全 文 ：第 19 期
收稿日期：2014－05－29
基金项目：2012 年农业部“西部之光”访问学者培养计划项目
作者简介：向极钎（1967－），男，湖北恩施人，正高职高级农艺师，主要从事药用植物资源开发与利用研究；通讯作者，李锡香（1961－），女，研究员，
博士生导师，主要从事蔬菜种质资源遗传多样性与系统发育研究。
第 53 卷第 19期
2014 年 10 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 53 No.19
Oct．，2014
碎米荠（Cardamine hirsuta L．）［1］为十字花科碎
米荠属 1～2 年生草本植物， 生长在海拔约 1 000 m
的山坡林下沟边湿地，全国各地均有野生，是近年
来研究较多的聚硒植物。 壶瓶碎米荠（Cardamine
hupingshanensis）由湖南师范大学刘林翰、刘克明发
现并命名， 主要分布在湖南北部的壶瓶山一带 ［2］。
2000 年湖南农业大学向天勇 ［3］在湖北省恩施州硒
矿区鱼塘坝发现近似植物， 并定名为恩施碎米荠
不同产区碎米荠 nrDNA ITS序列分析及
亲缘关系鉴定
向极钎 1，2，李锡香 3，王 萌 1，殷红清1，2，帅超群 1，2，朱云芬 1，2
（1．恩施州农业科学研究院，湖北 恩施 445002；2．恩施州硒应用技术与产品开发研究院，湖北 恩施 445002；
3．中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘要：堇叶碎米荠、壶瓶碎米荠与恩施碎米荠存在命名混乱的现象，从植株外部形态来看难以区分。 为研
究其亲缘关系，分别从 4 个有代表性的地点采集不同的居群，进行核糖体基因（nrDNA）的内转录间隔区
（ITS）序列比较分析，并构建其系统发育树。结果表明，所有 4 份材料 ITS 序列全长均为 709 bp，其中来自
宜昌长阳和五峰的材料碱基序列完全一致，与来自恩施和壶瓶的序列相比，分别有两个碱基位点不同，4
个群体的碎米荠（Cardamine hirsuta L．）可以聚为一支，居群之间的遗传距离很近，为 0～0．003，这种差异
未超过一个种范围内的变异，初步证明 4 个不同产地的碎米荠为同一个种，归为堇叶碎米荠。
关键词：碎米荠（Cardamine hirsuta L．）；核糖体 nrDNA；内转录间隔区（ITS）；序列分析
中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2014）19－4737-04
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2014．19．061
nrDNA ITS Sequences Analysis and Genetic Relationship Identification of Cardamine
from Different Geographical Regions
XIANG Ji－qian1，2，LI Xi－xiang3，WANG Meng1，YIN Hong－qing1，2，SHUAI Chao－qun1，2，ZHU Yun－fen1，2
（1． Enshi Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences，Enshi 445002，Hubei，China；
2． Enshi Selenium Institute of Applied Technology and Product Development，Enshi 445002，Hubei，China；
3．Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081，China）
Abstract： Cardamine violifolia，Cardamine hupingsh anensis and Cardamine enshiensis exist the phenomenon of confused
naming. They are difficult to be distinguished from the external form of the plant． In order to study the genetic relationship of
Cardamine hirsuta， different populations from four representative place were collect of. Ribosomal DNA （nrDNA） internal
transcribed spacer（ITS） sequences were comparatively analyzed. The phylogenetic tree was constructed． The results showed that
the full－length ITS sequences of all materials tested were 709 bp， consisted with the material base sequences from Changyang
and the Wufeng. There were two base sites different from Enshi and Huping. The four groups of Cardamine hirsuta were in
one cluster. The genetic distance between populations was between 0 ～0．003， not exceeding a range of variation. It is
indicated that the Cardamine hirsuta of four different origins are the same species as the Cardamine violifolia．
Key words： Cardamine hirsuta L．； ribosomal DNA nrDNA； internal transcribed spacer （ITS）； sequence analysis
湖 北 农 业 科 学 2014 年
QT－1 QT－2 QT－3 QT－4
图 1 供试碎米荠外部形态
表 1 碎米荠取样地点
代码
QT-1
QT-2
QT-3
QT-4
取样地点
湖北宜昌长阳崩尖子
湖北宜昌五峰梨子坪
湖南石门壶瓶山
湖北恩施双河鱼塘坝
经纬度
110°45′25″E，30°16′9″N
110°35′7″E，30°10′8″N
110°46′56″E，30°6′30″N
109°46′49″E，30°10′49″N
海拔//m
1 205
1 545
1 330
1 524
GenBank 登录号
KF530883
KF530884
KF530885
KF530886
（Cardamine enshiensis）。 傅书遐［1］、彭诚等［4］将在此
处发现的碎米荠鉴定为堇叶碎米荠（Cardamine vio-
lifolia），随后白宏锋等 ［5］将壶瓶碎米荠与近年来所
报道的恩施碎米荠以及堇叶碎米荠归为同一个种，
孙紫薇等［6］分析了恩施渔塘坝地区碎米荠的形态特
征与核型， 发现该地区碎米荠存在居群间分化，属
堇叶碎米荠。王玉兵等［7］又把在湖北省五峰、长阳发
现的近似植物鉴定为壶瓶碎米荠，2013 年中国科学
技术大学教授尹雪斌研究组将在湖北恩施发现的
超富硒植物定名为壶瓶碎米荠。 综上所述，恩施碎
米荠、堇叶碎米荠及壶瓶碎米荠存在命名混乱的情
况，其命名在世界植物学界争论激烈，且从植株外
部形态来看非常接近，难以区分，均具有很高的硒
富集能力。
高等植物的核糖体 DNA （Ribosomal，rDNA）是
由串联重复的多拷贝序列组成，每个拷贝包括编码
区和内转录间隔区，编码区包括 18S、5．8S 和 26S 基
因，序列高度保守，进化速率慢，常用于探讨分类学
上科及以上分类单位的系统发育问题 ［8］；编码区之
间为内转录间隔区 （Internal transcribed spacer，
ITS），依顺序分为第一转录间隔区（ITS1）和第二转
录间隔区（ITS2）。 ITS 区域序列进化速率较编码区
快，可以提供较丰富的变异位点和信息位点，而且
稳定性好、测序方便，已成为研究植物分类和亲缘
关系的有效工具和重要标记［9－12］。
本研究依据报道分别从湖北宜昌长阳崩尖子、
宜昌五峰梨子坪、恩施双河鱼塘坝，湖南石门壶瓶
山 4 个有代表性的地点采集不同的居群，进行核糖
体基因（nrDNA）的内转录间隔区（ITS）序列比较分
析，并构建其系统发育树，从分子生物学角度探讨
恩施碎米荠、堇叶碎米荠及壶瓶碎米荠之间的亲缘
关系，以期为碎米荠的分类鉴定及系统发育等研究
提供理论依据，为进一步探究碎米荠超聚硒生理特
性奠定基础。
1 材料与方法
1．1 供试材料
供试材料于 2013 年 4 月分别采自不同的地
点，每个种群取 50株。采样地点的情况见表 1。 4份
材料外部形态见图 1。
1．2 DNA提取
分别称取 4 个不同产区的碎米荠幼嫩叶片
100 mg， 经液氮冷冻研磨， 采用改良 CTAB 法提取
DNA［13］。取 2 μL DNA样品用 0．8％的琼脂糖进行电
泳检测。测定 OD值，调整 DNA浓度，分别等量混合
群体的 DNA。
1．3 引物设计
引物设计参照文献 ［9］， 分别为 ITS5 （5′－
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′），ITS4（5′－TC-
CTCCGCTTATTGATATGC－3′）， 由上海生物工程技
术服务有限公司合成，扩增产物将依次包含部分的
18S 编码区、ITS1、5．8S 编码区、ITS2、部分 28S 编码
区，预计大小为 709 bp。
1．4 目的片段 PCR扩增
ITS 区扩增 PCR 反应体系体积为 25 μL， 包括
模板 1 μL（60 ng/μL），dNTP 2 μL（10 mmol/L），10×
buffer 2．5 μL， Taq 酶 1μL（1 U/μL）；正反向混合引
物 1 μL （10 μmol/L）。 PCR 反应程序为：94 ℃预变
性 5 min；94 ℃变性 1 min，55．8 ℃退火 1 min，72 ℃
延伸 1 min，35 个循环；最后 72 ℃保温 5 min，4 ℃保
4738
第 19 期
存。反应结束后，取 2 μL反应产物 1．2％琼脂糖凝胶
电泳检测扩增结果，在凝胶成像系统上观察拍照。
1．5 测序及分析
将 ITS区扩增产物送生工生物工程股份有限公
司纯化测序， 在 GenBank 中搜索相近序列并下载，
采用 MEGA5．1软件，邻位相接法（Neighbor－Joining，
NJ）构建系统树，模型选择 Kimura－2－parameter，自
展检测 1 000次。
2 结果与分析
2．1 DNA质量检测
经电泳检测，提取的碎米荠 DNA 质量较好，呈
明亮的细线状条带（图 2）。将提取的 DNA稀释后测
定其 OD 值，然后调整其浓度为 30 ng/μL，分别等量
混合每个群体的 DNA。
2．2 PCR检测与序列比对
分别以每个群体等量混合的 DNA 和随机选取
的单株 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 经琼脂糖凝胶
电泳检测，结果如图 3所示。 其条带清晰明亮，无杂
带，与理论设计长度基本吻合，PCR产物比较稳定。
经过序列的比对和校正，排除序列两端不确定
的碱基，最终获得了 4 条序列，长度均为 709 bp，4
个群体的序列已登录 GenBank，登录号见表 1。 通过
MEGA5．1 软件对校正后的序列进行比对，4 条序列
比较一致，只有个别位点不同，来自宜昌五峰和长
阳的 2个居群的序列完全相同（表 2）。
2．3 进化树构建和遗传距离分析
以 QT－1 为基准，在 NCBI 上进行 BLAST 比对，
分别选择下载最相似和得分最高的几条序列，搜索
核糖体 ITS 序列下的堇叶碎米荠（一条）、壶瓶碎米
荠（无）和恩施碎米荠（无），只得到了一条堇叶碎米
荠的序列， 对上述序列和本试验测序并校正的序
列， 利用 MEGA5．1 软件邻接法（Neighbor—Joining）
构建进化树，自展检验 1 000 次，选用 kimura-2－pa-
rameter 参数模型并且计算各序列间的遗传距离，结
果分别见图 4和表 3。结果表明，试验中 4个碎米荠
可以聚为一支，其遗传距离很近，为 0～0．003。
3 讨论
ITS 序列作为一种遗传分子标记，与形态标记、
生化标记和细胞学标记等技术手段相比，具有明显
的优越性。 ITS 区受外界环境影响较小， 进化速度
快，既具保守性又在科、属、种水平上具有特异性，
表 3 碎米荠各序列间的遗传距离
样品
QT-1
QT-2
QT-3
QT-4
A
B
C
D
E
F
G
QT-1
0.000
0.003
0.003
0.031
0.031
0.031
0.031
0.037
0.047
0.086
QT-2
0.003
0.003
0.031
0.031
0.031
0.031
0.037
0.047
0.086
QT-3
0.003
0.033
0.033
0.033
0.033
0.038
0.049
0.088
QT-4
0.033
0.033
0.033
0.033
0.038
0.049
0.086
A
0.000
0.000
0.000
0.005
0.015
0.072
B
0.000
0.000
0.005
0.015
0.072
C
0.000
0.005
0.015
0.072
D
0.005
0.015
0.072
E
0.016
0.070
F
0.083
G
注：A 为 DQ209091.1 Cardamine×ferrarii、B 为 DQ209087.1 Car-
damine×ferrarii、C 为 DQ209073.1 Cardamine amara subsp. amara、D
为 DQ209071.1 Cardamine amara subsp. amara、E 为 AM905717.1
Cardamine flexuosa、F 为 EF523394.1 Cardamine flexuosa、G 为
JF980320.1 Cardamine violifolia。
表 2 碎米荠 DNA 序列校对后的变异位点
序列
QT-1
QT-2
QT-3
QT-4
132 bp
T
T
C
T
161 bp
G
G
G
C
175 bp
G
G
A
A
图 2 碎米荠 DNA 电泳结果
M．100 bp DNA ladder；1～4．各群体扩增结果；5～8．各单株扩增结果
图 3 碎米荠群体和单株基因 PCR 扩增结果
1 2 3 4 5 6 7 8 M
1 000 bp
700 bp
600 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
带★号的序列为试验自测序列
图 4 碎米荠的 NJ 进化树
向极钎等：不同产区碎米荠 nrDNA ITS 序列分析及亲缘关系鉴定 4739
湖 北 农 业 科 学 2014 年
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（责任编辑 赵 娟）
（上接第 4736页）
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而且序列长度适中，含有足够量的遗传信息，不但
可以广泛用于物种间的鉴定，同时也被用于种内居
群间的差异性分析。
试验自测的 4条 ITS序列可以聚为一支， 亲缘
关系很近， 遗传距离为 0～0．003， 来自宜昌长阳的
QT－1 和五峰的 QT－2 碱基序列是完全一致的，与来
自湖南壶瓶山的 QT－3 和来自湖北恩施鱼塘坝的
QT－4分别有 2个碱基位点的变异，通过与 GenBank
相近序列的比对，确定这些变异位点出现在 ITS1 区
域。 本研究中的 DNA 模板来自群体内的 50个单株
等量混合，因此这些位点的变异是可信的。 自然状
态下的群体遗传背景比较单一，来自宜昌、壶瓶和
恩施的碎米荠可能有着共同的起源，在经历了长时
间的生殖隔离和进化后形成了不同的地方种。
在序列分析中，通过搜索 GenBank 里与堇叶碎
米荠、壶瓶碎米荠、恩施碎米荠同名的核糖体 ITS 序
列，找到了一条堇叶碎米荠的序列，但提到序列的
有机体来源是露珠碎米荠（登录号 JF980320），无其
他相关信息，从进化树结果看来，该序列与本试验
所得的序列亲缘关系比较远，很可能不是同一物种。
综上所述，本试验比较了 4 个野生群体碎米荠
ITS 序列的差异， 分析了其地理分布与 ITS 序列的
相关性，结果表明这种差异未超过一个种范围内的
变异， 初步证明 4 个不同产地的碎米荠为同一个
种，归为堇叶碎米荠。 由于本研究只选取了产自湖
北和湖南 2 个临近省份的材料进行系统发育分析，
其起源中心在哪里，它们与云南等较远地区碎米荠
居群间的遗传变异程度还未做鉴定分析，有待进一
步探讨和研究。
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