全 文 ：兰后卫生 1 98 9年第1 0卷第 , 期
小扁豆凝集素的制备与质量鉴定
第 医院 李定 国 闰 兰 李春玲
提要 作者采用 甘肃产小扁豆 ,提取纯化出 L C A , 经鉴定达 到了电泳纯度 , 其分 子 量为 4 5。。。 ,
血凝滴度 , 紫外 、 红外光谱特性和氨基酸组成等均与标准 品基本一致 , 在 L C A亲和 交 叉 免疫电
泳分离甲胎蛋 自异质体中效果 良好 。 有推广应用价值 .
关键词 小扁豆凝集素 ( L C A ) 亲和交叉免疫电泳 自显影 甲胎蛋 白异质体
甲胎蛋 白异质体的检查 , 对于原发性肝
细胞癌的诊断有早期和确定的意义 。 而其检
测方法 , 目前常应用扁豆凝集素 ( L e n it l
L e c t in ; L C A ) 亲和交叉免疫 电泳 自 显 影
法 , 其中关键试剂为扁豆凝集素 。 我们参考
有关文献〔 1〕 , 利用甘肃当地的豆科 , 兵豆属
植物 , 兵 豆 ( L e n S C u l i n a r i S M e d i 。 ) 进
行了扁豆凝集素的制备及质量鉴定 , 取得了
满意的效果 , 简要报告如下 :
材料与方法
、 材料和试剂
1
. 兵豆 : 系甘肃产的豆 科 ( L e g u m i n o s a e )
植物小扁豆 ( 学名兵豆 ) 。 其种子和培株均经植物
学鉴定 。 器
2
. 试齐J: 甲胎蛋 白火箭电 泳 , P A G E 及 S D S
— P A O E试剂和 o . o 5M , P H s . 3 , T r i s 一 H e l缓冲液等 。
3
. 器材 : 高速捣碎机 , 冷冻离心机 , 电泳仪 ,
层析柱 , 紫外 、 红外分光光度 计 , 氨基 酸 分 析 仪
等 。
二 、 制备方法
1
. 取小扁豆 ( 干燥种 子 ) 10 . 0 只 , _如入 0 . 8呱
N a c l溶液 10 00 . 0m l , 置 4 ℃ , 浸泡 24小时 .
2
. 用高速捣碎机 ( 80 0 0转 /分 ) , 3 ’ x s , 捣
切成糊状物 .
3
.
4 ℃ 、 4 50 0 r p m 离 心2 0 ’ , 取 _ l: 层乳状液 。
4
. 向乳状液中加入固体硫 酸钱 至 1 / 3 饱和度
本实验观察了人皮泡巨噬细胞 , 并用缩
时定格龟影记录了其在机体外的细胞毒作用
过程 。 然而人体 内的情况是复杂的 , 有关人
巨噬细胞对肿瘤靶细胞毒的作用 , 还有许多
问题值得进一步研究和探讨 。
今 考 文 献
1
. 张友会 , 人体巨 咙细胞的研究 。 中华医学杂 志
19 7 8 ; 10 ( 58 )
:
6 0 3
。
2
. 中国医 学科学院肿瘤防治研究 所 日坛 医 院 ; 恶性
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1 97 6 : 4
: 2 2 9
。
3
。 张佩玉 , 等 。 人成骨 肉瘤细胞系 0 5一7 32 建立
及其特 征的观察 。 中华骨科杂 志 。 19 8 5 : 5
( 2 )
: 10 0
。
魂 . 卢平 。骨 巨 细胞 瘤中的巨 噬细胞 。 中华外科杂 志
1 9 8 5 : 5 ( 2 3 ) ; 2 6 9
。
5
.
Z h a n g Y u o t a l
:
C e l l u l a r e l e m e n t s i n
9 i a n t e e l l t u m o r o r b o n 。 , C ll i n o s
m e d i e a l J o 廿 r n a l 19 8 6 , 99 ( 4 ) * 2 6 8 。
6
。 魏文汉 。 病理生理学 。 上海科技 出版社 , 第 8
章 , 5 4 4页 。
7
。
B e n n e t t
,
B
。 e t a l .
’
r li e i
,
}l a g o e j t o s i s
0 f t u m o r e e l l
s i n v i t r o
。
T
r a n s p l a n t a t i o n
。
19 6` , 2 : 1 8 5 .
8 。 E
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:
M a e r o p h a g e s a n d t h e t u m o r
b e a r i n g h o s t
,
B r
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J
。
C a n e e r 1 9 7 3 , 2 8
( S
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. 1 )
: 1 0
.
9
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华微生物学和免疫学杂志 。 19 8 5 , 2 , 1 50
1 0 。 I
一
1 i b b s
,
J B
。 e t a l
`
M a e r o p l一 a g e t u m o r
K 111i n g 112 f l u e n e e o f t lI e l。 。 a l
e n v i r o m e n t
,
S e 一c e c e 19了了, 1 9了 . 2 7匀。
混匀 , 静 置室温 1 小时 , 按 _ L述条件离 心 , 收集其
上清液 。
5
. 向 _ 「清液 中再加入 固体硫酸馁 至 2 / 3 饱 和
度 , 混匀 , 静置 室温 1 小时 , 按前述 条件离心 , 收
集沉淀物 ,
6
. 将沉淀物用 0 . 0 5M , P H S . 3 , L r i S一 H C I
缓冲液溶解 , 并用蒸馏水彻底透析至无 N H 6为止 ·
再用上述缓冲液透析平衡 .
了. 将上述经透析平衡的提取 物 , 再经 D E A E
纤维素柱层析进一步纯化 。
三 、 质量鉴定
1
. 聚丙烯酸胺凝胶 电泳 ( P A G E ) : 电 泳 缓
冲液为 D . O SM , P H S . 3 , T ir s 一 甘氨酸缓冲 液 ,
分离胶浓 度为 10 肠 , _ 卜样 髦10 O u g左右 , 在恒流下
(板状电泳 ( 15 X 1 6 C m ) 采用 2 0 m A / 板 , 圆 盘
电泳 ( 0 . 5 X 10 C m ) 采用 Z m A /管〕 电泳 约 4 小
时 , 用考马斯兰 R一25 0染色 .
2
.
S D S— P A G E 〔 2〕: 电泳 条 件与 P A G E相似 , 但在各个系统 中均加入 S D S , 样品中 尚 含
有 a 一 琉基 乙醇 , i.) 加热处理 。 除用考马斯 兰 R 一
R 一 2 50染色外 户 尚用铬银染色 。
参考标准为 : 转铁蛋白 ( M W ; 76 50 0 ) , 牛
J舰清广l蛋 白 ( M W : 662 4 8 ) , 卵白蛋 白 ( M W ;
4 5 00 0 )
, 碳酸醉酶 ( M W ; 2 90 00 ) , 溶菌酶 ( M
W
: 14 50 0 ) 等 .
3
.
L C A亲和交叉免疫 电泳自显影 〔 3〕。
4
. 人红 细胞凝集试验 .
5
. 血凝抑制试验— 与糖结合的特异性 。
6
. 蛋 自质 含鼠测定 , 采用紫外线吸收 法 与双缩
脉 显色法 。
了. 紫外与红外线吸收光灌 。
8
. 氨基酸分析。
实验结果
一 、 甘肃当地小扁豆 (干燥种子 )每 1 0 0 9
含蛋白 质 为刊 . 0 8 9 , 当 配 成 l() % 的 乳状
液 , 用 1/ 3饱和度硫酸按盐析后 , 其沉 淀 物
中含 蛋白质为 4 。 9 0 9 , 经反复证明 , 其 中 不
含L C A 。 用 2 / 3饱和度硫酸馁盐析后 , 其 沉
淀物中含蛋 白质 为5 . 6 3 9 , 其中含有 L C A 。
经 D E A E纤维素柱层析可提取 L C A 约为 20 0
m ;
, 其上清液中仍含有蛋 白质 , 其中 L C A
含量甚微 。
二 、 自制的 L C A 与第二军医大学 药 学
系的 L C A (下称标 准 L C A ) , 在 P A G E
(板状和圆盘 ) 中 , 均显示一条 主 要 色 带
(泳动较慢 , 应为 L C H 一 )B 和一条次 要 色
带 (泳动较快 , 应为 L C H 一 A ) , 其图 形两
者完全一致 , 证明产 品达到了 电泳纯度 。 在
S D S 一 P A G E中 , 两者迁移率完全相 同 , 其
分子量均为 15 0 0 0 。
三 、 在 L C A 亲和交叉免疫 电泳 自显 影
中 , _匕述两种产品分离甲胎蛋 白异质体的效
果完全相 同 。 证明其有良好的实用价值 。
四 、 当两种 L C A 的浓度 均为 3 . Om g / m l
时 , 与新鲜的 八型人红细胞悬液 , 其血凝 滴
度为 1 : 2 5 6— 1 : 5 12 , 亦即当 L C A 浓 度 为5 . 86 ~ 1 . 7 2 u g / lm 时 , 即可 与红细 胞 发 生
明显的凝集作用 。 经反复对比 , 两种产品无
明显差异 。
在血凝抑制试验中 , 我们选用葡萄糖 、
蔗糖 、 半乳糖 、 甘露糖作为抑制剂 。 当 L C A为
3 2
.
o u g / m l时 , 甘露糖的抑制浓度为 12 5 0 . 0
u g / m l
, 葡萄糖 、 蔗糖的抑制浓度为 2 5 0 . 0
u g / m l
, 而半乳糖当浓度为 0] 。 o o . O u g / m l时 ,
尚无抑制作用 ,两种产品结果相似 。
五 、 蛋 白质含量测定 : 采用紫外线吸收
法与双缩脉法均可 。 其测定结果与血凝滴度
和亲和 交叉免疫 电泳 自显影的效 果 基 本 相
符 。
两种 L C A的紫外 、 红外线吸收 光 谱 完
全一致 。 氨基酸成份见附表 :
小结与讨论
一 、 L C 八是一种植物糖 蛋白 , 实 为 两
个性质相似的混合物 , 称为 L C H一 八与L C
H一 B , 它能有选择地与某种甲胎蛋 白 异 质
体 ( A F P V a r i a nt S ) 相结合 , 从而用于甲
胎蛋白异质体的分型检测 , 以诊断原发性肝
细胞癌 。
由于 L C A 的主要功能是识别某 些 糖 类
和含糖链的生物大分子 , 因而在细胞生物学
附裹 L C A橄基酸分析给果
氨基 酸名称 自制 L C A标 准 L C人 氨基酸名称 自制 L C A标 准 L C A
天 门冬氨基酸 4 . 84肠
4
.
8 3肠
2
.
6 8肠
3
.
5 1肠
1
.
7 1呱
2
.
5 5肠
0
.
5 5肠
3
.
2 8肠
0
.
1 5肠
4
.
9 2肠
4
.
21肠
2
.
5 3肠
4
.
7 7肠
1
.了5肠
2
.
9 2呱
0
.
21肠
3
.
1 6肠
0
.
7 4肠
异 亮
丙 氨
氨
离 氨
氨
氨
氨
1
.
79 肠
2
.
04肠
0
.
9子呱
3
.
0 3务
3
.
2了肠
0
.
9 5肠
1
.
04肠
1
.
3 3肠
1
.
36肠
39
_
6 8肠
1
.
8 3肠
2
.
2 0肠
1
.
2 6肠
3
.
2 3呱
3
.
5 3肠
0
.
82肠
1
.
5 0肠
1
.
7 3肠
1
.
30肠
41
_
5 3肠
酸氨 计
氮氨ù兑酪苯赖游组精脯总酸氨苏丝谷甘丙肤领蛋
一一一一一 . . . . .` . . . . . . . . . . . . . . . .` ` 口 . . .` 曰 . ~ .一一 ~一一 ` ` ` .` . . .` 困 . . .` .一 ~翻 `
和免疫学研究中具有广 泛的用途和重要的价
值 。
二 、 L C A以往依赖进 口 , 价 格 昂贵 ,
第二军医大学药学系利用国 内资源 , 首先在
国内试制成功 。 我们利用甘肃当地豆科 , 兵
豆属植物 , 兵豆种子亦提取成功 , 而且其性
质和功能基本一致 , 这样 , 就为其制备和应
用开辟了新前景 。
三 、 在大量连续制备 L C A 的 过程中 ,为
了节约试剂 , 简化操作 , 提高效率 ,可将 2邝
饱和度硫酸按盐析后的上清液继续使用 , 同
时在盐析中采用 4 ℃冰箱过夜 , 然后直接分
离 , 减少离心沉淀等操作 。
. 兰 州大学生 物系彭泽祥教授 , 兰州 医学 院药用 植物
教研室进修 生马骥讲师进行植物学鉴定 。
兰州军 区卫生学校生理生化教 研室罗侃主任 、 王 平讲
师进行分子量核 对 。
参考文献
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军医大学学 报 1 9 8 7 ; 8 ( 1 ) : 2 6 -
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。
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早 期诊断价值 . 中华 内科杂志 19 8 ;6 2 5 ( 。 )
2 7 2
。
介 绍 一 种 快 速 血 片 染 色 方 法
军区兰州总 医院检验科
如何准确快速地发出检验报告结果 , 在抢救危
或病人和门诊工作中是 一 个至关重要的问题 。 我科
从 19 70年用快速染色方法处理常规急诊 , 并与瑞氏
染色方法比较 , 证明该法操作简便 、 快速省时 、 染
色效果好 , 尤其适用于门诊实验室 的常规检测 .
配方及方法 :
1
、 配方 : 1液 : 0 . 2呱伊红 乙 醇 掖 ( 无水乙
高亚青 郭士林
醇 ) . 1 液 : 磷酸氢 二钠 ( N a : H P O 一 1 2 H : O )
1 2
.
Gg
、 磷酸二氢 钾 ( K H : P O二 3 H : O ) 6 . 2 5 9 、
天青 I 号 0 . 5 9 、 次甲基蓝 0 . 89 、 蒸馏水 5 00 m l 。
2
、 方法 : 将血膜片吹千后 , 加 I 液数滴 , 约
2 秒种后再加等量 的 亚液 , 染色 1篡秒钟 , 用 水洗去
即 可镜检 , 染色结果与瑞氏法相 同 .