全 文 ：黄 瓜 白 粉 病 是 由 Sphaerothecafuliginea
(Schlecht)Pol.引起的一种潜育期短、流行性强的叶
部病害，一般可使黄瓜减产5%~20%，是黄瓜生产上
最重要的病害之一。随着保护地的栽培面积的逐年
扩大，此病危害越来越严重[1，2]。目前生产上主要采用
化学农药防治此病害，但已发现白粉病菌对7类杀
菌剂（苯丙咪唑类、EBIs、有机磷类、羟基嘧啶类、三
唑类、甲氧基丙稀酸酯类和苯氧基喹啉类）几乎同时
产生了抗药性，且抗性发展速度惊人[3，4]。同时由于长
期大量使用化学农药，使得高残留和污染环境等不
利影响日益突出。植物源农药作为生物农药的一种，
以其自身低残留[5]、低毒或无毒、不易产生抗药性[6，7]
文章编号：1671-9964（2008）03-0200-04
地锦提取液防治黄瓜白粉病
效果及其抑菌物质的初步研究
诸葛媛媛，代光辉，张志远，金素心
（上海交通大学 农业与生物学院，上海200240）
摘 要：测试了地锦提取液对黄瓜白粉病菌的抑制活性，并对地锦抑菌活性物质进行了初步的分离纯化。结果表明：地锦粗提
液对苗期黄瓜白粉病有明显的预防效果，且防效随着粗提液浓度的增大而增加，浓度为30mg·mL-1时，防效达到了67.45%；地
锦中的抑菌生物活性物质为强水溶性，不易溶于石油醚、乙酸乙脂、正丁醇等有机溶剂；通过碱沉淀可以把大部分杂质从水相
萃取物中沉淀下来，得到含有生物活性成分更高的上清溶液；LC-MS分析结果显示上清液中含有3种物质，推测它们的分子量
分别为506、202和275。
关键词：地锦；黄瓜白粉病菌；抑菌活性
中图分类号：S436.421.12 文献标识码：A
ControlEfectonCucumberPowderyMildewand
AntifungalCompoundsofEuphorbiahumifusaWild
ZHUGEYuan-yuan,DAIGuang-hui,ZHANGZhi-yuan,JINSu-xin
(SchoolofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China)
Abstract: ExtractsofEuphorbiahumifusaWildwerebioassayedtodeterminetheirprotectiveefectagainstcucumberpowdery
mildewfungus,Sphaerothecafuligineaintheculturalroomcondition.Theresultsshowedthatthecrudeextracthadaprotectiveefect
of67.45%ataconcentrationof30mg·mL-1.Theisolationoftheactivecompoundsfromthecrudeextractwasconductedbysolvent
partition.Thebioassaysofthesephaseswegotshowedthatthemostactivecompoundswereinthewaterphase,notintheorganic
solventphases.Itwasindicatedthatmostimpuritiescouldbedepositedbyputingalkaliintothewaterphaseandthemorepureand
activecompoundswereinthesupernate.TheresultsofLC-MSdemonstratedthattherewerethreesubstancesinthesupernate,andit
wasinferedthattheirmolecularweightswere506、202and275respectively.
Keywords:EuphorbiahumifusaWild;Sphaerothecafuliginea;antifungalactivity
收稿日期：2007-12-25
基金项目：上海市科委重大科技攻关项目（NO.03DZ19314）
作者简介：诸葛媛媛(1984-)，女，山东临沂人，硕士生，研究方向:生物农药;代光辉为本文通讯作者，E-mail:ghdai@sjtu.edu.cn.
上海交通大学学报(农业科学版)
JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY(AGRICULTURALSCIENCE)
Vol.26No.3
Jun.2008
第26卷 第3期
2008年6月
第 1期
等特点，近年来已成为国内外研究的热点之一[8]。
地锦（EuphorbiahumifusaWild）为双子叶大戟
科植物，在我国分布广泛，且已有大规模种植。用地
锦研制生物源农药，原材料丰富，价格便宜，且无特
殊毒性。本文就地锦抑菌活性物质的提取、分离和
纯化开展初步的研究，为开发高效、安全、新型的植
物源农药奠定基础，为更好的利用地锦活性物质开
发生物农药提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
地锦购自上海虹桥药业有限公司，经粉碎机粉
碎成20～40目粉末，于冰箱内4℃冷藏备用；黄瓜白
粉病菌采集于本院七宝实验农场；黄瓜种子选用感
病品种宝杨五号，从上海市农资公司购买。
1.2 实验方法
1.2.1 地锦粗提液的制备 称取 1000g植物材
料，用20L95%乙醇分3次浸泡提取（10、5、5L），每
次浸泡24h，过滤合并滤液，用旋转蒸发器 （RE-
52C，上海亚荣生化仪器厂生产）40℃减压浓缩至
干，称重后用蒸馏水经超声波溶解，配制成浓度为
100mg·mL-1的溶液，即地锦粗提液，于4℃冰箱内
冷藏备用。
取80mL地锦粗提液，用蒸馏水配制成5、10、
15和30mg·mL-1的溶液，各浓度提取液用室内盆栽
预防试验进行生物活性检验，蒸馏水为空白对照。
1.2.2 室内盆栽防病试验
1.2.2.1 病菌接种液的制备 从七宝实验农场自然
发病的黄瓜植株上采集白粉病菌，转接在室内盆栽
黄瓜植株上，25℃~28℃室温内培养备用。
用毛笔蘸取无菌水刷取发病黄瓜叶上新鲜的分
生孢子，然后用无菌水冲洗稀释，显微镜下计数，制
成8×104～105个·mL-1分生孢子悬浮液。从分生孢子
悬浮液制备至完成接种应限定在2h内。
1.2.2.2 供试黄瓜苗的培养 挑选籽粒饱满的黄瓜
种子，放置在用滤纸覆盖的培养皿中，滤纸上滴加蒸
馏水以用来保持湿润，盖好皿盖，将培养皿置于25
℃培养箱中催芽。
将露白的黄瓜种子种到已经装好土并用水浸润
过的花盆中，置于25℃生测室内光照培养待用。
1.2.2.3 试验方法 试验按国家南方农药创制中心
黄瓜白粉病生测SOP方法进行。取第一张真叶刚展
开时的黄瓜幼苗，用喉头喷雾器（L56-03，上海市嘉
定区医疗设备厂生产）对真叶进行待测植物提取液
的喷雾处理，24h后接种分生孢子悬浮液。设置空
白对照处理，每处理4株，3次重复。
黄瓜苗在处理后于25℃培养室内培养，6d后
记录每株黄瓜苗叶片上的病斑数，根据分级标准来
调查发病程度，计算病情指数和防效。分级标准参
考中华人民共和国国家标准（农药田间药效试验准
则 (一)杀菌剂防治黄瓜白粉病，GB/T17980.30-
2000）执行。0级：无病斑；1级：病斑面积占整片叶
面积的5%以下；3级：病斑面积占整片叶面积的6%
~10%；5级：病斑面积占整片叶面积的11%~20%；7
级：病斑面积占整片叶面积的21%~40%；9级：病斑
面积占整片叶面积的40%以上。
1.2.2.3 计算公式及数据处理 各处理数据利用
SAS软件进行统计分析，采用Duncan新复级差法进
行差异显著性检验(P≤0.05)。
病情指数=∑（各级病叶数×各级代表值）/（调查
总叶数×发病最重级代表值）×100
防效 （%）=100%-(处理组平均病情指数 /空白
组平均病情指数)×100%
1.2.3 地锦粗提液的系统溶剂分离 取地锦粗提
液500mL，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇
各萃取5次，获石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和
水相萃取物，分别减压浓缩至干后称重，用少量蒸馏
水溶解，分别配制成浓度为30、15、10、5mg·mL-1的
溶液。各组分不同浓度溶液用室内盆栽预防试验进
行生物活性跟踪，方法同1.2.2，蒸馏水为空白对照。
1.2.4 对水相萃取物的碱沉淀法与系统溶剂反萃取
地锦水相萃取物溶液中滴加稀NaOH溶液，调节
pH值为8，静置2h后离心。将沉淀依次用氯仿、乙
酸乙脂、正丁醇、丙酮、乙醇溶解抽滤，各组分浓缩至
干后加蒸馏水配制成样品。最后的不溶物用蒸馏水
悬浮后滴加稀盐酸，直至沉淀完全溶解。各组分用室
内盆栽防病试验进行生物活性跟踪，方法同1.2.2，测
试时设水相萃取物处理，蒸馏水为空白对照。
1.2.5 碱沉淀后所得上清液的高效液相色谱和质谱
联用(LC-MS)分析 对碱沉淀处理后所得到的上清
液进行高效液相色谱和质谱联用(LC-MS)分析，条
件如下。
1.2.5.1 液相色谱条件 色谱柱：C18(4.6×15cm)；
温度：40℃；流速：0.8mL·min-1；流动相：甲醇-水（
65:35，V/V，pH2.0）；进样量：10μL；DAD：254nm。
诸葛媛媛，等:地锦提取液防治黄瓜白粉病效果及其抑菌物质的初步研究 201
第 26卷上海交通大学学报(农业科学版)
注：水相萃取物碱沉淀后的生测结果。A：氯仿抽滤沉淀所得组分；
B：乙酸乙酯抽滤沉淀所得组分；C：正丁醇抽滤沉淀所得组分；D：丙
酮抽滤沉淀所得组分；E：乙醇抽滤沉淀所得组分；F：最后的不溶物
用酸溶解后的组分；G：上清液组分；H：水相萃取物.
Note:Waterphasewasaddedalkaliandthenalthephaseswego-
tusedforthepreventivebioassay.A,thephasethatchloroformdecom-
pressfiltratedfromthedeposition;B,thephasethatethylacetatede-
compressfiltratedfromthedeposition;C,thephasethatn-butylalco-
holdecompressfiltratedfromthedeposition; D, thephasethat
dimethylktonedecompressfiltratedfromthedeposition;E,thephase
thatethanoldecompressfiltratedfromthedeposition;F,thephasethat
thelastdepositionwasjustdissolvedbyacid;G,thesupernatephase;
H,thewaterphase.
处理 Treatments 病情指数Diseaseindex/% 防效 Protective
A 57.36 -3.23±1.49eb
B 48.15 13.34±3.77d
C 46.28 16.7±1.47d
D 61.23 -10.21±1.47f
E 42.21 24.03±2.5c
F 48.15 13.34±4.17d
G 16.67 70±1.64a
H 22.22 60±2.57b
空白对照CK 55.56 ——
表3 碱沉淀与系统溶剂反萃取分离的
室内盆栽防病试验结果
Table3 Thepreventiveefectofdepositby
alkaliandsystemsolventseparatetothe
cucumberpowdermildewonpotedplants
1.2.5.2质谱条件 ES源：正离子检测(POS)；分子量
扫描：100-850；温度：40℃；CID：70V。
2 实验结果
2.1 地锦粗提液对黄瓜白粉病的预防效果
1kg地锦植物经 95%乙醇提取得到干物质
112.6g，将干物质用蒸馏水稀释成不同的浓度，对
不同浓度的粗提液进行生物活性的测定，结果表明，
地锦粗提液对黄瓜白粉病有明显的预防效果 （表
1），浓度为30mg·mL-1时，防效达到了67.45%。同
时，从表1中还可以看到，防效和粗提液浓度呈正相
关，随着粗提液浓度的增大而增加。
2.2 粗提液的系统溶剂分离结果
粗提液经系统溶剂分离后得到石油醚相、乙酸
乙酯相、正丁醇相和水相萃取物，浓缩后称重得干物
质分别为2.4、10.5、9.2和21.8g，各萃取物加入适
量蒸馏水配制成不同的浓度，进行各组分的室内盆
栽预防试验测定其预防性药效。
从表2可以看到，水相萃取物具有明显的抑菌
效果，在浓度为30mg·mL-1时其防效达到72.73%，
而其他有机溶剂萃取组分的防效很低，甚至没有防
效。该结果表明，地锦的生物活性物质为强水溶性，
而不易溶于石油醚、乙酸乙脂、正丁醇等有机溶剂。
2.3 水相萃取物的碱沉淀与系统溶剂反萃取结果
在地锦水相萃取物中滴加稀NaOH溶液，静置2
h后离心，将产生的沉淀依次用氯仿、乙酸乙脂、正丁
醇、丙酮、乙醇溶解抽滤，各组分浓缩至干后加蒸馏水
配制成样品，分别标为组分A，B，C，D，E；最后的不溶
物用蒸馏水悬浮后滴加稀盐酸，直至沉淀完全溶解，
标为组分F；将上清液的pH值调回中性，标为组分
G；地锦水相萃取物标为组分H。各组分用室内盆栽
防病试验来测定其预防性药效，药效结果见表3。
通过生物活性跟踪可以发现通过调节水相萃取
物的pH值可以把生物活性成分通过沉淀分离出来
（表3）。对沉淀用系统溶剂反萃取结果（组分A，B，
C，D，E，F）表明该部分中无生物活性成分，而上清液
（组分G）显示出较高的抑菌活性。通过碱沉淀可以
把大部分杂质从水相萃取物中去除掉，得到含有生
物活性成分更高的水溶液。
浓度/(mg·mL-1)
Concentrations
病情指数Disease
index/%
防效 Protective
efects/%
5 22.36 45.12±5.4cb
10 19.78 51.45±4.94bc
15 16.73 58.73±6.39ab
30 13.26 67.45±3.58a
空白对照 CK 40.74 ——
表1 地锦粗提液的室内盆栽防病试验结果
Table1 Thepreventiveefectsofcrudeextractsagainst
thecucumberpowdermildewonpotedplants
注：1:数值表示平均防效值±标准误差；2:采用Duncan新复级差法
进行差异显著性检验(P≤0.05),相同的字母表示二者之间没有
显著性差异，反之则表示有显著性差异；3:下表同.
Note:1:Thevaluesrepresentmeans±standarderors;2:Thesame
letersindicatenosignificantdiference(P≤0.05)byanalysis
ofvariancewithDuncan’snewmultiplerangemethod;3:The
sameasbelow.
浓度
Concentra-
tions
/(mg·mL-1)
防效 Protectiveefects/%
石油醚相
Extractof
petroleumeher
30 14.31±2.09ab
15 7.49±3.12b
10 0.66±1.26c
5 5.08±1.51b
乙酸乙脂相
Extrectof
ethylacetate
8.57±2.44b
-5.45±2.69c
-1.42±0.69c
13.69±2.82a
正丁醇相
Extractofn-
butylalcohol
水相
Extractof
water
20.37±3.03a72.73±2.54a
11.68±1.92b67.45±3.73ab
-5.45±2.26c 63.04±2.7b
3.19±0.72d 51.45±4.08c
表2 系统溶剂分离的室内盆栽防病试验结果
Table2 Thepreventiveefectofsystemsolventeluentsto
thecucumberpowdermildewonpotedplants
202
第 1期
2.4 高效液相色谱和质谱联用(LC-MS)分析结果
对从地锦水相萃取物中通过碱沉淀法分离出的
上清液（组分G）进行了高效液相色谱分析。通过不
同条件的摸索，确定其最佳分析方法：流动相甲醇-
水（65:35，V/V，pH2.0），DAD：254nm。图1为其液
相色谱图，图中有3个色谱峰，保留时间分别为
4.297、4.540和5.478min。经过质谱分析，推测它们
的分子量分别为506、202和275（图2、3、4）。
诸葛媛媛，等:地锦提取液防治黄瓜白粉病效果及其抑菌物质的初步研究
3 讨论
本研究通过室内盆栽试验证明了地锦提取液对
黄瓜白粉病有良好的预防效果，对地锦提取液的活
性成分进行了初步分离，确定了活性成分极性大易
溶于水，碱沉淀可以把大部分杂质去除掉，并用LC-
MS法对含量较高的组分进行了初步的检测，所获得
的高效组分中含有3个成分。究竟其中哪一个化学
成分为有效成份，其分子结构鉴定以及如何获得高
纯度物质仍需进行大量的研究工作。
地锦为一年生匍匐小草本，具有清热解毒、凉血
止血的功效。临床报道其水煎剂、酊剂对痢疾、肠炎
有很好的疗效,其作用强于黄连素,并无毒性。药理研
究表明其制剂对多种致病性球菌、杆菌有明显的抑
制作用及杀菌作用。王文和[9]等曾报道地锦提取物可
作为杀虫剂，对玉米象具有抑制种群形成作用，但目
前还没有作为应用于农业生产的杀菌剂的研究报
道。此外，地锦在农田中大量存在，往往作为杂草而
被去除。Qasem认为分布广泛的杂草作为抗菌植物
开发，变废为宝，更安全、更经济、选择性更高[10]，更
具有社会、经济和生态意义。
根据本研究发现，地锦提取液经过简单分离就
可得到较高纯度的生物活性成分，因此我们可以直
接将其加工成杀菌剂商品；通过LC-MS检测发现，
高效组分中含有3个成分，且推测其都是小分子物
质，所以我们也可以进一步的确定其活性成分和主
效成分，进行人工仿生合成，或者研究其构效关系，
创制我国有自主产权的农药“模板”。
(下转第232页)
203
第 26卷上海交通大学学报(农业科学版)
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