全 文 ：Chin J Clin Pharmacol 1797
Vol. 32 No. 19 October 2016(Serial No. 225)
小叶黄杨中环维黄杨星 D含量测定的两种
高效液相色谱法评价
Evaluation on the two kinds of HPLC methods for determination of cyclovirobuxium D
in Buxus sinica
收稿日期:2016 － 06 － 15
修回日期:2016 － 07 － 26
基金项目:贵州省科学技术基金资助项目(黔科
合 J字［2013］2032 号)
作者简介:郭婷(1977 － )，女，讲师，主要从事
中药及民族药质量标准与新药研究
通信作者:董莉，副教授
MP:15180859866
E － mail:108405755@ qq. com
guoluo001@ 163. com
郭 婷1，董 莉1，魏秀丽2，
杨娟艳3，何 峰1
(1． 贵州医科大学 药学院，贵阳 550025;2． 国
家知识产权局 专利局 专利审查协作北京中心，
北京 100086;3． 贵阳中医学院，贵阳
550025)
GUO Ting1，DONG Li1，
WEI Xiu － li2，YANG Yan － juan3，
HE Feng1
(1． College of Pharmacy， Guiyzhou
Medical Universty， Guiyang 550025，
China;2． Patent Examination Coopera-
tion Center of the Patent Office，State
Intellectual Property Office of China，
Beijing 100086，China; 3． Guiyang
University of Chinese Traditional
Medicine，Guiyang 550025，China)
摘要:目的 建立高效液相色谱电喷雾检测法(HPLC － CAD)和高效液相色谱紫
外检测法(HPLC － DAD)并用于测定小叶黄杨中环维黄杨星 D 的含量。
方法 色谱柱:Waters Xbridge C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm);流动相
为乙腈和 0. 05%三氟乙酸，梯度洗脱，流速 1 mL·min －1，柱温 35 ℃，DAD检查
波长为 200 nm。用外标一点法测定环维黄杨星 D 的含量。结果 在两种方法
中，环维黄杨星 D 的质量浓度在 5. 1 × 10 －3 ～ 5. 1 × 10 －2 mg·mL －1内线性关系
良好;HPLC － CAD检测限为 0. 02 μg，平均回收率为 99. 7%;HPLC － DAD 检测
限为 0. 16 μg，平均回收率为 97. 7%。两种方法均可准确地测定小叶黄杨中环
维黄杨星 D的含量。结论 HPLC － CAD法色谱峰形好、响应值大、检测限低及
回收率高，更适用于具有末端吸收的环维黄杨星 D的含量测定。
关键词:高效液相色谱电喷雾检测法;高效液相色谱紫外检测法;小叶黄杨;环维
黄杨星 D
DOI:10. 13699 / j. cnki. 1001 － 6821. 2016. 19. 018
中图分类号:Ｒ972 文献标志码:A
文章编号:1001 － 6821(2016)19 － 1797 － 03
Abstract:Objective To establish methods of HPLC － charged aerosol
detector (HPLC － CAD)and HPLC － diode array detector (HPLC －
DAD)for determination the content of cyclovirobuxium D in Buxus sini-
ca. Methods Waters Xbridge  C18 column (4. 6 mm × 250 mm，5
μm)was used. The mobile phase was acetonitrile and 0. 05% trifluo-
roacetic acid，using gradient elution with a flow rate at 1. 0 mL·min －1.
The column temperature was 35 ℃ . CAD nebulization temperature was
30 ℃. The wavelength for DAD was 200 nm. A single － point external
standard method was applied for determination the content of cycloviro-
buxium D. Ｒesults Both HPLC － CAD and HPLC － DAD had good li-
near relationship for cyclovirobuxium D at 5. 1 × 10 －3 ～ 5. 1 × 10 －2
mg·mL －1. The detection limit was 0. 02 μg and the average recovery
rate was 99. 7%(n = 9)for HPLC － CAD. The detection limit was 0. 16
μg and the average recovery rate was 97. 7%(n =9)for HPLC －DAD. Both
of the two methods can be used to determine the assay of cyclovirobuxium D
in Buxus sinica. Conclusion HPLC － CAD had better peak shape，re-
sponse value，low detection limit and high recovery rate than HPLC －DAD，
and can be used for determination of the assay of the cyclovirobuxium D.
Key words:HPLC － charged aerosol detector;HPLC － diode array
detector;Buxus sinica;cyclovirobuxium D
1798 中 国 临 床 药 理 学 杂 志
第 32 卷 第 19 期 2016 年 10 月(总第 225 期)
小叶黄杨为黄杨科植物小叶黄杨 Buxus sinica
(Ｒehd. et Wils)Cheng 及其同属植物的茎枝，现收录
于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003 年版)
中，具有祛风除湿，行气止痛，活血通络的功效。其活
性 成 分 为 甾 体 类 生 物 碱 环 维 黄 杨 星 D
(cyclovirobuxium D)［1］。环维黄杨星 D 对冠心病、心
绞痛等心血管疾病具有很好的疗效［2］。本实验建立
了高效液相色谱电喷雾检测法(HPLC － CAD)和高效
液相色谱紫外检测法(HPLC － DAD)并用于小叶黄杨
中活性成分———环维黄杨星 D的测定，通过比较各自
的优劣，确定环维黄杨星 D检测方法。
材料与方法
1 药品、试剂与仪器
环维黄杨星 D，含量:100%，批号:110888 －
200503，由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色
谱纯，三氯甲烷、三氟乙酸、乙酸乙酯、氨水和醋酸均
为分析纯。
高效液相色谱仪，美国戴安公司产品;XS205 电
子天平，瑞士梅特勒公司产品。
2 实验方法
2. 1 溶液制备
对照品溶液［3］ 精密称定环维黄杨星 D 对照品
12 mg，置 50 mL 量瓶中，加甲醇溶解，用 0. 05%三氟
乙酸稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密量
取对照品储备液 2 mL，置 25 mL量瓶中，用 0. 05%三
氟乙酸稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液［4］ 参照文献方法，取小叶黄杨粗粉
约 2. 0 g，进行供试品溶液的制备。
2. 2 色谱条件［4 －5］
色谱柱:Waters Xbridge  C18色谱柱(4. 6 mm ×
250 mm，5 μm);流速 1 mL·min －1;柱温 35 ℃;进样
量 20 μL。CAD雾化温度 30 ℃，气压 241. 5 kPa;DAD
检测波长为 200 nm。流动相 B 为乙腈，D 为 0. 05%
三氟乙酸，梯度洗脱，见表 1。
2. 3 线性溶液的配制和范围考察
分别精密吸取对照品储备液 0. 5，1. 0，2. 0，3. 0，
4. 0，5. 0 mL，置 25 mL 量瓶中，用 0. 05%三氟乙酸稀
释至刻度，摇匀，进样，记录色谱图。
2. 4 检测限和定量限实验
精密量取对照品储备液适量，做系列稀释后进行
测定，各峰达信噪比 3，10 倍时的量分别为最低检测
限和最低定量限。
表 1 高效液相色谱梯度洗脱条件
Table 1 The gradient program for HPLC
Time(min) Mobile phase B(%) Mobile phase D(%)
0 12 88
3 15 85
8 19 81
12 24 81
15 12 88
20 12 88
B:Acetonitrile;D:0. 05% trifluoroacetic acid
2. 5 精密度实验
取对照品溶液连续进样 6 次，测定环维黄杨星 D
的峰面积，并计算 ＲSD。
2. 6 重复性实验
取同一样品(贵阳六屯)6 份，按文献［4］方法制
备成供试品溶液，于上述色谱条件下测定环维黄杨星
D的含量。
2. 7 稳定性实验
取重复性项下的一份供试品溶液，于上述色谱条
件下，分别于 0，2，4，8，12 和 24 h 进样，记录色谱图，
计算 24 h内含量的 ＲSD。
2. 8 加样回收率实验
精密称定已知含量的小叶黄杨粗粉约 1. 0 g，共 9
份，分别加入 3 个不同百分比(80%，100%，120%)的
环维黄杨星 D对照品溶液，混匀，按文献［4］的方法制
备供试品溶液，分别于上述色谱条件下进样，记录色
谱图，计算回收率及其 ＲSD值。
结 果
1 方法学评价
专属性 分别取对照品溶液、供试品溶液与
0. 05%三氟乙酸，在上述两种色谱条件下分别进样 20
μL，记录色谱图。在本实验条件下，环维黄杨星 D 色
谱峰均能达到基线分离(保留时间 10. 8 min)，理论塔
板数均大于 5000，见图 1。
线性关系和范围 以峰面积为纵坐标(Y)，质量
浓度为横坐标(X)，得线性方程，HPLC － CAD:
Y = 59. 49X + 0. 11 (r = 0. 9996);HPLC － DAD:
Y = 36. 03X － 0. 01(r = 0. 9990) ;结果表明，在两种方
法中，环维黄杨星 D 在 5. 1 × 10 －3 ～ 5. 1 × 10 －2
mg·mL －1内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
检测限和定量限 HPLC － CAD的检测限为 0. 02
μg，定量限为 0. 05 μg;HPLC － DAD 的检测限为 0. 16
μg，定量限为 0. 24 μg。结果表明 HPLC － CAD 的检
测限和定量限比 HPLC － DAD低一个数量级。
Chin J Clin Pharmacol 1799
Vol. 32 No. 19 October 2016(Serial No. 225)
图 1 高效液相色谱电喷雾检测器法(HPLC － CAD)和高效液相色谱紫外检测器法(HPLC － DAD)色谱图
Figure 1 Chromatograms of HPLC － charged aerosol detector (HPLC － CAD)and HPLC － diode array detector (HPLC － DAD)
1:HPLC － CAD;2:HPLC － DAD;A:Standard solutions;B:Sample solutions;C:Blank control
表 2 用 2 种方法测得三批小叶黄杨中环维黄杨星 D的含量
Table 2 The assay results for cyclovirobuxium D in three batches
of Buxus sinica by HPLC-CAD and HPLC-DAD
Collect site
HPLC － CAD
(μg·mL －1)
HPLC － DAD
(mg·mL －1)
ＲSD
(%)
Liutun，Guiyang 71. 3 69. 9 1. 40
Guiding，Guiyang 70. 5 68. 5 2. 04
Xiuwen，Guiyang 77. 8 75. 3 2. 31
精密度 HPLC － CAD 法的 ＲSD 为 0. 87%;
HPLC － DAD法的 ＲSD为 0. 88%。表明精密度良好。
重复性 HPLC － CAD 法中，环维黄杨星 D 平
均含量为 7. 00 × 10 － 2 mg· g － 1，ＲSD 为 0. 99%;
HPLC － DAD 法中，环维黄杨星 D 平均含量为
6. 94 × 10 － 2 mg· g － 1，ＲSD 为 0. 43%。表明两种
方法重复性均良好。
稳定性 HPLC － CAD 的 ＲSD 为 1. 40%;
HPLC － DAD的 ＲSD 为 1. 07%。表明样品在 24 h 内
稳定性良好。
加样回收率 HPLC － CAD 的平均回收率为
99. 7%，ＲSD 为 0. 69%;HPLC － DAD 的平均回收率
为 97. 8%，ＲSD 为 1. 09%。表明两种方法均能准确
测定小叶黄杨中环维黄杨星 D的含量。
2 方法学应用
取 3 种不同产地的小叶黄杨样品，按上述方法制
备供试品溶液，分别于各自色谱条件下进样，记录色
谱图，计算样品含量，见表 2。
表 2 结果表明，两种方法用于小叶黄杨中环维黄
杨星 D的含量测定差异无统计学意义。
讨 论
本实验考察了磷酸、甲酸、乙酸以及二乙胺用于
水相的配制，均未得到理想的效果，且随着加入有机
酸碳链的减少，环维黄杨星 D的保留时间越小。当在
流动相中采用挥发性离子对试剂(三氟乙酸)后，保留
适中，峰形良好。三氟乙酸适用于 CAD 和 DAD 两种
检测器，故选择 0. 05%三氟乙酸作为水相。在紫外条
件下，环维黄杨星 D仅有末端吸收，采用 DAD和 CAD
两种检测器进行测定时，前者响应值小，溶剂峰大，噪
音高，漂移严重;后者响应值大，溶剂峰小，基线噪音
低，且基线不漂移。因此，CAD比 DAD更适合于环维
黄杨星 D 的测定。本实验首次建立了 HPLC － CAD
法测定小叶黄杨中环维黄杨星 D含量的检测方法，与
HPLC － DAD 法比较，该法峰形好、响应值大、检测限
低、回收率高，定量准确，这为小叶黄杨的质量控制提
供了科学、可靠的技术支持。
参考文献:
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(本文编辑 权菊香)