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地锦草与10种抗菌药联用对鸡大肠杆菌的体外抑菌效果



全 文 :收稿日期:2013-04-18;修回日期:2013-06-24
基金项目:河南省重点科技攻关项目(122102110185)
作者简介:贾艳华(1981 -),女,硕士,研究方向为细菌耐药机
制的研究及中药抗菌制剂的开发,ivy. clear@ yahoo. com. cn.
通信作者:李荣誉(1959 -),男,教授,本科,研究方向为兽药
新制剂的研制与应用,lirongyu126@ 126. com.
地锦草与 10 种抗菌药联用对鸡大肠杆菌
的体外抑菌效果
贾艳华1,李荣誉2,张国祖2,郭振环1,张帅帅1
(1.河南省康星药业股份有限公司,郑州 451464;2.郑州牧业工程高等专科学校,郑州 450008)
中图分类号:S831;S853. 72 文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2014)04 - 0126 - 04
关键词:地锦草;鸡致病性大肠杆菌;抗菌药物;联用; 单独应用;抑菌作用
摘 要:为了观察地锦草与阿莫西林等抗菌药物联用对鸡致病性大肠杆菌的体外抑菌效果,试验采用
琼脂稀释法分别测定地锦草与 10 种抗菌药物联用的抑菌作用,并与地锦草和抗菌药物单独应用时的
抑菌效果相比较。结果表明: 12 株大肠杆菌对抗菌药物呈现多重耐药性,地锦草对大肠杆菌的最小
抑菌浓度范围为 7. 812 5 ~ 31. 250 mg /mL; 地锦草与头孢曲松、头孢噻呋、氟苯尼考、多西环素联用时
的抑菌协同率为 58. 3% ~83. 3%,与阿米卡星、大观霉素、恩诺沙星、黏菌素联用时的抑菌颉颃率为
58. 3% ~100%,与阿莫西林、安普霉素联用时显示无关或颉颃作用。说明地锦草可以增强头孢曲松、
头孢噻呋、氟苯尼考、多西环素对大肠杆菌的抑菌作用,可以颉颃阿米卡星、大观霉素、恩诺沙星、黏菌
素对大肠杆菌的抑菌作用。
抗菌药物在控制动物感染或传染性疾病方面具
有重要作用,但随着抗菌药物的大量应用,细菌对抗
菌药产生的耐药性也比较普遍[1 - 5],严重威胁着动物
及人类的健康,已经成为人们关注的课题。细菌耐药
的机制比较复杂[6 - 9],几乎每种抗菌药物在临床投入
使用一段时间后都会出现耐药菌,并且耐药基因容易
获得,很难消除。人们出于对自身健康的追求和保
护,越来越趋向于选择绿色健康食品,国内外学者研
究的对象也聚焦到了中药,原因是中药具有低残留、
不易诱导细菌产生耐药性等优点[10 - 11]。但中药的抑
菌活性比较小,应用成本高,目前很少被单独用于兽
医临床,因此中药与抗菌药物联用防治细菌性疾病成
为研究的热点。两者合理地联用可以提高疗效,降低
抗菌药物的用量,减少毒副作用,扩大应用范围,缩短
疗程,并能发挥单独使用中药或抗菌药所不能取得的
治疗作用,显示出极好的发展前景[12 - 13]。地锦草属
于清热解毒类中药,具有清热解毒、抗菌止泻等作用,
本试验旨在观察地锦草与抗菌药物联用能否产生协
同作用,为临床合理用药提供指导,达到有效防治鸡
大肠杆菌及其他细菌性疾病的目的。
1 材料
1. 1 试验菌株
鸡致病性大肠杆菌 12 株,编号分别为 HXC、
HXX、HJZ1、HJZ2、HBX、HLJ、HBS、SXY、HKT、SDQ、
HXW、HBB,分离自临床;质控菌大肠埃希菌(菌株编
号为 ATCC25922),购自中国普通微生物菌种保藏管
理中心。
1. 2 抗菌药物
阿莫西林、头孢曲松、头孢噻呋、阿米卡星、安普
霉素、大观霉素、氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星、黏菌
素均为国产药,市购,按照《中华人民共和国兽药典》
(2010 年版一部)鉴定合格,使用时均在有效期内。
1. 3 中药
地锦草,购自河南省禹州市药材公司。按照《中
华人民共和国兽药典》(2010 年版二部)要求进行鉴
定合格。
1. 4 培养基
MHA 培养基(批号为 20120206)、营养肉汤
(NB,批号为 20110602)、麦康凯琼脂培养基(批号为
20120502)、GN增菌液(批号为 201108016),均购自
北京奥博星生物技术有限公司。
1. 5 主要仪器
YJ系列医用净化工作台,购自吴江市雄峰空调
净化设备有限公司;立式压力蒸气灭菌器(型号为
YXQ - LS - 75SⅡ),购自上海博讯实业有限公司医
621
Heilongjiang Animal Science
and Veterinary Medicine № 04 2014
DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2014.0115
2014 年 04 月(上)
疗设备厂;台式空气恒温振荡器(型号为 H2 -
9211K),购自江苏太仓市华利达实验设备有限公司;
隔水式恒温培养箱(型号为 GHP9160),购自上海申
贤恒温设备厂;电子天平(型号为 AUW220D),购自
日本岛津公司;超低温冰箱,购自合肥美菱电器股份
有限公司;Hisense 冰箱,购自青岛海信电器股份有
限公司;不同量程单道手动可调移液器,购自百得实
验室仪器(苏州)有限公司。
2 方法
2. 1 菌株的复壮与纯化
将菌种从 - 80 ℃冰箱中取出,在超净工作台中
用接种环接种至 GN增菌液中,37 ℃培养 16 ~ 18 h;
划线接种于麦康凯琼脂培养基上,37 ℃培养 16 ~
18 h;观察菌落的生长情况及菌落特征,挑取边缘整
齐、表面光滑、圆形、湿润、半透明的红色单个菌落进
行革兰染色,用显微镜进行形态学检查。把经过鉴定
的临床分离菌株及质控菌株大肠埃希菌分别无菌接
种至 GN增菌液中,12 h后用无菌接种环接种到麦康
凯琼脂培养基上,培养 18 h 后放 4 ℃冰箱保存作为
菌种用。
2. 2 地锦草原液的制备
准确称量地锦草 200 g,加入 10 倍量左右纯化
水,浸泡 30 min;先用武火煮沸,水沸后计算煎煮时
间,头煎 30 min,二煎 20 min,三煎 15 min。在煎煮过
程中要经常搅拌,每次煎得的药液都用 4 层纱布趁热
过滤,药渣也趁热过滤,合并 3 次滤液后用文火浓缩
至生药浓度为 1 g /mL。100 ℃高压灭菌 15 min,4 ℃
冰箱保存,备用。
2. 3 抗菌药物原液的制备
用万分之一分析天平精确称取适量的抗菌药物,
无菌操作溶于 100 mL 灭菌过的纯化水中,若药物不
溶于水,可加入相应的助溶剂使之溶解;然后加入灭
菌过的纯化水定容至 100 mL,制备成浓度为
2 560 μg /mL的母液;最后根据需要分装于若干个
10 mL的离心管中,置冰箱内于 - 20 ℃保存,备用。
2. 4 地锦草平板的制备
根据地锦草浓度加入所需的药液量和 MHA 培
养基,混合均匀,待琼脂平板凝固后倒置待用。
2. 5 抗菌药物平板的制备
每个平板加入 2 mL 不同梯度的抗菌药物,再加
入 40 ~ 50 ℃的 MHA 培养基 18 mL,混合均匀,待琼
脂平板凝固后倒置待用。
2. 6 地锦草与抗菌药物联用平板的制备
每个平板加入 2 mL 不同梯度的抗菌药物,再加
入事先制备好的含有一定浓度地锦草的 MHA 培养
基,混合均匀,待琼脂平板凝固后倒置待用。
2. 7 地锦草与抗菌药物联用的体外药敏试验
挑取纯化好的单个菌落至 GN 增菌液中过夜培
养,调整菌液浓度至 0. 5 麦氏后,用营养肉汤以 1∶10
稀释,用微量移液器吸取 1 ~ 2 μL菌液接种于已制备
好的含药琼脂平板表面(每处细菌数约为 1 ×
104 cfu),待菌液干后倒置于 37 ℃温箱内培养 18 h。
试验重复 3 次,取其平均值。
结果判断:将琼脂平板置于暗色、无反光物体表
面上判断抑菌效果,以无细菌生长的最低药物浓度作
为最小抑菌浓度(MIC),单个菌落生长的忽略不计。
根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)的抗菌药物
耐药、中介、敏感性标准(2009 年第 19 版)进行判断,
标准中未包含的药物耐药界定参考同类药物中相似
药物的标准。
3 结果与分析
3. 1 地锦草对 12 株鸡致病性大肠杆菌的抑菌效果
(结果见表 1)
表 1 地锦草对 12 株鸡致病性大肠杆菌的 MIC
mg·mL -1
中药
菌株编号
HXC HXX HJZ1 HJZ2 HBX HLJ HBS SXY HKT SDQ HXW HBB
地锦草 31. 250 15. 625 15. 625 7. 813 15. 625 31. 250 31. 250 15. 625 31. 250 15. 625 7. 813 31. 250
由表 1 可知,地锦草对 12 株鸡致病性大肠杆菌
的 MIC值范围为 7. 813 ~ 31. 250 mg /mL。
3. 2 10 种抗菌药物对 12 株鸡致病性大肠杆菌的抑
菌效果(结果见表 2)
表 2 10 种抗菌药物对 12 株鸡致病性大肠杆菌的 MIC
μg·mL -1
菌株
编号
阿莫
西林
头孢
曲松
头孢
噻呋
阿米
卡星
安普
霉素
大观
霉素
氟苯
尼考
多西
环素
恩诺
沙星
黏菌素
HXC > 256R 256R > 256R > 256R 4S 64I > 256R 4S 8R 0. 25S
HXX > 256R > 256R > 256R > 256R > 256R 128R > 256R 8I 64R 4R
HJZ1 > 256R > 256R > 256R 2S 8I 64I > 256R 16R 0. 25S 0. 25S
HJZ2 > 256R > 256R > 256R > 256R 4S 128R > 256R 16R 32R 0. 25S
HBX > 256R 32I 32R > 256R 8I 128R > 256R 16R 16R 0. 5I
HLJ > 256R > 256R > 256R > 256R > 256R 128R > 256R 32R 64R 4R
HBS > 256R 256R > 256R 2S 4S 8S > 256R 8I 32R 0. 25S
SXY > 256R ≤8S ≤2S 2S > 256R 8S 256R 8I 8R 0. 25S
HKT > 256R 256R > 256R 2S > 256R 64I > 256R 8I 64R 0. 25S
SDQ > 256R 256R > 256R 16S > 256R 64I > 256R 32R 32R 4R
HXW >256R 256R > 256R 2S > 256R 128R > 256R 8I 16R 0. 25S
HBB > 256R 256R > 256R 2S > 256R 64I > 256R 8I 16R 0. 25S
注:R 代表该菌株对该药耐药,I 代表该菌株对该药中介,S 代表
该菌株对该药敏感。
由表 2 可知,鸡致病性大肠杆菌对阿莫西林和氟
苯尼考的耐药率是 100%(12 /12),对头孢噻呋和恩
诺沙星的耐药率是 91. 7%(11 /12) ,对头孢曲松的耐
721《黑龙江畜牧兽医》科技版
药率是 83. 3% (10 /12)。对黏菌素的敏感率是
66. 7%(8 /12),对阿米卡星的敏感率是 58. 3%(7 /
12)。对大观霉素、多西环素的中介率是 41. 7%(5 /
12)和 50. 0%(6 /12)。说明鸡致病性大肠杆菌对常
用抗菌药物的耐药性比较普遍。
3. 3 地锦草与 10 种抗菌药联用的体外抑菌效果(结
果见表 3)
表 3 地锦草与 10 种抗菌药物联用的体外抑菌效果
中药 抗菌药
联用效果
协同 相加 无关 颉颃
地锦草
阿莫西林 6 6
头孢曲松 10 2
头孢噻呋 9 1 2
阿米卡星 5 7
安普霉素 2 5 5
大观霉素 1 2 9
氟苯尼考 9 1 2
多西环素 7 5
恩诺沙星 12
黏菌素 12
由表 3 可知,地锦草与抗菌药联用时抑菌协同率
较高的是头孢曲松 83. 3%(10 /12),头孢噻呋、氟苯
尼考都是 75. 0% (9 /12),多西环素是 58. 3% (7 /
12)。抑菌颉颃率 100%(12 /12)的是恩诺沙星、黏菌
素,75. 0%(9 /12)的是大观霉素,58. 3%(7 /12)的是
阿米卡星。与阿莫西林、安普霉素联用时以无关和颉
颃作用为主。
4 讨论
地锦草对临床分离的禽源大肠杆菌的体外抑菌
效果尚未见有资料报道,本试验测定的结果是地锦草
对 12 株鸡致病性大肠杆菌的最小抑菌浓度范围为
7. 813 ~ 31. 250 mg /mL,即地锦草对不同株鸡致病性
大肠杆菌的抑菌效果不同,但差别不大。严晗光
等[14]以地锦草为主药,自拟处方,经水煮处理后测定
中药液对猪源致病性大肠杆菌的最低抑菌浓度为
62. 5 mg /mL,这和本试验的结果基本一致。笔者在
前期试验中测定了 40 多种中药对鸡致病性大肠杆菌
的抑菌效果,其中地锦草的抑菌作用相对来说比较
强。目前,尚缺乏对中药抑菌效果的统一判定标准,
如果按照郎利敏等[15] 介绍的判断标准,MIC <
7. 80 mg /mL为高度敏感,7. 80 mg /mL ≤ MIC <
250 mg /mL为中度敏感,大肠杆菌对地锦草属于中度
敏感范围。由于本试验采用水提法提取中药有效成
分,会影响不溶于水的成分提取,且药物加热过程、浓
缩过程、高压灭菌过程都会使对热敏感的中药成分受
到破坏,从而使地锦草的抑菌效果降低。
本试验所选的 10 种抗菌药物均为临床常用药,
由试验结果可以看出,病原菌对这几种抗菌药物都产
生了严重的耐药性,且这 12 株鸡致病性大肠杆菌都
为多重耐药菌株,最少的是 4 耐(SXY 株),最多的是
10 耐(HLJ株)。本试验数据和郑蓓等[16]在 2011 年
监测的大肠杆菌耐药性试验数据接近(大肠杆菌对
氟苯尼考的最高耐药率是 88. 5%),本试验所用的大
肠杆菌是 2011 年 10 月份—2012 年 4 月份收集的临
床鸡致病性大肠杆菌,对氟苯尼考的耐药率已达
100%。郑蓓等[16] 报道的大观霉素的耐药率为
12. 8%,本试验检测的结果是 41. 7%(5 /12)。阿莫
西林、多西环素、恩诺沙星等抗菌药物也出现了同样
的情况,说明细菌的耐药程度在逐年升高。提示目前
临床鸡大肠杆菌的耐药形势相当严重,一旦确诊为该
菌感染,应通过药敏试验结果进行选药,不应盲目
用药。
中药和抗菌药物的抗菌作用机理不一样,抗菌药
的作用机理比较清楚,通过直接作用于病原菌新陈代
谢的某个或某些环节抑制病原菌的正常生长,从而达
到抑菌或杀菌的目的;而中药的作用机理主要是药物
所含的甙类、生物碱、多糖、挥发油等免疫活性物质能
活化机体的免疫系统,增强免疫细胞活性,促进体液
免疫、细胞免疫及免疫调节作用,从而提高机体的抗
感染能力,达到防病治病的目的。中药与抗菌药物联
用具有显著的优越性,既降低了抗菌药物的毒副作
用、减少了病原菌的耐药性和食品中的药物残留,又
克服了中药单用时抗菌效果不明显的缺点,具有疗效
高、毒性小、残留少,减少抗菌药物用量等优点,不仅
达到防病治病的目的,还可以增加饲料转化率及提高
畜产品的质量。中药和抗菌药物联用的相互作用可
能是一个药代动力学过程,也可能是一个药效动力学
过程,既可能相互促进,也可能互相制约。如地锦草
和头孢曲松、头孢噻呋、氟苯尼考、多西环素联用时主
要表现为协同作用,与黏菌素、恩诺沙星、大观霉素、
阿米卡星等联用主要表现为颉颃作用。清热解毒类
中药与抗菌药物联用多能形成协同作用,多数中药与
抗菌药物联用能达到作用互补、毒性互制的作用,同
时中药和抗菌药联用也会产生颉颃作用、降低疗效,
或增强毒副作用,加重病情。因此,临床采用中西药
联用时一定要选择合适的中西药物组合,避免滥用、
乱用。
本试验结果表明,地锦草分别与头孢曲松、头孢
噻呋、氟苯尼考、多西环素联用在体外对鸡致病性大
肠杆菌以协同抑菌作用为主,但在体内是否还产生协
同抑菌作用有待进一步研究。
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Heilongjiang Animal Science
and Veterinary Medicine № 04 2014
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(011)
收稿日期:2013-04-11;修回日期:2013-04-26
基金项目:江西省科技支撑项目(20112BBF60023);教育部高
校博士点专项基金项目(20113603120006);江西教育厅项目
(GJJ12254);江西农业大学自然科学基金项目(QN201101)
作者简介:梅天笑(1988 -),女,硕士研究生,研究方向为动物
药学.
通信作者:鲍光明(1981 -),男,讲师,博士,研究方向为动物
药学,bycb2005@ 163. com;王小莺(1969 -),女,副教授,硕
士,
檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼






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wangxiaoying6969@ 126. com.
淀粉支载烟酸前药的合成及其体外释放研究
梅天笑1,王小莺1,袁厚群2,万 根1,聂海静1,鲍光明1
(1.江西农业大学 动物科学技术学院,南昌 330045;2.江西农业大学 理学院,南昌 330045)
中图分类号:S859. 79 文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2014)04 - 0129 - 04
关键词:淀粉;烟酸;复合物;接入率; 体外释放;前药;红外光谱;核磁共振谱;紫外分光光度计
摘 要:为了降低烟酸的不良反应,试验以淀粉和烟酰氯为原料,合成了淀粉支载的烟酸高分子前药,
用红外光谱和核磁共振谱对其结构进行结构表征,用紫外分光光度计测定烟酸的接入率,并在人工胃
液和人工肠液中进行体外释放研究。结果表明:烟酸成功接到淀粉分子上,淀粉 -烟酸复合物在不同
介质的体外释放中均呈现零级缓慢释药且释药的开始阶段无爆释现象,与烟酸相比较,其作用时间明
显增长,说明该复合物有望大大减轻药物对胃黏膜和肠道的刺激作用。
烟酸又称维生素 B3,俗称尼古丁酸
[1],是人体和
动物代谢过程中不可缺少的营养成分,具有促进细胞
新陈代谢和扩张血管的功能[2]。烟酸为传统的广谱
调血脂药,在药理剂量下能有效降低人体内的低密度
脂蛋白胆固醇(LDL - C)[3],可以治疗Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ
型高脂血症和混合型高脂血症[4 - 5],长期应用还可降
低冠心病及其他脑血管疾病的发生率和死亡率[6]。
烟酸虽价廉且疗效确切,但不良反应较多,如引
起皮肤血管扩张[7],诱发溃疡病[8]等。另外,由于应
用剂量较大(3 ~ 6 g /d)[6],还可导致血糖增高等不良
反应,临床应用受到限制。烟酸在动物养殖中具有重
要意义,但同样不良反应明显。K. S. Spivey 等[9]研
究发现,中国荷斯坦奶牛皱胃烟酸灌注剂量为
16 g /d时,对采食量具有负面效应;另外,烟酸摄入
量过多可能会使动物产生呼吸麻痹和脂肪肝等症
状[10]。因此,通过结构修饰降低烟酸的不良反应显
得非常重要。淀粉廉价易得、无毒无害、无免疫原性、
在体内易降解,是药物制剂的常用辅料,是作为烟酸
支撑剂的最好选择。
试验先用烟酸和氯化亚砜合成烟酰氯,再用烟酰
氯和淀粉合成淀粉 -烟酸复合物。反应过程参照参
921《黑龙江畜牧兽医》科技版
DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2014.0116