全 文 ：网络出版时间:2012 －3 －27 16:15 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20120327． 1615． 201204． 473_008． html
◇论 著◇
瓜子金皂苷己对 MPP + 诱导 PC12 细胞凋亡的保护作用
吴苗苗1，2，苑玉和1，胡金凤1，楚世峰1，何 鑫1，2，陈乃宏1
(1．天然药物活性物质与功能国家重点实验室中国医学科学院药物研究所，北京 100050;
2．天津中医药大学研究生院，天津 300193)
收稿日期:2011 － 11 － 04，修回日期:2011 － 12 － 28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No U832008，30973887，
90713045，81073130，81072541) ，科技部国际合作项目
(No 2010DFB32900 ) ，国 家 科 技 重 大 专 项 (No
2012ZX09301002-004，2012ZX09103101-006)
作者简介:吴苗苗(1985 －) ，女，硕士生，研究方向:神经药理学和神
经 生 物 学，Tel /Fax:010-63165182，E-mail:miaomiao
2076924@ 126． com;
陈乃宏(1961 －) ，男，研究员，博士生导师，研究方向:神
经系统疾患创新药物开发及作用机制，通讯作者，Tel /
Fax:010-63165177，E-mail:chennh@ imm． ac． cn
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2012． 04． 008
文献标识码:A 文章编号:1001 － 1978(2012)04 － 0473 － 05
中国图书分类号:R284． 1;R329． 25;R745． 7
摘要:目的 观察瓜子金皂苷己(polygalasaponin F，PS-F)对
1-甲 基-4-苯 基-吡 啶 离 子 (1-methyl-4-phenylpyridinium，
MPP +)诱导的 PC12 细胞损伤的影响，并且探讨其作用机
制。方法 MTT法检测细胞存活率，Annexin V /PI染色流式
细胞术检测 PC12 细胞凋亡，JC-1 染色倒置显微镜检测细胞
线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP) ，
Western blot检测 Caspase-3 蛋白的水平。结果 500 μmol·
L －1 MPP +作用 PC12 细胞 48 h，能明显抑制细胞生长(P ＜
0. 01) ，诱导细胞发生凋亡，同时降低 MMP，增加活性
Caspase-3 的蛋白水平。同时给予不同浓度 PS-F 处理，PC12
细胞存活率增加(P ＜ 0. 01) ;凋亡细胞量减少;MMP增高;活
性 Caspase-3 蛋白水平降低(P ＜ 0. 01)。结论 PS-F 能抑制
MPP +诱导的 PC12 细胞的凋亡，其作用机制可能与维持线
粒体正常膜电位，稳定线粒体功能，降低活性 Caspase-3 蛋白
水平有关。
关键词:帕金森病;瓜子金皂苷己;1-甲基-4-苯基-吡啶离
子;PC12 细胞;细胞凋亡;线粒体
帕金森病(Parkinsons diseases，PD)是发生在
中老年期的一种常见的慢性神经退行性疾病［1］，临
床表现为静止性震颤、肌强直和运动迟缓等症状，病
理变化主要为黑质致密区(substantia nigra，SN)多
巴胺能神经元进行性死亡或缺失［2］。目前该病的
发病机制尚不明确，但有研究表明，在 PD 中选择性
多巴胺能神经元损伤与细胞凋亡密切相关［3］。
MPP +(1-methyl-4-pheny1-pyridinium)是一种多巴胺
能神经元毒性剂，被广泛应用于 PD 发病机制和药
效学评价的研究［4］。
瓜子金(Polygala japonica Houtt．)别名金钥匙，
小远志等，为远志科远志属植物，具有祛痰止咳，宁
心安神等功效。瓜子金皂苷己(polygalasaponin F，
PS-F)是瓜子金提取物，为齐墩果烷型三萜皂苷。
体外研究发现，瓜子金皂苷己对 MPP +导致 PC12 细
胞的损伤具有保护作用，本研究初步探讨瓜子金皂
苷己对 MPP +损伤 PC12 细胞保护作用的机制，为其
应用于 PD的临床治疗提供理论依据。
1 材料
1． 1 细胞株 PC12 细胞购自中国医学科学院基础
医学研究所细胞中心，由本实验室传代并保存。
1． 2 试剂 DMEM及马血清(Gibco 公司) ;胎牛血
清(Hyclone公司) ;MPP +、噻唑蓝〔3-(4，5-dimethyh-
hyhhiazol-2-y1 )-2， 5-diphenyhetrazolium bromide，
MTT〕、β-actin 抗体(Sigma 公司) ;Annexin V-FITC
凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司) ，JC-
1 线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天生物技术研究
所) ;BCA蛋白定量试剂盒、ECL 化学发光检测试
剂(北京普利莱基因技术有限公司) ;Caspase-3 抗体
(Cell Signaling Technology) ;HRP标记的羊抗兔 IgG
抗体(Santa Cruz) ;其他试剂为国产或进口分析纯试
剂。
1． 3 仪器 ECL检测系统型号:柯达 EDAS-120;酶
标仪型号:Thermo SKANIT SOFTWARE 3. 2;倒置显
微镜型号:Olympus，IX70-142;流式细胞分析仪:BD
FACS Calibur。
2 方法
2． 1 细胞培养及实验分组 PC12 细胞置于含 5%
胎牛血清、5%马血清的高糖 DMEM 培养基中，在
37℃、5% CO2 的孵育箱中培养，每隔 48 h 换培养
液，当单层培养细胞汇合 80%以后，传代培养。实
·374·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Apr;28(4) :473 ～ 7
验时将 PC12 细胞传入培养板中，待细胞进入对数
生长期进行试验。实验分为空白对照组、MPP +处
理组、MPP + + 瓜子金皂苷己(0. 10、1. 00、10. 00
μmol·L －1)处理组，共 5 组。
2． 2 MTT法检测细胞存活率
2． 2． 1 MPP +损伤细胞模型的建立 PC12 细胞按
5 × 107·L －1浓度接种于 96 孔板中，每孔 100 μl
(5 000个细胞 /孔) ，培养 24 h，加入含有浓度为
100、250、500、750、1 000 μmol·L －1 MPP +的培养基
处理，每组设 6 个复孔，继续培养 48 h，MTT 法检测
细胞存活率。
2． 2． 2 PS-F 对 MPP +损伤细胞存活率的影响 细
胞接种于 96 孔板，24 h 后，按组别分别给予相应处
理，每组设 6 个复孔，继续培养 48 h，MTT 法检测细
胞存活率。
2． 2． 3 MTT 法检测 每孔加入 10 μl MTT，37℃、
5% CO2 的孵育箱中孵育 4 h，弃培养基，每孔加入
100 μl DMSO，震荡至晶体颗粒溶解，10 min 后在酶
标仪上测定 570 nm 处的吸光度(A)值。细胞存活
率 /% = (实验组平均 A 值 /对照组平均 A 值)×
100%。
2． 3 Annexin V /PI染色流式细胞术检测细胞凋亡
用 0. 25%的胰酶消化细胞，悬浮于无血清 DMEM
中，4℃、1 500 r·min －1离心 5 min，预冷的 PBS 洗 1
次，细胞重悬于 200 μl Binding Buffer，加入 10 μl
Annexin V-FITC室温避光反应 15 min，加入 5 μl PI
和 300 μl Binding Buffer，室温反应 5 min 后上机检
测。
2． 4 JC-1 染色检测细胞线粒体膜电位 37℃无血
清的 DMEM洗涤细胞 1 次，每孔加入 1. 5 ml的 JC-1
(5 mg·L －1) ，37℃、5% CO2 培养箱孵育 20 min，
DMEM洗 2 次，倒置荧光显微镜下观察。
2． 5 Western blot检测蛋白表达 收集细胞，预冷
PBS 洗两遍，加入细胞裂解液(1% Nonidet P-40，
150 mmol·L －1 NaCl，50 mmol·L －1 Tris，pH 7. 4，
1 mmol·L －1 EDTA 和蛋白酶抑制剂) ，置于冰上裂
解 30 min后，4℃，12 000 r·min －1离心 30 min。取
上清，BCA 试剂盒蛋白定量，细胞总蛋白加入上样
缓冲液煮沸变性。20 μg蛋白经 10% SDS-PAGE 胶
分离后转移到 PVDF 膜，3% BSA 室温封闭 2 h，加
入一抗 4℃过夜，TBS-Tween 洗膜后加 HRP 标记的
二抗，室温孵育 2 h，加入 ECL发光液，进行检测。
2． 6 统计学分析 数据以 珋x ± s 表示，采用 SPSS
13. 0 统计分析软件进行统计分析。
3 结果
3． 1 MPP +损伤 PC12 细胞模型的建立 MTT 检
测结果(Fig 1)显示，正常 PC12 细胞给予不同浓度
MPP + 48 h后，细胞存活率随药物浓度的增加而剂
量依赖性降低。当 MPP +浓度在 500 μmol·L －1时，
细胞存活率基本维持在 60%左右。为使细胞处于
损伤状态又不致使细胞过度死亡，选择 500 μmol·
L －1作为后续实验浓度。
Fig 1 The toxic effect of MPP + on PC12 cells(珋x ± s，n = 6)
PC12 cells were treated with various concentrations of MPP + for 48
h and measured for viability by MTT assay． ##P ＜ 0. 01 vs control
3． 2 PS-F增加MPP +损伤 PC12 细胞的存活率
MTT结果(Fig 2)显示，500 μmol·L －1 MPP +导致
PC12 细胞存活率下降，同时给予不同浓度瓜子金皂
苷己可增加细胞存活率，在 0. 10、1. 00、10. 00 μmol·
L －1范围内具有浓度依赖性，其中 1. 00 和 10. 00 μmol
·L －1浓度组与 MPP +处理组比较差异有显著性。
Fig 2 The protective effect of PS-F
on PC12 cells from MPP + -induced cell death(珋x ± s，n = 6)
PC12 cells were exposed to different concentrations(0. 10，1. 00 and
10. 00 μmol·L －1)of PS-F and MPP +(500 μmol·L －1)for 48 h，the
cell viability was evaluated by MTT assay． ##P ＜ 0. 01 vs control，＊＊P ＜
0. 01 vs model
·474· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Apr;28(4)
3． 3 PS-F抑制MPP +诱导 PC12 细胞凋亡 采用
Annexin V /PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡的变
化，研究瓜子金皂苷己对 MPP +诱导 PC12 细胞凋亡
的影响。结果(Fig 3)显示的是细胞凋亡分析的二
维散点图，其中左下象限显示活细胞，为 FITC －1 /
PI － 1;右下象限是早期凋亡细胞，为 FITC +1 /PI － 1;右
上象限是晚期凋亡或坏死细胞，为 FITC +1 /PI + 1;左
上象限为死亡细胞，为 FITC －1 /PI + 1。由图可见，在
检测过程中正常 PC12 细胞有少量的损伤凋亡。经
MPP +处理后早期凋亡是其受损的主要形式，细胞
凋亡率由空白组的 2. 68%增加到 54. 81%。在造模
同时加入 PS-F能减少细胞早期凋亡率，0. 10、1. 00、
10. 00 μmol · L －1 浓度组早期凋亡率分别为
39. 04%、33. 43%、29. 73%，呈剂量依赖性降低，从
而使活细胞比例增加。表明实验浓度的 PS-F 能在
一定程度上抑制 MPP +诱导细胞发生早期凋亡，保
护 PC12 细胞免受损伤。
3． 4 PS-F抑制MPP +诱导 PC12 细胞线粒体膜电
位降低 结果(Fig 4)显示，正常 PC12 细胞呈均匀
的强红色荧光，表示线粒体膜电位正常，仅有(5. 51
±1． 84)%的细胞线粒体膜电位降低;经 MPP +处理
后，红色荧光强度减弱，绿色荧光增强，线粒体受损，
有(76. 71 ± 4. 31)%细胞线粒体膜电位降低;造模
同时加入 0. 10、1. 00、10. 00 μmol·L －1浓度的 PS-
F，红色荧光逐渐增强，绿色荧光减弱，能够抑制线
粒体膜电位降低，分别为(55. 19 ± 2. 84)%、(36. 75
± 1. 47)%、(23. 61 ± 2. 23)%，表明实验浓度的 PS-
F能浓度依赖性的抑制 MPP +损伤线粒体膜电位的
降低，维持线粒体稳定。
3． 5 PS-F 降低 MPP +诱导 PC12 细胞 Caspase-3
蛋白表达 Caspase-3 是细胞凋亡发生的重要执行
蛋白之一，在正常细胞主要以其前体 procaspase-3
的形式存在无酶活性，细胞发生凋亡后形成有活性
的 Caspase-3，其分子量为 17 ku。Western blot 结果
(Fig 5)显示，在正常细胞中没有活性 Caspase-3 的
表达，经 MPP +损伤后 Caspase-3 的表达明显升高，
而不同浓度 PS-F 组能浓度依赖性的降低活化
Caspase-3 的表达。结果表明 PS-F 对抗 MPP +诱导
的凋亡与调节凋亡相关蛋白的表达有关。
4 讨论
PD是一种由多巴胺能神经元选择性丢失引发
的运动功能障碍性疾病。其发病机制尚未明确，越
来越多的研究表明选择性多巴胺能神经元损伤及神
经元凋亡与 PD的发生密切相关［5 － 7］。凋亡是细胞
程序性死亡的一种形式，在凋亡过程中，细胞体积缩
小，细胞质密度增加，线粒体功能改变，核破碎等。
Fig 3 The protective effect of PS-F on PC12 cells from MPP + -induced cell apoptosis
Flow cytometric dotp-plots(Annexin V-FITC /PI)of PC12 cells treated with or without MPP + for 48 hours． A:Control;B:Model(500 μmol·L －1
MPP +) ;C:MPP +(500 μmol·L －1)+ PS-F(0. 10 μmol·L －1) ;D:MPP + (500 μmol·L －1)+ PS-F(1. 00 μmol·L －1) ;E:MPP + (500 μmol·
L －1)+ PS-F(10. 00 μmol·L －1)
·574·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Apr;28(4)
Fig 4 The protective effect of PS-F
on MMP of PC12 cells injured by MPP +(n = 6)
MMP was assessed by JC-1 staining． The histogram showed the rela-
tive ratio of normal and depolarized MMP in total cells of the group． A:
Control;B:Model(500 μmol· L －1 MPP + ) ;C:MPP + (500 μmol·
L －1)+ PS-F (0. 10 μmol·L －1) ;D:MPP +(500 μmol·L －1)+ PS-F
(1. 00 μmol·L －1) ;E:MPP +(500 μmol·L －1)+ PS-F (10. 00 μmol
·L －1)．
线粒体作为细胞能量合成、贮存、转化及物质代谢的
重要场所，在细胞凋亡过程中会产生一系列的变化:
线粒体膜通透性增加，跨膜电位消失，释放 Caspase
激活因子(如细胞色素 C)等，在细胞凋亡进程中起
枢纽作用［8］。Caspase 是近年来发现的一组存在于
胞质中的半胱氨酸蛋白水解酶，能够特异的水解天
冬氨酸残基后的肽键，导致细胞凋亡［9］。在细胞
中，Caspase均以无活性的酶原状态存在，可由线粒
体释放的细胞色素 C 介导激活。Caspase 蛋白家族
一旦被激活后便不可逆的启动细胞死亡程序［10］。
PC12 细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞克隆
的细胞株，它能表达酪氨酸羟化酶并合成多巴胺，因
此也常用来作为研究多巴胺能神经元的有利工具。
MPP + 是MPTP在体内的活性代谢产物，能够选择
Fig 5 Effects of PS-F on active caspase-3
expression in PC12 cells induced by MPP +(n = 3)
A:Representative Western blot of active caspase-3 and β-actin;B:
Quantitative analysis of the expression of caspase-3． ## P ＜ 0. 01 vs con-
trol;＊＊P ＜ 0. 01 vs model
性的抑制线粒体传递链复合物 I［4，11］，改变线粒体外
膜通透性，导致细胞质内细胞色素 C 的含量增加，
促进凋亡蛋白(包括 Caspase-3)的表达［12］。线粒体
膜电位(MMP)下降是早期细胞凋亡过程中不可逆
的变化［13］。JC-1 是一种特异性阳性染料，在 MMP
较高时，以聚合物形式聚集在线粒体的基质中;
MMP较低时，JC-1 以单体形式存在于线粒体的胞质
中。在 490 nm波长下可以激发单体产生绿色荧光，
聚集体产生红色荧光，据此可判断 MMP 的变化。
荧光显微镜观察 MPP +处理后细胞 MMP明显下降，
而 PS-F可明显提高 MMP。此结果与 Annexin V / PI
双染流式细胞术检测的结果一致。Caspase-3 作为
细胞发生凋亡的重要执行蛋白之一，是 PD 患者与
动物模型脑中黑质多巴胺能神经元凋亡的易感因子
和最终效应器［14］。本研究表明，MPP +作用于 PC12
细胞后，Caspase-3 激活率增加，同时给予 PS-F能浓
度依赖性抑制 Caspase-3 的激活，以 10. 00 μmol·
L －1浓度时最为明显。提示 PS-F 能够对抗 MPP +诱
导 PC12 细胞凋亡，并在许多观察指标上具有量效
关系。
综上所述，瓜子金皂苷己可能是通过维持线粒
体功能，抑制 Caspase-3 激活，来实现对 MPP +诱导
·674· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Apr;28(4)
PC12 细胞凋亡的保护作用。
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The protective effect of polygalasaponin F
against MPP + induced PC12 cellular apoptosis
WU Miao-miao1，2，YUAN Yu-he1，HU Jin-feng1，CHU Shi-feng1，HE Xin1，2，CHEN Nai-hong1
(1． State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines，Institute
of Materia Medica ，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China;
2． Graduate School，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China)
Abstract:Aim To observe the effects and mechanism
of polygalasaponin F(PS-F)on PC12 cellular apopto-
sis induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium ion
(MPP +)． Methods MTT assay was used to measure
the viability of the PC12 cells and flow cytometry was
used to analyze the apoptotic rate of PC12 cells． The
expression of active Caspase-3 in PC12 cells was detec-
ted by Western blot． In addition， the mitochondrial
membrane potential was determined by JC-1 staining
inverted microscope． Results When exposed to 500
μmol·L －1 MPP + for 48 h，the viability and the mito-
chondrial membrane potential of PC12 cells decreased
significantly，and the apoptosis rate and the expression
of active Caspase-3 were increased significantly． Treat-
ment with PS-F，the cell viability(P ＜ 0. 01)and the
MMP were significantly increased，the apoptosis rate
and the expression of active Caspase-3 (P ＜ 0. 01)
were significantly decreased compared with MPP +
group． Conclusion PS-F protects PC12 cells against
apoptosis induced by MPP + and the mechanism may be
related to ameliorate the mitochondrial dysfunction and
decrease the expression of active Caspase-3．
Key words:Parkinsons diseases;polygalasaponin F;
1-methyl-4-pheny1-pyridinium; PC12 cells;cellular
apoptpsis;mitochondrion
·774·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Apr;28(4)