粒对人工感染鸡大
肠杆菌病的治疗效果显著;安惠霞等［5］研究发现，地
锦草提取物可降低红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶和
β －(1，3)－ D －葡聚糖合成酶的活性等。在兽医临
床上，赵宗孝等［6］研究地锦草、芯芭、蓝盆花、多叶棘
豆和广枣 5 种蒙药清除自由基作用，结果发现，地锦
草清除自由基能力最强。清除自由基有助于癌症预
防［7］，因此这也暗示地锦草具有抗癌活性，然而目前
国内外关于地锦草抗宫颈癌活性的相关报道研究
很少。
本研究拟通过建立宫颈癌 U14 小鼠实体瘤模
型，用不同浓度地锦草灌胃，通过检测小鼠肿瘤生长
情况，初步测定地锦草对 HeLa 细胞的抑制作用，以
及对小鼠血清的抗氧化能力，并用免疫组织化学法对
小鼠肿瘤组织进行相关蛋白 p19AＲF表达量分析，探索
地锦草水提物对宫颈癌的生长是否具有抑制作用，为
其在临床中的应用提供理论依据。
1 材料
1． 1 试验动物
6 ～ 8 周龄、清洁级雌性昆明小鼠，购自军事医学
科学院，饲养环境的温度保持在 20 ～ 25 ℃，相对湿度
维持在 40% ～60%。
1． 2 细胞株
小鼠宫颈癌细胞(U14)，购自中国医学科学院药
物研究所，将其注入小鼠腹腔内进行传代;HeLa 细
胞，由西北农林科技大学动物繁殖与细胞工程实验室
提供。
1． 3 主要试剂及药物
Hoechst 33324、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝
(MTT)，均购自美国 Sigma 公司;环磷酰胺(CTX)粉
剂，中美合资山西泰盛制药有限公司生产，使用前用
生理盐水配制成注射液(25 mg /kg);ＲPMI － 1640 培
养基和胎牛血清，购自新西兰 GIBCO公司。
1． 4 试剂盒和抗体
总抗氧化能力(T － AOC)测定试剂盒、过氧化氢
酶(CAT)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试
剂盒，购自南京建成生物工程研究所;免疫组织化学
染色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司;
p19AＲF抗体，购自美国 Sigma 公司;其他试验用品，均
购自北京科昊泽生物技术有限公司。
2 方法
2． 1 地锦草水提物的制备
称取地锦草 300 g，先在粉碎机上粉碎，然后加入
8 倍体积的无离子水，热回流 2 h;收集提取液于另一
容器中，同样方法重复 3 次;将提取液于旋转蒸发仪
上除去水分至黏稠状，然后置于冷冻干燥机中冻干为
粉末状，保存，备用。
2． 2 小鼠宫颈癌模型的建立
于无菌条件下将在小鼠腹腔内传代的 U14 宫颈
癌细胞取出，并调整其浓度为 2 × 106 /mL，然后每只
小鼠于右前肢腋下注射含有肿瘤细胞的溶液
0． 2 mL，从而建立实体瘤小鼠模型。
251
Heilongjiang Animal Science
and Veterinary Medicine № 12 2013
DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2013.23.056
2013 年 12 月(上)
2． 3 分组和治疗
在接种肿瘤细胞 1 d 后，将部分接种小鼠随机分
为 4组，每组为 8 只，用于测定抑瘤率;另外一部分小
鼠随机分为 3组，每组 8只，用于检测抗氧化能力及免
疫组织化学反应。根据预试验结果，试验采用高、低
2种地锦草给药剂量，分别为 100 mg /kg 和 50 mg /kg。
通过灌饲法给药，每只 0． 2 mL，阳性对照组每只小鼠
腹腔内注射 CTX 0． 1 mL，阴性对照组灌饲相应体积
的纯化水。所有试验小鼠每日早晨灌药 1 次，连续给
药 13 d，观察小鼠状态，记录体重和肿瘤体积。
2． 4 抑瘤率的测定
待试验结束后，采用脱颈法处死小鼠，取瘤块并
称取重量，计算药物的抑瘤率。计算公式:抑瘤率
(%)=(阴性对照组瘤重量 －试验组瘤重量)/阴性
对照组瘤重量。
2． 5 对 HeLa细胞的抑制作用
于 96 孔板中培养细胞，用相应浓度地锦草提取
液处理细胞一定时间后，加入 MTT，于培养箱中孵育
1 h;酶标仪测定 OD值，经计算可得抑制率，再用 Ho-
echst染色观察其诱导凋亡情况。计算公式:抑制
率 = 1 － (加药组 OD 值 /阴性对照组 OD 值)×
100%。
2． 6 总抗氧化能力的检测
取试验小鼠血样，室温静置以析出血清，根据相
应试剂盒说明书检测小鼠血清中 SOD、CAT 活力和
T － AOC，计算公式:SOD(U /mL)=［(阴性对照组 －
测定组)/阴性对照组］/50% ×反应液的总量 /所取
样品的量;CAT(U /mL)=(阴性对照组 －测定组)×
271 × 1 /60 × 取样本量;T － AOC = ［(ODu － ODc)/
0． 01］/30 × N × n 。式中:ODu 是测定孔的吸光度
值，ODc是对照孔的吸光度值，N 是反应体系的稀释
倍数(反应液的总体积 /取样本量)，n 是样本测试前
的稀释倍数。
2． 7 免疫组织化学法检测 p19AＲF的表达
取部分肿瘤组织样品，用中性甲醛溶液固定。用
固定好的样品制作组织切片，进行脱蜡和水化处理，
根据免疫组化染色试剂盒说明书进行抗体孵育和
DAB显示反应;然后经过苏木精染色、乙醇脱水和二
甲苯透明;最终进行封片，在光学显微镜下观察染色
结果并拍照。
2． 8 统计学分析
应用 SPSS Statistics 17． 0 软件对试验数据进行分
析处理，试验数据以平均值 ±标准差表示。组间差异
用 One － way ANOVA法进行方差分析。
3 结果与分析
3． 1 地锦草水提物对肿瘤生长的影响(结果见表 1)
由表 1 可知，地锦草水提物抑制了小鼠肿瘤生
长，其中地锦草水提物高剂量组的抑制效果非常明
显，抑瘤率达到 63． 8%，并且没有影响小鼠的体重状
表 1 地锦草水提物对小鼠肿瘤生长的影响
组别
剂量 /
(mg·mL －1)
瘤重 / g 始体重 / g 终体重 / g
抑瘤
率 /%
阴性对照 2． 43 ± 0． 12 17． 3 ± 0． 3 20． 2 ± 0． 5 0
阳性对照组 25 0． 56 ± 0． 02 18． 0 ± 0． 8 19． 9 ± 0． 8 77． 0
地锦草水提物低剂量组 50 1． 31 ± 0． 11 18． 1 ± 0． 3 20． 2 ± 0． 4 45． 2
地锦草水提物高剂量组 100 0． 84 ± 0． 02 18． 0 ± 0． 5 19． 6 ± 0． 5 63． 8
况，但仍低于阳性对照组。
3． 2 地锦草水提物对 HeLa细胞的抑制作用
3． 2． 1 MTT检测 结果见表 2。
表 2 MTT检测结果
组别 1 2 3 4 抑制率 /%
12． 5 mg·mL －1组 0． 346 0． 418 0． 264 0． 367 73． 05
25 mg·mL －1组 0． 361 0． 334 0． 314 0． 342 74． 06
50 mg·mL －1组 0． 241 0． 251 0． 243 0． 238 82． 73
阴性对照组 1． 027 1． 168 1． 321 1． 081
空白组 0． 051 0． 053 0． 050 0． 061
由表 2 可知，经 12． 5，25，50 mg /mL 地锦草水提
物处理后，HeLa细胞的生长抑制率分别为 73． 05%、
74． 06%、82． 73%。
3． 2． 2 Hoechst染色 细胞经 Hoechst 染料染色后，
正常细胞核显淡蓝色并有均匀荧光;而凋亡细胞的细
胞核染色变深且呈亮蓝色。在显微镜下，凋亡小体会
出现粒状荧光体聚集。细胞经地锦草水提物处理后，
通过 Hoechst 染色，表现出明显的形态变化，可以观
察到细小的不规则颗粒状的凋亡小体出现，结果见
209 页彩图 1。
3． 3 地锦草水提物对抗氧化能力的影响(结果见
表 3)
表 3 地锦草对 T － AOC和 CAT和 SOD
活力影响 U·mL －1
组别 SOD CAT T － AOC
阴性对照组 141． 34 ± 1． 34 100． 18 ± 4． 55 3． 23 ± 0． 19
地锦草水提物低剂量组 170． 21＊＊ ±5． 49 258． 34＊＊ ±10． 86 6． 03＊＊ ±0． 20
地锦草水提物高剂量组 191． 75＊＊ ±5． 38 337． 48＊＊ ±9． 73 8． 06＊＊ ±0． 74
注:与阳性对照组比较，＊＊表示差异极显著(P ＜ 0． 01)。
由表 3 可知:阴性对照组、地锦草水提物低剂量
组和高剂量组 SOD 活力分别为 141． 34，170． 21，
191． 75 U /mL;CAT 活力分别为 100． 18，258． 34，
337． 48 U /mL;T － AOC 分 别 为 3． 23，6． 03，
8． 06 U /mL。通过分析发现，与阴性对照组相比，地锦
草水提物高剂量组、低剂量组极显著提高了抗氧化能
力(P ＜ 0． 01)，揭示地锦草水提物可以明显提高小鼠
血清中 T － AOC和 CAT、SOD 的活力，并且与浓度密
351《黑龙江畜牧兽医》科技版
切相关。
3． 4 地锦草水提物对 p19AＲF蛋白表达的影响
不同浓度地锦草水提物处理的小鼠肿瘤经免疫
组织化学法染色、脱水和封片后照相，褐色为突变型
p19AＲF蛋白表达阳性细胞，结果见 209 页彩图 2。从
彩图 2 中可清楚看到，地锦草水提物高剂量组可使
p19AＲF蛋白表达量增加，明显高于阴性对照组(P ＜
0． 05)。
4 讨论
地锦草可能具有止血、抗菌、保护肾功能损伤和
抗氧化等多种药理功能，并在临床上对一些炎症和出
血等疾病都有一定疗效，但关于地锦草治疗包括宫颈
癌等肿瘤疾病方面的报道几乎没有［8 － 11］。本研究通
过制备地锦草水提物，利用 U14 宫颈癌小鼠模型，探
讨地锦草在癌症治疗方面的作用。结果发现，地锦草
水提物低剂量组(50 mg /kg)抑瘤率为 45． 2%、高剂
量组(100 mg /kg )的抑瘤率为 63． 8%，与阴性对照
组相比差异明显，说明地锦草水提物对小鼠宫颈癌具
有一定的抑制作用。
所有有氧代谢的细胞中都存在超氧化物酶，其作
用主要将超氧离子的自由基转化成为 H2O2，从而避
免氧自由基损伤细胞。过去的研究发现，肿瘤发生发
展与氧自由基的增多有着密切的关系［12］，因此清除
氧自由基有助于抑制癌症生长。CAT、T － AOC 和
SOD一样，也能比较全面地反映机体抗氧化能力，在
本试验通过建立小鼠 U14 实体瘤模型，以地锦草水
提物低剂量、高剂量灌胃治疗，结果发现地锦草水提
物低剂量组、高剂量组与阴性对照组比较都可极显著
提高小鼠血清中 SOD、CAT 活力和 T － AOC(P ＜
0． 01)。由此可以推测，地锦草可能通过增强有机体
的抗氧化能力，减少了细胞的自由基，而发挥了它的
抗肿瘤作用。
p19AＲF为抑癌基因编码的核蛋白，主要通过依赖
或不依赖 p53 蛋白的细胞信号途径产生抗癌作
用［13］。在正常组织中，p19AＲF表达水平很低，几乎检
测不到，但理论上其可在不同组织器官表达，其表达
量可因细胞周期和组织的不同而有所差异。p19AＲF
功能的失活有助于肿瘤产生，在肺癌、白血病、黑色素
瘤、神经胶质瘤和皮肤癌较常多见。基因甲基化、突
变和缺失经常会引起抑癌基因失活，而肿瘤组织中的
p19AＲF基因也经常出现上述现象，从而丧失了抑癌功
能。然而通过上调 p19AＲF基因的表达，可以达到诱导
肿瘤细胞凋亡的发生和周期阻滞的目的。但有关地
锦草在宫颈癌中对 p19AＲF表达的影响还未见报道。
在本试验中，经过地锦草水提物低剂量、高剂量灌胃
治疗，用免疫组织化学方法测定 p19AＲF在肿瘤组织中
的表达，从试验结果看，地锦草水提物高剂量组可以
显著提高 p19AＲF在肿瘤组织中的表达，表明地锦草水
提物可通过提高肿瘤组织 p19AＲF表达，诱导细胞出现
更多的凋亡［13］。
综上所述，地锦草水提物具有较好的抗宫颈癌活
性，进一步研究地锦草抗肿瘤机理对于开发新药具有
重要意义。
参考文献:
［1］ LONG L ，LI Q W． The effect of Alkaloid from oxytropis ochroceph-
ala on inhibition and expression of P53and PCNA in mice bearing
H22 hepatocellular carcinoma［J］． Yakugaku Zasshi，2005，125:
665 － 670．
［2］ TAN K Y，LIU C B，CHEN A H，et al． The role of traditional Chi-
nese medicine in colorectal cancer treatment［J］． Tech Coloproctol，
2008(12):1 － 6．
［3］ 褚小兰，楼兰英，廖万玉，等．地锦类中草药药理作用研究［J］．
时珍国医国药，2001，12(3):193．
［4］ 高迎春，张传津，都邺良． 地锦草颗粒对人工感染鸡大肠杆菌病
临床疗效试验［J］．中兽医医药杂志，2012，3(1):52 － 55．
［5］ 安惠霞，李治建，古力娜·达吾提，等． 地锦草提取物对红色毛
癣菌酶活性的影响［J］．时珍国医国药，2010，21(4):787 － 788．
［6］ 赵宗孝，张昕原，巴根那，等． 蒙药材清除自由基作用比较［J］．
内蒙古民族大学学报，2004，19(1):69 － 71．
［7］ 孙存普，段绍瑾，张建中． 自由基生物学导论［M］． 北京:中国
科学技术大学出版社，1999．
［8］ HALLIWELL B，AＲUMOA O I，GUTTEＲIDE J M C． The deoxyri-
bose method:A simple“Test Tube”assay for determination of rate
constants for reactions of hydroxyl radicals［J］． Anal Biochem，
1987，165:215 － 219．
［9］ 董福轮，陈英群，季蓓． 地锦草、鸟不宿降低血糖临床研究［J］．
四川中医，2002，20(4):24．
［10］ 陈福星，宫新城，陈文英，等．地锦草水煎液对于昆明小鼠非特
异性免疫功能影响［J］．黑龙江畜牧兽医，2008(11):91 － 92．
［11］ 曹瑞珍，张国文，魏永春，等． 地锦草总黄酮对 D －半乳糖小鼠
衰老模型抗氧化作用研究［J］．卫生研究，2007，36(3):387．
［12］ 秦涛余，陈志伟．机体内的活性氧生理功能研究进展［J］． 生命
科学仪器，2008，6(2):12 － 16．
［13］ 杨建民，刘连瑞．细胞凋亡基因调控机制［J］． 细胞生物学动态，
1997(2):41 － 47．
(011)
451
Heilongjiang Animal Science
and Veterinary Medicine № 12 2013
2013 年 12 月(上)
地锦草水提物对小鼠子宫颈癌的抑制作用研究
(作者耿果霞 等，正文见第 152 ～ 154 页)
A．阴性组;B．地锦草组。
图 1 Hoechst 染色结果
A．阴性对照组;B．地锦草水提物低剂量组;C．地锦草水提物高剂量组。
图 2 地锦草水提物对 p19AＲF蛋白表达影响
檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯檯
枕纹锦蛇消化道嗜银细胞的分布及形态学观察
(作者陈 霞 等，正文见第 161 ～ 163 页)
A．食管部嗜银细胞(梭形);B．食管部嗜银细胞(锥体形);C．胃贲
门部嗜银细胞(锥体形);D．胃贲门部嗜银细胞(椭圆形);E．胃体
腺泡之间嗜银细胞(锥体形);F．胃幽门部嗜银细胞(锥体形);G．
胃幽门部腺泡之间嗜银细胞(椭圆形);H．十二指肠嗜银细胞(锥
体形);I．十二指肠嗜银细胞(蝌蚪形);J． 十二指肠嗜银细胞(梭
形) ;K．空肠嗜银细胞(梭形);L． 空肠嗜银细胞(锥体形);M． 空
肠嗜银细胞(蝌蚪形);N．回肠嗜银细胞(梭形);O．回肠嗜银细胞
(锥体形);P．直肠嗜银细胞(椭圆形)。
图 1 枕纹锦蛇消化道嗜银细胞的分布位置及形态
902《黑龙江畜牧兽医》科技版