全 文 ：中国中医药科技 2仪拓年 1月第 13卷第 6 期 P Se
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2以拓 vl o
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13N o
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6 4 13
地锦草总黄酮的超声提取工艺研究 关
朱 英 孙腹娣 ` 毛 桦 ,
(浙江中医药大学药学院 ·杭州 31 的 53 ` 浙江中医药大学药学院 2X( X) 级实习生 ·杭州 31加 53 )
摘 要 目的 : 确定地锦草总黄酮的优选超声提取工艺条件 。 方法 :采用正交试验法 ,考察乙醇浓度 、 溶剂
量和超声时间对提取率的影响 , 采用单因素考察试验 , 对提取次数进一步进行优选 , 用分光光度法测 定总
黄酮含量 。 结果 :所考察的 因素中 ,地锦草总黄酮的提取影响程度为 : 超声时间 > 乙醉浓度 > 溶剂量 。 确
定超声提取条件为超声提取两次 ,每次超声条件为 A I B , c l ,即 20 倍量 60 % 乙醉超声 30 分钟 。 结论 : 该方
法具有提取时间短 、 简单 、 收率稳定和无需加热等优点 。
主题词 地锦草 /分析 总黄酮 /分离和提纯 工艺学 , 药学
地锦草为大戟科植物地锦 百i切ho rb 沁 hnU可泌 a 环锐及l 。 或
班地锦 召中ho rb 记 口以理` 以 。 L . 的干燥全草 。 具有清热解毒 、 凉
血止血之功能 。 地锦草资源十分丰富 , 目前临床上多用于治
疗菌痢 、肠炎 、病毒性肝炎 、 咳血 、尿血 、便血等。 药理研究表
明地锦草的抗菌抗炎作用明显 , 止血作用效果好 [’ 〕 , 有很强
的清除和抑制 自由基的作用 z[, 3 J,是一种较强的抗氧化植
物 [’] ,而且对 · O H 引发 的 DNA 氧化损伤有一定的保护作
用囚 ,其水煎液还有保肝作用同 。 而地锦草水提液 、 乙醇提
取液均具有较强的黄酮反应 , 为了提高地锦草总黄酮收率 ,
有利于进一步研究地锦草总黄酮的提取纯化和药理作用 ,本
文采用正交试验法等对地锦草总黄酮的超声提取工艺进行
了研究。
l 仪器和药品 I班盆止d a 一 12 型可见紫外分光光度计 :美国
PE 公司生产 ; K Q520 B 型超声波清洗器 : 昆山市超声仪器有
限公司 。 地锦草由浙江中医药大学中药饮片厂提供 ,经我院
药植教研室陈锡林副教授鉴定 ;芦丁对照品 : 中国药品生物
制品检定所 ;其余试剂均为分析纯 。
2 方法与结果
2
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1 地锦草总黄酮的含量测定川及方法学考察
2
.
1
.
1 对照品溶液的制备 精密称取经 120 ℃减压干燥到
恒重的芦丁对照品 10 . 72 gm ,置烧杯中加适量 95 % 乙醇 ,使充
分溶解 , 定量转入 10 碱 容量瓶中 ,用 95 % 乙醇稀释定容至
刻度 ,摇匀 , 即得 o . l a7 2 ngz ·血 一 `的芦丁对照品溶液 。
2
.
1
.
2 供试品溶液的制备
2
.
1
.
2
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1 药材的预处理 取地锦草约 5 .飞 ,精密称定 , 用
50 耐石油醚冷浸 12 小时 ,过滤 ,药渣再用 50d 石油醚冷浸
12 小时 ,过滤 ,药渣挥去石油醚至无石油醚味。
2
.
1
.
2
.
2 供试品溶液的制备 将预处理好的药材用 20 倍量
印% 乙醇超声提取 30 分钟 ,过滤 , 用 印 % 乙醇洗涤药渣 ,合
并乙醇提取液 , 回收醇液至干 ,残留物用 巧初 蒸馏水分次溶
解 ,定量转移到分液漏斗 中 ,用水饱和正丁醇萃取 (巧耐 x
8)
,合并正丁醇层 ,减压回收正丁醇至干 ,残留物用 95 % 乙醇
、 浙江省教育厅资助项目 No . 2田汉刃54
溶解 ,定容于 50 d 容量瓶中 ,摇匀 ,作为供试品溶液 ,待用 。
2
,
1
.
3 测定波长的选择 精密吸取对照品溶液和供试品溶
液适量 ,按标准曲线项下显色 , 于 粼洲) 一 以刃unI 范围内进行扫
描 ,结果显示在 42 1nm 处均有最大吸收峰 ,故测定时选用此
波长 。
2
.
1
.
4 稳定性试验 精密吸取供试品溶液适量 ,按标准曲
线项下操作显色 , 测定吸收度 ,然后每隔 20 分钟测定吸收
度 ,结果表明供试品溶液在显色后 印 一 1印分钟内吸收度基
本稳定 。
2
.
1
.
5 标准曲线的制备 精密吸取芦丁对照品溶液 0 . 5 、
一 0 、 1 . 5 、 2 . 0 、 2 . 5 、 3 . 0 、 3 . sml ,分别置于具塞试管中 ,各加 95%
乙醇至总体积为 5时 ,摇匀 ,再分别加人 2 . 5% 三氯化铝溶液
3 d
,
10 %醋酸钾溶液 5而 ,摇匀 ,放置 60 分钟 , 同时以相应试
剂作空白 , 在 42 l lun 处测定吸收度 , 以浓度 C为横坐标 ,吸收
度 A 为纵坐标 ,进行线性 回归 ,得回归方程 A 二 32 .盯呢 C -
0
.
01 25
: = 0注理刃 ,在 0 .似 1 一 0 . m 87 gm · 诚一 ’浓度范围内 ,吸
收度与浓度呈良好线性关系。
2
.
1
.
6 精密度试验 精密吸取供试品溶液适量 ,按标准曲
线项下操作显色 ,测定吸收度 7 次 ,计算供试品溶液中总黄
酮 含 量 , 结果为 0 . 46 18 、 0 .肠 55 、 0 .肠 55 、 O月肠 l 、 0 .肠 59 、
0
.粼拓3 、 0 . 4仅拓gm
·血 一 ` ,咫D 二 0 , 35 % ( 。 二 7)
2 1
.
7 样品测定 精密吸取供试品溶液适量 ,按标准曲线
项下操作显色 ,测定吸收率 ,按回归方程求出供试品溶液中
总黄酮的含量 。
2
.
1
.
8 重现性试验 精密吸取同一批号供试品溶液各
0
.
5而 ,按标准曲线项下操作显色 ,测定吸收度 ,计算供试品
溶液中总黄酮含量 , 结果为 0 . 45 14 、 o冲科石、 0 . 45 98 、 0 . 46 3 、
0
.
45 卯 、 o 闷&巧 、 0 .肠 18 嗯· 而 一 ’ , RS D 二 2 . 70 % ( n = 7) 。
2
.
1
.
9 加样回收率试验 精密吸取同一供试品溶液适量 ,
加人一定量的对照品溶液 ,按标准曲线项下操作显色 ,测定
吸收度 ,计算回收率 ,结果见表 I 。
2
.
2 地佛草总黄酮一次超声提取的正交试验及实验结果
2
,
2
.
1 正交试验设计 选择乙醇浓度 、 溶剂用量 、 提取时间
3 个因素 ,进行 肠 (罗)正交试验 (见表 2) , 以总黄酮含量为考
·
41 4
· 中国中医药科技 2仪巧年 1 月第 13 卷第 6期 脚 , 2“拓 vol . 13 No . 6
察指标进行考察 。
表 1 加样回收率试验结果
编号 供试品溶液中总黄酮含量(啤
0
.
115!5
0
.
1巧15
0
.
115 15
0
,
11515
0
.
115巧
加人芦丁 吸收度 侧定量 回收率平均回收率 脚
对照品(耐 (A) (叫 (% ) (肠) (% )
0
.
1仆狡 0 . 57哭 0 .川书 101 4、
0 1】视 .0 55幻 .0 刀85 2 肠 . 拼
0 lr阴 0 . 5朔 0 .公叼】 凭 . 艾 劳 .以 2位
0 11刃2 0 55卯 0 .刀期 叨 ,位
0 11视 0 .幻匆 0洲幻 】01 .27
l
,`ó` J怪`J
表 2 因素与水平
水平 乙醇浓度 (A % ) 溶剂量 B( 倍 ) 超声时间 (C im n)
1 0 20 30
2 70 40 4()
3 80 印 50
2
.
2
.
2 正交试验及实验结果 分别取同一批地锦草样品约
5
.飞 9份 ,精密称定 ,根据 肠(犷)正交试验设计表 (表 3) 选择
的条件 ,按总黄酮含量测定供试品溶液制备项下操作并测定
含量 ,结果见表 3 。
表 3 场 (犷 )正交试验设计表及试验结果
次.二2丹、é
47葵2
23仅优.
J几ùOn凡6ù城j勺`nUJ
2
内`佗JōJqà伟`6工f0
总黄酮含黄
对地锦草总黄酮提取的影响大小顺序为 C > A > B ,但均无显
著性影响 。 但当表 5将 2 、 4 列合并后 ,因素 C超声时间有一
定影响。 正交试验所得最佳提取工艺为 lA 几 cl 。 但考虑 B
因素的试验结果在统计上无影响 ,故结合实际情况 , B 因素
(溶剂量 )选择 B , 较合适 。 因此 ,最后优选得到的最佳提取
工艺为 20 倍量 印% 乙醇超声提取 30 分钟 。
2
.
.2 4 工艺验证试验 按照正交试验优选出的最佳工艺
A , B: C, 提取并测定正交试验用的同一批地锦草样品中总黄
酮的含量 ,结果地锦草总黄酮的含量均较高 ,分别为 3 . ,仍 、
3
.
75 1
、
3
.
943
、
3
.
82 哪
·
g
一 ’ , BS D 为 2 . 74 % ,这说明正交设计筛
选的工艺是稳定可行的 。
2
.
3 地佛草总黄酮超声提取次数的确定
取地锦草样品约 5 . 呢多份 ,精密称定 ,按 2 . 1 . 2 和 2 . 1 . 7
项下 ,根据超声提取工艺条件 20 倍量 印% 乙醇超声 30 分
钟 ,分别超声提取 l 次 、超声提取 2 次和超声提取 3 次 ,并测
定总黄酮含量 ,结果见表 6 ,可以看出 ,超声提取 2 次和提取 3
次效果均优于超声提取 1次 , 而且提取 2 次和 3次效果相近 ,
所以结合实际情况 ,考虑超声提取条件为超声提取 2 次 , 每
次 20 倍量 印% 乙醇超声 30 分钟 。
表 6 确定超声提取次数试验结果
超声提取次数 总黄酮平均含量 (毗· g “ ) SR (D % ) (n 二 3)
4 2别〕
6
.肠 8
6
.
5 54
1 12
2
.
2 1
.2 07
10 肠3
10
.
185
9
.
52
0
.肠 3
.910.10.9.1城场与R
2
.
2
.
3 正交试验结果分析 按方差分析理论得方差分析结
果见表 4 。 表 4表明各因素均没有显著性差异 ,而表中 B 因
素的离差平方和接近误差列的离差平方和 ,为了提高分析的
精度 ,可将列表 2 、 4 合并 ,于是合并组成新的方差分析表 5。
表 4 方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F
O 么刀兜7 2
.0 仪阵拓 3 2
O 粼刃8 7 2
0
.佣四乃 2
0
.
l m奥种
.0 以 2 182
0
.乞抖货抖
.0 供1菊 2
ù、à
07
:
,
内乙,二星」ABCD
0F 刀: ( 2 , 2 ) 二卯 . 0 凡.叮 ( 2 , 2 ) 二 19 . 0 OF . : ( 2 , 2 ) 二 9 . 0
表 5 方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F 显著性
.0 加书抢7 2
.0 粼刃朋 7 2
0
.
I C口肠 4
0
.
1任及抖
.0 之洲华抖
0
.洲眨
2
.
5
5
.
6 P < 0
.
1
A厂U
误差 (列 2再合并 )
0F
_饥 ( 2 , 4 ) 二 18
、
0 0F 邓 ( 2 , 4 ) 二 6 ,弘 0F 注( 2 , 4 )二 4 . 32
由表 3 直观分析和表 4方差分析结果可知 ,各考察因素
3 讨论
3
.
1 总黄阴提取溶剂的选择
实验中曾采用月伪 一 KA c 显色测定地锦草中脂溶性黄
酮和水溶性黄酮的含量 ,结果脂溶性黄酮与水溶性黄酮的含
量比为 :1 1 . 23 。 考虑到水对脂溶性黄酮提取不完全 ,本实验
选用含水醉作为提取溶剂。
3
.
2 总黄酮纯化方法的确定
地锦草的乙醇提取物进行 D 10 ,大孔树脂柱色谱 ,用水洗
去糖等极性大的杂质后 ,再用不同浓度的乙醇洗脱。 将不同
浓度的乙醉洗脱液浓缩定容 ,经紫外扫描后 ,发现在 42 l lun
处无最大吸收峰 ,而且与用水饱和正丁醇萃取纯化后样品的
紫外扫描图谱比较发现 , 总黄酮含量明显低于后者 , 因此本
实验采用萃取法纯化。
3
.
3 总黄酮苹取溶剂的确定
地锦草乙醇提取液浓缩后 ,分别采用水饱和正丁醇和乙
酸乙醋进行萃取 ,结果表明以水饱和正丁醉萃取效果较好 。
用乙酸乙醋萃取时 ,亲脂性杂质残留太多 ,干扰了 42 l lun 的
吸收峰。 故本文采用水饱和正丁醇进行萃取纯化。
3
.
4 显色方法的选择和显色时间的确定
黄酮类化合物可与铝盐形成有色络合物 ,引起紫外吸收
峰向长波方向移动 ,所以常采用铝盐反应显色测定总黄酮的
含量。 本实验采用 2 . 5% 川伪 一 10 % K A c 的显色方法 。 文
献 ;t] 报道 ,加人 习q 一 KA c 显色剂后的溶液需放置 40 分钟
后测定 ,但本文经稳定性试验表明 , 由于药材 、 仪器等因素的
影响 ,这种方法在显色后印 一 1印分钟内吸收度是基本稳定
中国中医药科技 2仪拓年 n月第 13 卷第 6期 Se n
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2以拓 o vl
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13 o N
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615 4
的 。 和谷胧甘肤过氧化物酶活性的影响 .时珍国医国药 , 2以犯 ; 13 (1 2) :
参考文献 7 24
l 褚小半 ,廖万玉 ,楼兰英 ,等 .地锦类中草药的药理作用研究 .时珍 5 阿不都热依木 ,阿不都艾尼 , 哈木拉提 , 等 . 五种维吾尔药的清除
国医国药 ,20 1; 12 ( 3) : 193 经自由基及抗 D N A损伤作用研究
. 中草药 ,姗 1 ; 32 ( 3) : 23 6
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珍国药研究 , 19 7 ; 8 ( 4) : 3 08 1肠
4 曹瑞珍 , 张国文 , 薛燕 , 等 . 地锦草提取物对小鼠血液过氧化氢酶 (修回 : 2以万 一 a7 一 27 )
桃仁 承气汤对 急性 呀功 憾 衷竭 大 鼠呀功憾 众 电解质的影 响
朱 虹 王灿晖 , 杨 进 1
(南京中医药大学 2 0 3级博士研究生 ·南京 21 仪犯9
张庆宏 1
南京中医药大学 ·南京 21 0 2 9 )
1 实验材料
溯勿: 普通级 ( C)L S D 大鼠 71 只 , 雌雄各半 , 体重 (2 1 49 士
18
.
3 45 ) g
, 由南京中医药大学动物实验中心提供。 药物及试剂 :桃仁
承气汤 , 参照《温病条辨》原方剂量 , 即大黄 18 9 、芒硝 8 9 (冲服 ) 、桃仁
1电 、当归 l电 、 赤芍 I飞 、丹皮 1电。 攻下组参照《温病条辨》及前人用
药经验 , 即大黄 18 9 、芒硝 12 9(冲服 ) 。 活血化痕组参照《温病条辨》剂
量 ,即桃仁 10 9 、赤芍 10 9 、丹皮 10 9。 以上药材均由南京中医药大学国
医堂提供 。 各组药物水提浓缩成含生药 1扩耐 口服液 ,置于 2 50 司 盐
水瓶中 , 4 ℃保存备用 。 速尿由常州康普药业有限公司生产 , 批号 :
以1X( )2 8
2 实验方法
动物分组 :大鼠饲养 1周后 ,将其随机分为正常组 、 模型组 、 攻下
组 、 活血化窟组 、速尿组 、 桃仁承气汤组 。 造模 :参考文献甘油注射方
法造模川 。 各实验组注射甘油造模后 24 小时 , 灌服中药等效量和肌
注速尿 ,正常组灌服生理盐水 。 以上药物 8 小时 1 次 , 连续 3 次后 ,改
为 2 次 /天 ,连用 2 天 ,以后不再给药。 观察项 目与检测方法 : 上述各
组动物于第 1 次给药后 48 小时 、 72 小时后 , 用水合氯醛 0 . 3 n刃 10 9
腹腔注射麻醉后 ,摘眼球取血 5 一 6而 , 3X( X) r/ 而n 离心 10 分钟 , 分离血
清 ,置于 一 20 ℃冰箱以备检测 。 aN 十 、 K 斗含量用比浊法检测 ; BNLJ 含
量用二乙酞 一 厉法检测 ; C r 含量用碱性苦味酸法检测 。 统计分析 :采
用 5 15 骆 . 0 统计软件 , 计量资料采用方差分析 (巧 D 一 t 检验 ) 。
3 结果
3
.
1 一般情况
各组大鼠均无死亡 , 正常组大鼠饮食正常 ,反应灵敏 ,体毛顺滑
光泽 ,二便正常 ;模型组大鼠少尿 ,呈淡葡萄色 ,大便千量少 , 反应迟
钝 ,蜷缩 , 体毛无光泽 ,耸毛 ,饮水饮食量极少 ;桃仁承气汤组大鼠尿
量较模型组稍多 , 排稀水样便 , 饮食尚可 , 至用药 72 小时后 , 进食量
多 ,尿量增加 ,无明显肉眼葡萄色尿 、 大便软而成形 。
3
.
2 大鼠血 Na + 、 K 十 、 BNLJ 、 Cr 的测定结果 见附表 。
4 讨论
中医学认为 ,急性肾功能衰竭的主要病机为湿 、热 、痰 、 毒互结 ,
气血逆乱 ,脏腑功能失调 ,三焦气化失司 ,病势凶险 , 病情危重 , 痰热
组合 ,湿毒内蕴 。 邪实正虚是急性肾功能衰竭的病理基础 。 急性肾
功能衰竭的病理特点是肾功能急剧下降 , 使体内代谢产物的郁结 ,
水 、 电解质紊乱 ,出现氮质血症 、高钾血症和代谢性酸中毒 。
桃仁承气汤以桃仁为君活血化寮 ;赤芍 、丹皮以助桃红之力为
附表 各组大组鼠血清 Na 十 、 +K 、 BNLJ 、 Cr 的测定结果 (无土 : )
组别 。 Na 小 (血沙动 +K (画必1{) 以娜沙日 B叹俪又z日
正舰 7 1让 18 士 .l8 铭 3 . 8 士 .05 8 狱肠士 .l0 叨 773 .lt 阶
模型组(跳 ) 7 .14 龙士.6 23△ .53 8士 .0肠△ .l84 企 5 肠△ .147 3土 8 .兔△
模型组(蛛 ) 7 153 盯 * .16 , △ .54 1士。.37 。 撇 53t 呱创△ 4] 乃* .51 △
承气汤组(48卜) 7 165 .汤* 14 J s# 4一4土 0 . 53行 一16.肚士肠 .艾言 , 67 * 4铭#
积汤组(几卜) 7 以 . 15士 22 .对# 4 . 29* 。刀 禅 121. 43 土 28 .犯全 5.铭士 2 . , #
活血组(铭卜) 6 14 .刀士 1二令 .4。 士 .0 91△ 13 361 *拓 .刀全 .7 21士 1.53 仲
活血组(刀h) 6 z56 . xs * 一伪全 5 .为土 r,佣全 lm .31* 一8 .叽# 6 . 劝士。% #
攻下组(姗 ) 6 149 35 士.12 53令 .4卯动 .3 全 既犯士业“ # 6 . 18 土2渭 #
攻下组(几h) 6 1印 .肠土6 .61# 5 .01土0 .已全 一01 .01, 15 .势# 6 .几士 2 .肛#
速尿组伽日 6 里貂 .目士 7,57全 .5刀土.0好令 15 . 场* 已 .绍。 .6I 犯士氏。l令
速尿组(仍 ) 6 145 .刀士l2, 卯令 .4 71* 。.40 0 105 .85 * 3溜 . .8 71 土 3 .刀#
与正常组比较△ P <.0仍;与同时段模型组比较# P <。. 05 ;与同时段承气汤组比较. P <.0叮
辅 ;大黄 、芒硝为臣通闭破结 , 泄热软坚 , 攻逐癖结 ,使痕热下行 ;当归
养血活血 ,行血中之气 , 令气帅血行 ,消中有补 。 全方合用 ,通导下焦
察热 、导热泄浊 ,使邪热疲血从下祛除。 现代药理研究证明 , 该方除
了对急性肾功能衰竭的病因 (原 )有针对性外 ,还可提高排尿率 , 改善
微循环 , 增加肾脏血氧供应 , 促进坏死组织吸收 ,加快损伤组织的修
复和再生 ,提高肾小球滤过率 (C FR ) ,促进肌醉 、 尿素氮等从肾脏中
排泄 ,本实验结果表明在 ARF 模型大鼠使用本方后可见 rC 、 B洲 的
水平下降 , CFR 的提高 ,微循环的改善 ,可以促进肾小管的修复再通 。
从而使 aN 十一 K + 一人)】, 功能渐趋正常 。 故可使 aN 十 、 +K 等电解质的
水平恢复 , 达到保护肾功能的目的。 而单纯应用活血化痪或攻下的
药物 ,对提高大鼠血 Na 干和降低血 K + 是无效的 ;而对于降低大鼠血
清 cr 、 BuN 含量则效果显著 ,说明单纯应用活血化痰或攻下的药物可
以改善肾脏微循环 ,提高 C FR ,而不能及时改善肾小管的分泌与重吸
收功能。 人R F的发病机理主要就是肾小管的损伤或 A r N ,减轻肾小
管的损伤与提高 C FR一样 ,在治疗 ARF 中同样重要 , 因此除了要提
高 以丑外 , 减轻或恢复肾小管的部分功能 ,保护 Na 十一 K + 一A T p 的
运转 ,在治疗 A RF 中也是必要的。 可以推测 ,桃仁承气汤不仅通过
其攻下 、活血作用来提高 C FR ,更可以促进肾小管的修复再通 ,体现
了中药复方 “ 多环节 、多靶点” 的作用特点 。
参考文献
1 郭德玉 ,李斌 ,张丽 ,等 .甘油致急性肾功能衰竭大鼠模型 . 中国实
验动物学杂志 , 1卿 ; 7 (4) : 2 12
(收稿召叉万 一 01 一供 )