全 文 ：[药　理]
甘遂醇提物抗流感病毒 FM 1有效部位的筛选
郑维发 , 　陈才法 , 　朱爱华 , 　李梦秋
(江苏省药用植物生物技术重点实验室 ,江苏 徐州 221116)
关键词:甘遂;醇提物初步分离组分;抗病毒有效部位;淋巴细胞增殖反应
摘要:目的:阐明甘遂醇提物体内抗病毒有效部位;方法:以柱层析对甘遂醇提物初步分离。流感病毒小鼠肺炎适应株
(FM 1)对小鼠造模 , 以醇提物初步分离组分灌胃 ,最后计算各组分对感染病毒小鼠肺指数的抑制率。以3H-TdR渗入法测
定醇提物初步分离组分对小鼠 T 淋巴细胞的增殖反应。结果:甘遂醇提物经初步分离得 15 个组分 ,体积从 29500mL 到
95000mL , 是甘遂醇提物中第 8 ～ 15 组分 ,这 8 个组分对流感病毒引起的小鼠肺炎抑制作用最为显著 ,同时在低浓度下对
淋巴细胞的增殖作用是对照组的 2 ～ 3 倍。结论:抗病毒有效部位主要集中在组分 5 和极性较大的组分 8 ～ 15 , 这 9 个组
分体内抗病毒活性可能是通过刺激淋巴细胞的增殖 , 增强杀伤病毒感染细胞能力来实现的。
中图分类号:R282.710.5　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2002)05-0362-04
Screening for antiviral fractions from ethanol extract of Euphorbia Kansui Liou
ZHENG Wei-fa , 　CHEN Cai-fa , 　ZHU Ai-hua , 　LI Meng-qiu
(Provincial Laboratory of Biotechnology on medicinal Plants , X uZhou 221116 , China)
Key words:Euphorbia kansui ;ini tial f ractions of ethanol ext ract;antivi ral f ractions;lymphocyte proliferation
Abstract:Objective:To elucidate antiviral fractions f rom ethanol ex tract of Euphorbia kansui .Methods:Init ial
separation of ethanol ex t ract f rom Euphorbia kansui was performed by column chromatog raphy .The test mice
w ere infected w ith f lu virus mouse pneumonia adaptive st rain(FM1)and then treated w ith separated f ractions
int ragast rally fo r determining lung index inhibition rate.The T lymphocyte proliferation enhancement was ob-
served by the dosimetry of 3H-TdR inf ilt rated into DNA of the cell.Result:Ini tial separation of the ex tract af-
forded to 15 fractions.Fractions 8 ～ 15 w ith the elution volume from 29500 to 95000mL were highly ef fective to
the therapy of the mice pneumonia.The enhancement to the lymphocy te proliferation of the 8 fract ions under
low concentration were 2 ～ 3 times higher than that of the control.Conclusion:Fractions 5 and 8 ～ 15 exhibited
strong in v ivo antiviral activity to the test virus , which might be realized by stimulating lymphocy te prolifera-
tion , enhancing the capaci ty of killing the cells infected by the virus.
收稿日期:2001-02-04
资助项目:1.江苏省政府青年科学基金资助项目(BQ98040);2.江苏省教育厅自然科学基金资助项目(98KJBZ300001)
作者简介:郑维发(1962～ ),男 ,博士 ,教授.研究方向:药用植物成分化学及其药理毒理学研究.电话:0516-3403179.
　　甘遂(Euphorbia kansui Liou)为大戟科(Eu-
phorbiaceae)植物 ,广泛分布于我国西北及华北地
区[ 1] ,根据入药 , 传统医学上用来治疗腹水和癌
症[ 2 ,3] 。化学及药理学研究表明 ,甘遂醇提物中含
镇痛作用的二萜 Kansuinine A 、Kansuinine B[ 4 , 5] 、抗
白血病作用的二萜 Kansuiphorin A 、Kansuiphorin B
等[ 3] ,这些二萜类化合物都具有很强的细胞毒作
用[ 6] 。研究还表明 ,甘遂对肝炎病毒 、流感病毒等
有显著的抑制作用[ 7] ,并且发现 ,醇提物中的二萜
Kansuiphorin A , Kansuiphorin B 、及羊毛脂烷衍生
物 、甾体类衍生物对鸡新城疫病毒都表现出显著的
体外抑制作用[ 8] 。由于甘遂醇提物的毒性很大 ,临
床使用剂量十分有限 ,过量则引起腹痛 、腹泻 ,严重
时会出现剧烈呕吐 、血压下降 、脱水和呼吸衰竭等症
状[ 9] 。为了确立甘遂醇提物的毒性部位和对病毒
性疾病有治疗作用的有效部位 ,我们以流感病毒小
鼠肺炎适应株 FM1 对小鼠造模 ,开展其抗病毒有效
部位和毒性部位筛选工作 ,并分析了醇提物初步分
离组分对淋巴细胞的增殖作用 ,以期从细胞水平上
阐明甘遂醇提物抗病毒的作用机制 ,为甘遂的抗病
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毒中成药制剂的研制奠定实验基础 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
甘遂购置于南京市药材公司 ,药材由南京中医
药大学叶定江教授鉴定。流感病毒小鼠肺炎适应株
(FM1)由南京中医药大学微生物教研室提供。昆明
小鼠由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2　实验方法
1.2.1　甘遂醇提物的制备及初步分离
甘遂根(6kg)粉碎 ,在室温下以 95%乙醇提取 2
次 ,每次 24h ,减压蒸馏 ,得提取物 359g 。将提取物
与两倍重量的硅胶(100 ～ 200目 ,青岛海洋化工厂)
混合 ,按文献[ 10]所述的方法进行初步分离 。层析柱
规格为 140cm×10cm ,分离胶(100 ～ 200目)高度为
100cm ,样品胶高度为 20cm 。石油醚/丙酮梯度洗
脱(1∶0-1∶1)。每 500mL 收集 1次 ,蒸馏后薄层检
测 ,合并相同组分。
1.2.2　流感病毒 FM1 种毒的传代及对小鼠的毒力
测定
用PRM I-1640培养基对流感病毒 FM1 作 10-2
稀释 ,按文献[ 11]所述方法感染 10 ～ 12g 健康小鼠 ,
第 3 日取肺 ,碾碎后以 RPM I-1640 培养基稀释 ,
100r·min-1离心 5min ,上清液接入 10日龄 SPF 鸡
胚(南京药械厂提供),每胚 0.2mL ,48h后收集鸡胚
尿囊液 ,鸡红细胞凝集法滴定病毒活力。取血凝滴
度在 1∶640以上的鸡胚尿囊液 ,合并后分装无菌小
试管。 -80°C保存 ,作为试验种毒。对小鼠的毒力
测定:病毒以 RPMI-1640 培养基作 10 倍体积的梯
度稀释 ,每个梯度分别感染 14 ～ 16g 小鼠 ,每天记录
小鼠发病症状和死亡数 , 14日后按文献[ 11]计算半
数致死量(LD50)。
1.2.3　抗病毒有效部位筛选
抗病毒活性以醇提物初步分离组分对小鼠肺炎
治疗效果即肺指数抑制率为指标。选 14 ～ 16g 小
鼠 , ♀♂不分 ,按体重随机分组(每组 20只)。在染
毒的前一天开始给药 。将醇提物初步分离组分用色
拉油 、土温-80及生理盐水配制成 2mg·mL-1的乳
浊液 ,对小鼠灌胃(ig),按 62.5mg·kg-1·d-1剂量给
药。连续给药至感染后的第 3日 。到第 4日 ,先禁
食 、禁水 8h以上 ,按文献[ 12] 所述的方法剖杀小鼠 、
计算肺指数和肺指数抑制率。
1.2.4　对淋巴细胞的毒性及增殖反应
醇提物初步分离组分用 DMSO 配置成 20mg·
mL-1溶液 ,再以 10%胎牛血清的 RPM I-1640培养
基配制成 1mg·mL-1溶液 ,置 4°C冰箱保存备用。
对淋巴细胞的增殖反应以 3H-TdR 摄入法测
定 。小鼠淋巴细胞按文献[ 13]所述的方法的制备 ,即
用 10%胎牛血清的 RPM I-1640培养基将细胞稀释
为 1×107mL-1 ,加入 96孔板中 ,每孔 200μL。药物
的起始浓度为 100μg·mL-1 ,以二倍体积稀释成 6
个梯度 ,每个浓度梯度重复 3 次。最后每孔加入
10μg·mL-1的刀豆蛋白 A(Con A , Sigma)20μL 。对
照孔淋巴细胞只加入相同浓度的 Con A ,在 37°C 、
5%CO2 的细胞培养箱中培养 66h 后 ,每孔放射量
为 15μCi·mL-1的3H-TdR 20μL 继续培养 6h 。按文
献[ 14]所述的方法测定每孔的脉冲次数 cpm(放射
量),观察醇提物初步分离组分对小鼠淋巴细胞放射
量的影响 。放射强度测定采用的闪烁液为:2 ,5-二
苯基 唑(Sigma),0.5g ;1 ,4-双-(5-苯基 唑-2)-苯
(Sigma)0.25g ,二甲苯(宜兴亚盛),500mL 。
2　结果与讨论
2.1　各组分的特点
醇提物经过石油醚/丙酮梯度洗脱后 ,得到 15
个极性范围不同的组分(表 1)。其中组分 2 薄层层
析后经 10%H2SO4显色 ,为4个相距很近的紫红色
斑点。组分 6和 7对皮肤有强烈的刺激性 ,薄层层
析后经 10%H2SO4显色 ,可发现甘遂二萜典型的褐
色斑点 。这 15个组分中 ,组分 2为针状结晶 ,其余
为油状物。
2.2　对小鼠肺指数的影响
醇提物初步分离组分中 ,组分 1 、3对小鼠肺指
数表现出微弱的抑制作用 ,抑制率在 8.23%以下 ,
肺部肝样性病变达 30%左右;经组分 2 、6 、7 处理的
小鼠 ,肺指数出现了负值 , 分别为 -24.52%, -
30.52%, -20.12%。说明这 3个组分在所试剂量
下对小鼠病毒性肺炎不仅没有治疗作用 ,反而加剧
了肺炎的发展 。观察表明 ,这 3组小鼠的肺部肝样
性病变都在 65%以上 。组分 4 对小鼠的病毒性肺
炎表现出一定的治疗作用 ,但该组小鼠的肺部病变
仍在 15%左右 。组分 5 , 8 ～ 15 对小鼠病毒性肺炎
治疗作用显著 ,肺指数的抑制率都在 24.156%以
上 ,其中组分 8和 12高达 44.49%和 45.24%。在
所试剂量下 ,经这 9个组分治疗(灌胃 , ig)的小鼠肺
部无明显的病变。总提取物对小鼠肺指数的抑制率
为15.59%。
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表 1　 各组分的洗脱梯度 、洗脱体积重量和极性( x±s)
洗脱
组分
洗脱剂石油醚
/丙酮比例
洗脱体积
(mL)
薄层展
开剂
重量
(g) Rf 值
1 100∶0 1500-3000 P/A＊ , 50∶1 5.1 0.3～ 0.8
2 1000∶1～ 1000∶6 3500-6500 P/A , 20∶1 40.79 0.25～ 0.37
3 1000∶7～ 1000∶11 7000-9000 P/A , 8∶1 12.8 0.31～ 0.58
4 500∶1～ 500∶9 9500-13500 P/A , 6∶1 18.9 0.33～ 0.75
5 100∶1 14000-18500 P/A , 4∶1 17.3 0.31～ 0.68
6 100∶1～ 100∶2 19000-23000 P/A , 4∶1 20.1 0.27～ 0.62
7 50∶1 23500-29000 P/A , 4∶1 2.3 0.23～ 0.59
8 100∶3 29500-35000 P/A , 4∶1 22.3 0.20～ 0.51
9 100∶3～ 25∶1 40000-46500 P/A , 4∶1 21.5 0.21～ 0.46
10 25∶1～ 20∶1 47000-55000 P/A , 2∶1 2.4 0.29～ 0.59
11 20∶1 60000-63500 P/A , 2∶1 1.9 0.26～ 0.51
12 20∶1～ 10∶1 64000-76000 C/M ＊＊, 25∶1 21.3 0.27～ 0.49
13 10∶1～ 5∶1 76500-81500 C/M , 25∶1 18.7 0.22～ 0.46
14 5∶1～ 2∶1 82000-89000 C/M , 20∶1 15.7 0.28～ 0.52
15 2∶1～ 0∶1 89500-95000 C/M , 10∶1 25.6 0.27～ 0.44
　　＊:P/A , Pet roleum/Acetone(v/ v);＊＊:C/M ,C hloroform/Methanol(v/ v)
表 2　　提取物初步分离组分对流感病毒 FM 1 感染的
小鼠肺指数影响
提取物初步
分离组分
剂量
(mg·kg -1d-1)
肺指数
( x ±s)
肺指数
抑制率%
1 62.5 1.815897±0.17 8.23574
2 62.5 2.64±0.41 -24.52
3 62.5 1.837±0.29 7.123
4 62.5 1.713786±0.23 13.39
5 62.5 1.494±0.192 24.156
6 62.5 2.58287±0.37 -30.52
7 62.5 2.377±0.361 -20.12
8 62.2 1.08889±0.233) 44.49
9 62.5 1.16428±0.212) 41.15
10 62.5 1.17305±0.192) 40.69
11 62.5 1.2±0.262) 39.33
12 62.5 1.083±0.1923) 45.24
13 62.5 1.2656±0.112) 36.01
14 62.5 1.1778±0.1652) 40.45
15 62.5 1.424±0.1781) 28.01
总提取物 62.5 1.8023±0.1998 8.6
生理盐水对照组 1.082117±0.022
病毒模型对照组 1.978866±0.33
　　1):P <0.1 , 2):P<0.05;3):P <0.1
2.3　对小鼠淋巴细胞增殖的影响
甘遂醇提物初步分离组分对小鼠淋巴细胞增殖
的影响十分显著。其影响的程度随初步分离组分和
浓度的不同而表现出明显的差异 。组分 2 ,6 ,7对淋
巴细胞增殖表现出很强的抑制作用 。在浓度为
20μg·mL-1时 ,组分 8 、13和 14对小鼠淋巴细胞有
明显的增殖作用 ,其中以组分 13 和 14 最为显著。
随着浓度的 2倍递减 ,各组分对小鼠淋巴细胞增殖
作用开始增加 。组分 1 , 3 ,5 ,9 ,11 ,12在浓度为2.5
μg·mL-1 、组分 4 ,8 , 14 , 15 在 1.25μg·mL-1 、组分
10 ,13在 5μg·mL-1时 ,对小鼠淋巴细胞增殖作用达
到峰值 。(表 3)。
　
表 3　 甘遂提取物初步分离组分对小鼠淋巴细胞增殖的影响(cpm)
浓度
(μg·ml-1) 20 10 5 2.5 1.25 0.6125
组分 1 17353.33±34.3 25123.33±59.97 26036.67±44.48 37599±39.981) 32251±56.561) 30537.33±98.771)
组分 2 1165±59.7 11213.33±67.88 2332.67±67.88 4286.3±68.82 2901±45.76 1769.67±90.45
组分 3 28554.67±57.4 36131.67±63.321) 32033.67±43.671) 33715.67±91.311) 27124.33±77.277 23068.67±67.72
组分 4 22301.33±57.34 25586.67±57.98 28393±41.12 24456±57.77 32988±88.131) 28712±91.13
组分 5 25009.33±45.55 35125.37±77.671) 34937.67±57.731) 38441.67±87.991) 30063.33±97.771) 27893±45.781)
组分 6 459±79.9 989.33±99.98 12036.67±88.76 1202.33±112 1237±97.16 1588.67±113.67
组分 7 1055.67±23.24 1037.67±56.67 1062.33±56.66 3266.67±99.7 4721±115.1 5363.33±107.78
组分 8 32359±37.891) 50275±78.452) 51041±69.772) 46179.3±94.562) 46866±113.42) 44407.67±99.122)
组分 9 13673.67±44.43 32131.33±56.651) 49180.67±89.12) 53975.6±99.782) 50389±107.172) 45269±107.842)
组分 10 21999.33±57.67 47237.33±66.783) 57373±101.122) 57113±89.912) 49442±91.992) 44742±113.542)
组分 11 10612±23.171) 39556±67.891) 57184±106.72) 78776±170.233) 61092±112.953) 40896±99.161)
组分 12 8872±56.34 37612±111.871) 46748±89.31) 64292±118.813) 43880±77.792) 31256±67.881)
组分 13 43408±97.42) 46304±99.132) 57932±115.92) 48776±56.731) 41252±77.812) 30608±59.871)
组分 14 41056±109.332) 44672±134.712) 47216±88.92) 49112±79.242) 54144±117.652) 40044±66.631)
组分 15 27656±67.86 29184±39.97 30264±57.891) 47844±41.462) 48588±98.342) 34076±49.871)
正常细胞 2190.5±39.78 2198.5±44.79 22177.3±33.97 22135.7±44.4 23221.3±38.79 21304.9±45.99
对照
　　1):P <0.1;2):P<0.05;3):P <0.01。
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2.4　讨论
流感病毒进入肺部 ,感染肺部支气管粘膜和肺
壁上皮细胞 ,从而触发了机体的细胞免疫 ,引发了 T
淋巴细胞和 NK 细胞的增殖反应。其中细胞毒淋巴
细胞(CTL)在外来抗原和被抗原激活的 CD+4T 细
胞分泌的细胞因子的作用下开始增殖与分化 ,并对
感染病毒的细胞进行毒杀 ,NK 细胞分泌的细胞因
子如 IFN-γ能有效地加强巨噬细胞增殖和提高其
对病毒感染细胞吞噬能力[ 16 , 17] 。实验结果表明 ,甘
遂醇提物不同组分对 T 淋巴细胞增殖反应有所不
同。组分 2 ,6 和 7 对 T 淋巴细胞的增殖有明显的
抑制作用(表 3),这可能是这 3 个组分对流感病毒
FM1 引起的小鼠肺炎不仅没有治疗作用 ,反而加剧
了小鼠肺炎的发展的根本原因 。组分 4在较低的浓
度下对 T 淋巴细胞有一定的增殖作用 ,从而表现出
一定的体内抗病毒活性。组分 8-15 对 T-淋巴细胞
有着十分显著的增殖效应 ,增殖幅度是对照组的 2
～ 3倍 。这 8 个组分对流感病毒 FM1 引起的小鼠
肺炎治疗作用也十分显著 。组分 1 、3 、5对淋巴细胞
的增殖作用较弱 ,因而对流感病毒 FM1 引起的小鼠
肺炎没有显著的治疗作用 。
甘遂的总提取物对小鼠的免疫尤其是对淋巴细
胞类型的转化有一定的抑制作用[ 18] ,这可能是总提
取物(醇提物)对小鼠的肺指数抑制率只有 8.6%的
重要原因(表 2)。本实验结果还表明 ,甘遂醇提取
物中增强免疫成分和抑制免疫成分同时并存 。因此
对病毒性疾病的治疗 ,甘遂的中药饮片或总提取物
都不可能有明显的疗效。醇提物中对 T 淋巴细胞
增殖有抑制作用的三个组分含量分别为 40.79g(组
分 2)、20.1g(组分 6)和 2.3g(组分 7),分别占总提
取物的 11.36%、5.5%和 0.64%(表 1)。甘遂的醇
提物经适当的分离后除去这些免疫抑制成分后 ,不
仅大大提高小鼠病毒肺炎的疗效 ,还在一定的程度
上降低了毒副作用。
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2002 年 5 月
第 24 卷　第 5 期
中 成 药
Chinese T raditional Patent Medicine
May , 2002
Vol.24　No.5