全 文 ：一氧化氮对一叶 碱诱导的突触传递长时程增强的作用
许　琳 , 张均田＊
(中国医学科学院 、中国协和医科大学药物研究所 , 北京 100050)
摘要:目的　研究一叶 碱对麻醉大鼠突触可塑性形成中一氧化氮(nitric oxide , NO)的作用。方法　以在体记
录突触传递长时程增强(long-term potentiation , LTP)的电生理学方法 , 记录大鼠海马齿状回颗粒细胞层群峰电位
(population spike , PS);以硝酸还原酶法测定 NO 含量。结果　在侧脑室给予 0.2 nmol·L-1一叶 碱(securinine , 5μL)前
给予 1μmol·L-1 7-硝基吲唑可抑制 LTP 的诱导 。给药前 ip L-精氨酸 250 mg·kg-1可逆转这种抑制作用。取脑进行
NO含量测定 ,与一叶 碱对照组相比 , 7-硝基吲唑+一叶 碱给药组的 NO 含量明显下降。结论　选择性一氧化氮
合酶(nNOS)抑制剂 7-硝基吲唑抑制一叶 碱对 LTP的诱导;由 nNOS 催化产生的 NO 参与了一叶 碱诱导 LTP的过程。
关键词:突触传递长时程增强;一叶 碱;一氧化氮;逆行性信使
中图分类号:R282.71;R965;Q424　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513-4870(2002)12-0918-04
　　LTP 自 1973年被首次发现以来 ,人们对其确切
的细胞和分子机制尚未搞清 。LTP的诱导需要突触
后 N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体的激活 ,它的维
持又与突触前神经递质释放增加有关 ,其中一些信
使分子可能从突触后向突触前转移 。这些联系突触
前后的逆行性信使(retrograde messenger)成了倍受人
们关注的焦点 , 其中NO尤其受到重视 。NO在生物
体内有广泛的生物活性 ,作为一种逆行信使 ,它也参
与突触可塑性(synaptic plasticity)的形成[ 1] 。1991 ～
1992年间 ,以 Bohme ,Schuman ,Madison 和 Haley 为首
的4个研究小组首次对 NO 在 LTP 中可能的作用进
行了研究 。他们发现一氧化氮合酶抑制剂能阻断海
马脑片 LTP的形成 ,而这种抑制作用可被左旋精氨
酸(L-Arg)所逆转[ 2 , 3] 。
　　一叶 碱是从大戟科植物一叶 叶中提取的生
物碱 。药理学研究已经证明一叶 碱对中枢神经系
统 ,特别是对脊髓有明显的兴奋作用。研究发现 ,一
叶 碱增强麻醉大鼠海马齿状回(dentate gyrus ,DG)
的基础突触传递效能和高频刺激诱导的 LTP ,其效
果呈剂量依赖性 , 但其具体的作用机制尚不清楚 。
为了研究NO是否在一叶 碱对麻醉大鼠突触可塑
性中发挥作用 ,我们设计了以下实验。
材 料 与 方 法
动物　SD大鼠 ,(200±20)g , ♂,由中国医学科
收稿日期:2001-12-14.
＊通讯作者　Tel:(010)63165179 , Fax:(010)63017757 ,
E-mail:Zjtian@public.bta.ney.cn
学院实验动物中心提供 ,实验前在动物房预饲养3 d 。
药品与试剂　一叶 碱由本所植化室提供 。先
以磷酸盐缓冲液(pH 5)配成 8×10-3mol·L-1的母
液 ,以1 mol·L-1 NaOH调至pH 6常温保存 。临用前
以 0.9%生理盐水稀释至所需浓度 。7-硝基吲唑(7-
nitroindazole ,7-NI ,Sigma ,USA), L-精氨酸(L-arginine ,
Sigma ,USA),NO试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
仪器　VC-11 记忆示波器 、SEN-7203 三道电子
刺激器 、SS-202J刺激隔离器为日本 Kohden 公司产
品;SR-6N 立体定位仪为日本 Narishige 公司产品;
751-紫外可见分光光度计 ,国产 。
电极的埋植　动物以 20%乌拉坦(1.0 g·kg-1 ,
ip)麻醉 ,并固定于立体定位仪上 ,参照 Pellegrino 大
鼠脑立体定位图谱在 AP0.5 ～ 0.8 , L1.6 ～ 1.8的位置用钻头
在颅骨上钻一直径 1.5 mm 的小孔并将一外径 0.8
mm的小钢管插入侧脑室。以同样的方法埋植刺激
和记录电极 ,刺激电极(两枚间距 0.5 mm ,外覆聚四
氟乙烯绝缘层 ,尖端裸露 0.2 mm ,直径 0.15 mm 的
不锈钢针构成)埋植于内嗅区穿通路(perforant path ,
PP)纤维间 ,其坐标为:AP7.5 ～ 7.8 , L4.4 ～ 4.6 , H3.5 ～ 4.0 。记
录电极(外覆绝缘层 ,尖端裸露 0.2 mm ,直径 0.2 mm
的不锈钢针)则埋藏在海马齿状回颗粒细胞层 ,其定
位坐标为:AP3.7 ～ 4.0 , L2.4 ～ 2.7 , H3.0 ～ 3.5 。在立体定位仪
上按定位坐标分别调整刺激电极和记录电极的位
置 ,当以固定强度的刺激记录到最大群峰电位
(population spike ,PS)时将电极固定。
PS的记录及其幅值的计算方法　PS 幅值被作
为齿状回颗粒细胞群兴奋性的指标。PS 的记录是
·918· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2002 , 37(12):918-921
DOI :10.16438/j.0513-4870.2002.12.002
采用细胞外记录法。测试刺激(波宽为 0.15 ms 的
方波刺激)由电子刺激器产生后 ,经刺激隔离器和刺
激电极输向 PP ,测试刺激频率为 30 s 次 ,刺激强度
则采用引起最大 PS 所需刺激强度的1 2。
给药方法　以 DMSO(0.1 mol·L-1)溶解 7-硝基
吲唑 ,再用 0.9%生理盐水将其稀释到所需浓度 。
L-精氨酸应用生理盐水配制。通过侧脑室篓管的给
药方式为:将连接微量注射器的细塑料管导入篓管
后 ,稳定 5 min ,记录基础突触传递 25 min ,然后将药
物或溶剂 5μL缓慢推注入侧脑室。末次注射后 ,细
塑管留在篓管内直至实验结束 。
药物浓度换算是将大鼠脑容积计量为 2 mL ,根
据给药体积以及原药液浓度 ,计算出药物浓度 。本
实验给予一叶 碱 0.2 nmol·L-1 , 7-硝基吲唑 1
μmol·L-1 ,7-硝基吲唑在一叶 碱给药前 10 min 侧
脑室通过篓管给予。L-精氨酸 250 mg·kg-1在 7-硝
基吲唑给药前 10 min ip。
数据的分析与统计　每个测试刺激都诱发 1个
PS ,连续 5个 PS 幅度叠加后的平均值作为该时间点
的PS幅值 ,以给药前 30 min记录的 6个时间点 PS
值的平均值为基础传递水平 ,再以该平均值分别除
以所有时间点的 PS幅值得出各相应时间点的相对
幅值(%),最后以时间为横坐标 , PS 相对幅值(%)
为纵坐标绘出 PS 幅值的动态变化图。统计用 t 检
验 ,以 Excel 7.0软件分析 。
NO含量的测定　原理:NO化学性质活泼 ,体
内代谢转化为硝酸根(NO3 -)和亚硝酸根(NO2 -),
而NO2 -又进一步转化为NO 3 -。本法利用硝酸还原
酶特异性将 NO3 -还原为 NO2 - ,通过显色深浅测定
其浓度的高低。方法:自立体定位仪上取下动物 ,断
头取脑 ,以液氮快速冷却后 ,取出称重。以预冷的匀
浆介质(pH 7.4 , 0.01 mol·L-1蔗糖 , 0.01 mol·L-1
Tris-HCl ,0.0001 mol·L-1 EDTANa2)制成 20%匀浆 ,
以Lowry法进行蛋白含量测定 ,以硝酸还原酶法检
测NO水平。
结 果
1　7-硝基吲唑对基础突触传递的影响
如图 1所示 ,麻醉大鼠侧脑室给予 7-硝基吲唑
(2 nmol , icv)60min后 ,海马 DG 的PS幅度与溶剂对
照组比较无明显差异 。PS 幅度在第 5 , 15 ,30 及 60
min时分别为(99±4)%,(103±5)%,(106±7)%及
(110±8)%。结果显示 ,在整个记录过程中 7-硝基
吲唑对麻醉大鼠海马 DG突触传递水平无影响。
Figure 1 　 Effect of selective nNOS inhibitor 7-
nitroindazole (7-NI) on long-term potentiation (LTP)
induction in the dentate gyrus of the hippocampus of
anesthetized rats.7-NI(2 nmol)was injected icv 10min
before vehicle , The average amplitude of the population
spikes recorded 30 min before 7-NI injection was defined
as 100%.All data were presented as x ± s of 6
observations.(P>0.1 vs control).★— ★Vehicle;○—○
7-NI
2　7-硝基吲唑对一叶 碱诱导麻醉大鼠 DG的
LTP的影响
麻醉大鼠侧脑室给予一叶 碱(0.2 nmol·L-1 ,
icv)可以诱导出 PP-DG LTP ,给药后 15 ,30及 60 min
的 PS幅度分别为(137±11)%,(156±12)%和(175
±6)%,(n=6 , P <0.01 vs vehicle group)。如在给
一叶 碱前 10 min给予 1 μmol·L-1 7-硝基吲唑 ,在
15 ,30及 60 min时的PS幅度值分别为(100±23)%,
(106±16)%和(124±20)%。与一叶 碱对照组相
比 ,7-硝基吲唑抑制了一叶 碱对麻醉大鼠 DG LTP
的诱导作用(n=6 , P<0.01 ,图 2)。
3　L-精氨酸对 7-硝基吲唑抑制作用的影响
如图 3所示 L-精氨酸 250 mg·kg-1在 7-硝基吲
唑给药前 10 min ip , L-精氨酸能够部分逆转 7-硝基
吲唑对一叶 碱(0.2 nmol·L-1 , icv)诱导的麻醉大
鼠突触传递的抑制作用 ,其幅度值在给予一叶 碱
后 15 ,30及60 min分别为(123±15)%,(129±11)%
和(149±12)%。虽然其幅度值与一叶 碱对照组
相比无明显差别 ,但其对 7-硝基吲唑抑制作用的逆
转有显著性意义(P<0.05 vs 7-NI+securinine group)。
4　NO含量的测定
单纯一叶 碱(0.2 nmol·L-1 , icv)给药 ,在 30及
60 min 分别测定脑内 NO 含量 ,均有明显增加(表
1)。而在给一叶 碱前 10min给予1μmol·L-1 7-硝
基吲唑 ,NO 含量有所下降(P <0.05),但仍明显高
·919·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2002 , 37(12):918-921
于空白对照组(P <0.01)。
Figure 2 　 Effect of selective nNOS inhibitor 7-
nitroindazole (7-NI)on long-term potentiation (LTP)
induction in dentate gyrus of the hippocampus of
anesthetized rats.7-NI(2 nmol)was injected icv 10 min
before securinine , and the average amplitude of the
population spikes recorded 30 min before 7-NI injection
was defined as 100%.All data were presented as x ±s
of 6 observations.■—■ Securinine;△—△ 7-NI +
securinine;★—★Vehicle
Figure 3 　Effect of L-Arg on the inhibition of 7-
nitroindazole(7-NI).7-NI was injected icv 10min before
securinine , and L-arginine (ip)was injected 10 min
before 7-NI.The average amplitude of the population
spikes recorded 30 min before L-arginine injection was
defined as 100%.All data were presented as x ±s of 6
observations.■— ■ Securinine;△—△ L-Arg +7-NI +
securinine;★—★ 7-NI+securinine
Table 1　Effect of securinine(0.2 nmol·L-1 , icv)
and 7-nitroindazole (7-NI)(1 μmol·L-1 , icv)on
NO release in rat brain
Group NO μmol·g -1 Rat number
Blank control 0.32±0.09 4
Securinine(30 min) 0.51±0.04＊＊ 4
Securinine(60 min) 0.82±0.08＊＊ 6
7-NI+securinine(60 min) 0.65±0.14＊＊# 4
Each figure represents x±s of 4～ 6 observations.＊＊ P<0.01
vs control , #P<0.05 vs securinine 60 min
讨 论
近年来的研究表明 ,NO 可发挥多种生理功能 ,
除扩张血管外 ,尚可促进免疫 、抗血栓 ,特别是在中
枢神经系统(CNS)中起着信息传递的重要作用 ,引
起了神经科学界的瞩目。NO是一种非经典的信使
分子 ,它与经典递质不同 ,不储存于囊泡 ,不以胞裂
外排方式释放 ,而以扩散方式达到邻近的靶细胞。
NO在 CNS 的突触可塑性中起重要作用。海马长时
程增强被认为是突触可塑性的一种模式 ,是学习和
记忆的细胞基础。近年来的研究结果表明 ,NO是参
与 LTP形成的逆行信使[ 4] 。
因为 NO很不稳定 ,生成后几秒中内便被氧化
成硝酸盐和亚硝酸盐 ,因而 NO 合酶的研究更为可
行 ,尤其 NOS拮抗剂的发现 ,大大促进了一些 NO功
能的研究[ 5] 。NOS有 iNOS ,nNOS和 eNOS 3种形式 ,
其中海马中主要为 nNOS和 eNOS ,我们实验发现选
择性 nNOS 抑制剂 7-硝基吲唑可抑制一叶 碱对
LTP 的诱导 , 而这种抑制作用被 L-精氨酸逆转 ,
nNOS产生的 NO参与了一叶 碱作用的麻醉大鼠
DG LTP 的形成。
在海马 LTP 的研究中 , LTP 可分为早期(early-
phase)和晚期(late-phase)LTP。在早期递质释放增
加 ,无蛋白合成 ,可持续 1 h左右。有研究报道[ 6] ,
NO参与 LTP 的早期阶段。突触后 NO 可能激活
GC ,产生 cGMP ,然后激活 PKG ,PKG 也是与海马 LTP
产生有关系的重要分子 ,PKG 抑制剂可抑制 LTP 的
产生。这样 ,通过NO-cGMP-PKG 信号通路提高突触
传递 ,产生活性依赖性长时程递质释放增加 ,诱导
LTP 产生。在本研究中发现给予一叶 碱后 ,NO的
含量与空白对照组有明显区别 ,且随着时间的推移
(30 ～ 60 min),NO含量明显增加。说明 NO确实参
与了一叶 碱对 LTP的诱导作用 ,这与文献报道一
致 。但利用硝酸还原酶法进行 NO含量测定 ,方法
的稳定性和灵敏度还有待提高和改进 。
此外 ,目前关于 NO 的作用机制还存在很大争
议 。NO在LTP中作为逆行信使的研究报道很多 ,但
也有报道 NO在 Ca2+ CaM 诱导的突触传递加强中
作为一个突触后信使作用 , 而不是逆行性信使作
用[ 7] 。而且 , CNS 中 NOS 的分布与兴奋性氨基酸
NMDA受体的分布是一致的 ,提示两个系统存在密
切关系。另外 ,NO的作用靶点还包括 ADP-核糖基
转移酶(ADPRT),NO可直接激活 ADP-核糖环化酶 ,
产生环 ADP-核糖 ,进而提高 Ca2+从胞内钙库释放 ,
·920· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2002 , 37(12):918-921
有报道[ 8] 这种释放在 HFS 诱导的 LTP 中所起的作
用已在海马脑片实验中得到证实 。另外 ,ADPRT 阻
断剂抑制 HFS诱导的 LTP ,NO对 LTP的作用可能存
在独立于GC-cGMP 之外的信号通路 ,即通过突触前
蛋白ADP-核糖基化的途径 。另一个NO的细胞内靶
点是 P21(ras)[ 9] 。NO可激活 ras , ras激活导致丝裂
原激活的蛋白激酶(MAPKs)的磷酸化 ,MAPKs调节
基因转录和LTP。总之 ,研究认为NO对这些通路的
调节利于Ca2+ CaM 诱导突触传递的加强 ,NO 为突
触后作用 。
在本实验中发现 NO参与了一叶 碱对麻醉大
鼠海马 DG LTP 的诱导 ,但其确切的作用机制尚待
深入研究 ,如产生的 NO 是属于逆行信使还是主要
作用于突触后作用 , 是作用于 ADPRT 还是 NO-
cGMP-PKG信号通路或 ras通路 ,尚待深入研究。
REFERENCES:
[ 1] Murphey RK , Davis GW.Retrograde signaling at the synapse
[ J] .J Neurobiol , 1994 , 25(6):595-598.
[ 2] Bohme GA , Bon C , Stutzmann JM , et al. Possible
involvement of nitric oxide in long-term potentiation [ J] .Eur
J Pharmacol , 1991 , 199(3):379-381.
[ 3] Schuman EM , Madison DV. A requirement for the
intracellular messenger nitric oxide in long-term potentiation
[ J] .Science , 1991 , 254(5037):1503-1506.
[ 4] Hawkins RD, Son H , Arancio O , et al.Nitric oxide as a
retrograde messenger during long-term potentiation in
hippocampus[ J] .Prog Brain Res , 1998 , 118(3):155 -
172.
[ 5] Son H , Hawkins RD, Martin K , et al. Long-term
potentiation is required in mice that are doubly mutant in
endothelial and neuronal nitric oxide synthase [ J] .Cell ,
1996 , 87(6):1015-1023.
[ 6] Lu YF , Kandel ER , Hawkins RD.Nitric oxide signaling
contributes to late-phase LTP and CREB phosphorylation in
the hippocampus [ J] .J Neurosci , 1999 , 19(23):10250 -
10261.
[ 7] Gladys YK , Paul TK.Nitric oxide acts as a postsynaptic
signaling molecule in Calcium Calmodulin-induced synaptic
potentiation in hippocampal CA1 pyramidal neurons [ J] .J
Neurosci , 1999 , 19(16):6784-6794.
[ 8] Wang JH , Kelly PT.Developmental changes of postsynaptic
calcineurin and IP3 receptors regulating synaptic transmission
[ J] .Soc Neurosci Abstr , 1997 , 23(11):1128.
[ 9] Yun HY, Gonzalez ZM , Dawson VL , et al.Nitric oxide
mediates N-methyl-D-aspartate receptor-induced activation of
P21ras [ J] .Proc Natl Acad Sci USA , 1998 , 95(10):5773-
5778.
EFFECT OF NO ON SECURININE-INDUCED LONG-TERM POTENTIATION
IN DENTATE GYRUS OF THE HIPPOCAMPUS OF ANESTHETIZED RATS
XU Lin , ZHANG Jun-tian
(Institute of Materia Medica , Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College ,
Beijing 100050 , China)
ABSTRACT:AIM　To study the effect of NO on securinine-induced long-term potentiation in the dentate gyrus of
anesthetized rats.METHODS　The population spike (PS)was recorded by electrophysiological techniques.Then the
rat brain was homogenized , of which the NO level was detected by spectrometry at 550 nm after the catalysis of nitric acid
reductase.RESULTS　Pretreatment with 7-nitroindazole(1μmol·L-1 , 5μL icv)was shown to inhibit LTP induced by
securinine(0.2 nmol·L-1 , 5μL icv)in anesthetic rats.The percentage of PS amplitude was (100±23)%, (106±
16)% and(124±20)% at 15 , 30 and 60 min , respectively (n =6 , P <0.01).Meanwhile , the NO level was
obviously higher in securinine group compared with that in 7-nitroindazole group(P<0.01).Nevertheless , L-arginine
(250 mg·kg-1 , ip)was found to reverse this inhibitory effect induced by 7-nitroindazole (P <0.05).CONCLUSION
Selective nNOS inhibitor 7-nitroindazole inhibited the securinine-induced LTP in anesthetic rats , which demonstrated that
NO was involved in securinine-induced LTP.
KEYWORDS:long-term potentiation;securinine;nitric oxide;retrograde messenger
·921·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2002 , 37(12):918-921