全 文 ：应用与环境生物学报　 2005, 11(2):215～ 217 　 　
Chin J A pp lEnviron B io l=ISSN 1006-687X 　 2005-04-25
　一株降解除草剂膦化麦黄桐(PPT)菌的筛选与鉴定*
匡小婴　饶志明**　沈 微　赵有玺　方惠英　诸葛健**
(江南大学工业微生物中心和工业生物技术教育部重点实验室　江苏无锡　214036)
摘　要　从喷洒有除草剂的土壤中分离到一株能分解膦化麦黄桐(PPT)的细菌. 该菌在以 PPT为唯一碳源的培养基
上生长 ,能利用 PPT的最高浓度为 2. 7 g /L.采用常规生理生化鉴定方法 , 并结合 16S rDNA序列分析法对该菌进行鉴
定.结果表明 , 该菌与生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)序列相似性为 99. 3%,在细菌分类学上属于肠杆菌. 将它
命名为 En terobacter sp. PPT. 图 4表 2参 7
关键词　膦化麦黄桐;生物降解菌;分离筛选;16S rDNA
CLC　X172
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF A BACTERIAL STRAIN
FOR DEGRADING L -PHOSPHIOTHRICIN
*
KUANG X iaoy ing, RAO Zhim ing** , SHEN W ei, ZHAO Youxi, FANG Huiy ing＆ ZHUGE Jian**
(Resea rch Cen tre of Industria lM icroorganism s andKey Lab of Industria lB iotechnology,
M in istry of Education, Sou thern Yang tzeU niversity, Wuxi　 214036, Jiangsu, C h ina)
Abstract　One bac te rial strain degrad ing L - phosph io th ricin(PPT) w as iso la ted from so il sprayed w ith herb ic ide. The stra in
cou ld grow on m ed ium containing PPT as so le ca rbon source and resist PPT w ith concentration up to 2. 7 g /L. In addition to
g eneral phy sio log ical and biochem ica l properties, the stra in w as identified by 16S rDNA sequence and sy stema tic ana ly sis. The
results show ed tha t 16S rDNA sequence o f the stra in had sim ilarity o f 99. 3% w ith tha t o fEnterobacter cancerogenus, suggesting
that the strain be long toEn terobacter. The stra in w as nom inated as Enterobacter sp. PPT. F ig 4, Tab 2, Re f 7
Keywords　L - phosphiothricin;biodegrad ing bac te rium; isola ting and screening;16S rDNA
CLC　X172
　　随着在农业生产中的广泛使用 ,除草剂已逐渐成为农药污
染的主要来源之一. 膦化麦黄桐(L - pho sphio thric in, PPT)是一
种主要通过破坏氨基酸合成代谢途径杀死杂草的活性成分 ,而
Bia laphos(双丙氨膦)和 G lufo sina te(草丁膦)是具有 PPT活性
的除草剂. 由于它们具有溶解性好 、输导型灭生性和杀草谱广
的特点 , 对植物的地上和地下部分均有枯杀作用 , 因此广泛地
应用于耕地 、果园 、蔬菜等的杂草防除 [ 1] .
已有研究表明 , 在长期受高浓度 PPT污染的土壤中存在
多种分解 PPT菌株 , 如果从中筛选具有高强度降解 PPT活性
的菌株 , 将为研究细菌降解 PPT的机理打下基础 , 也能为环境
治理和环境微生物资源开发等方面做出积极的贡献 [ 2] . 本研
究从污染土壤中分离纯化获得一株具有高活性降解 PPT活性
的菌株 , 在应用常规生理生化方法鉴定的基础上 , 结合 16S rD-
NA序列分析 , 确定了其在系统分类学上的地位.
1　材料与方法
1. 1　材 料
1. 1. 1　样 品　　采自无锡农村使用除草剂膦化麦黄桐 (L -
phosphiothricin, PPT)的农田土壤.
收稿日期:2004-05-08　　接受日期:2004-06-29
*国家自然科学基金(No. 30300027)资助　Supported by the N ation al
Natural S cien ce Foundation ofC h ina
**通讯作者　C orrespond ing au thor
1. 1. 2　培养基　　无机盐培养基 [ 3] (含有相应浓度 PPT的无
机盐固体培养基 ):K2HPO4 7H2O 1. 6 g, KH2 PO4 0. 4 g, M g-
SO 4 0. 06 g, FeSO4 0. 003 g, C aC l2 0. 001 g, CuSO4 0. 05 m g, Zn-
SO 4 0. 05 mg, HBO 3 0. 03 mg, NH4C l 1. 0 g,琼脂 15 ～ 20 g;蒸馏
水定容至 1 L.
1. 2　方 法
1. 2. 1　耐农药 PPT菌株的筛选　　取适量土样接入 LB液体
培养基中 , 于 28 ℃摇床培养 24 h, 将有生长迹象的样品稀释 ,
分别接种到 PPT浓度分别为 0 g /L、0. 5 g /L、1 g /L、 1. 5 g /L、
2. 0 g /L、2. 7 g /L和 3. 5 g /L的无机盐培养基上 , 培养 72 h.稀
释菌液涂布在含 PPT的无机盐平板上 , 挑取典型单菌落转接
含 PPT的无机盐培养基斜面.
1. 2. 2　细菌生长测定　　以波长 600 nm处的浊度表示.
1. 3　菌株的鉴定
1. 3. 1　菌株形态学 、生理生化特征　　根据《常见细菌系统
鉴定手册》[ 4]所列菌种鉴定方法进行菌种鉴定.
1. 3. 2　基因组 DNA的提取　　采用 SDS -蛋白酶 K裂解 ,十
六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)沉淀细菌碎片和多糖 ,再用异
丙醇沉淀提取总 DNA [ 5] .
1. 3. 3　16S rDNA的扩增　　使用细菌 16S rDNA的通用引物
F27 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3′)和 R1522 (5′-
TTATCCTAGTTTGCGCGCTA -3′)进行 PCR扩增 [ 6] .
1. 3. 4　PCR扩增条件　　反应体系:取 DNA模板 1 μL, 10 ×
PCR缓冲液 2μL,引物 2μL, dNTPs 2 μL, Taq DNA聚合酶 0. 5
μL, 总反应体积为 20 μL.循环参数:94 ℃预变性 5 m in;94 ℃
45 s, 56 ℃ 90 s, 72℃ 90 s, 35个循环 , 72 ℃延伸 10 s. 扩增产
物 10μL用 1. 2%琼脂糖凝胶电泳 ,溴化乙锭染色 , 紫外灯下
观测结果.
1. 3. 5　PCR产物的克隆与 16S rDNA序列测定及同源性比较 、
系统分析　　用胶回收试剂盒纯化 PCR扩增产物 , 电泳验证.
再连接到 pGEM - Teasy载体上 , 转化感受态 E. coli DH10B宿
主菌. 最后经蓝白斑筛选 , 获得阳性克隆. 16S rDNA测序由上
海华诺生物科技有限公司完成 , 将测序结果输入 NCBI中用
B last程序交送 GenBank库与数据库已有序列进行比较分析.
应用 CLUSTAL X (ve rsion 1. 8)软件进行同源性分析 ,用 T ree-
v iew软件构建进化树.
2　结 果
2. 1　菌种的分离
从以 PPT (2. 7 g /L)为唯一碳源的基本培养基中筛选出
几株降解菌 , 经复筛数次得到 1株能利用 PPT为唯一碳 、氮源
生长较好的降解菌.
2. 1. 2　不同浓度 PPT对菌株细胞及降解 PPT能力的影响
以 10%的接种量将菌株接种到以 PPT为唯一碳 、氮源的无机盐
培养基中 (含有不同 PPT浓度), 28℃, 150 r /m in摇床培养. 测
定细菌的生长和对 PPT的降解情况.在 1. 5 g /L的 PPT浓度下 ,
细胞不断地降解 PPT作为自身生长的碳源和氮源, 使得菌体不
断能够生长, 72 h时达到最大生长量 (图 1).当 PPT的浓度增
加时 ,菌体量先增加后下降 , 当 PPT浓度达到 1. 5 g /L时 ,菌体
达到最大生长量 (图 2);而当 PPT浓度达 3 g /L时 ,细胞基本不
能生长 ,表明过高浓度的 PPT对细胞产生毒害作用.
图 1　培养时间对细胞生长的影响
Fig. 1　E f fect of various cu ltu re t im es on the s train grow th
图 2　不同 PPT浓度对菌体生长的影响
Fig. 2　E ffect of variou s concen trations ofPPT on the strain grow th
2. 2　菌种的生理生化鉴定
2. 2. 1　形态学 、生理生化特征　　样品经富集 、初筛 、复筛 、纯
化得 1株降解菌. 该菌在 LB培养基上培养 24 h后的菌落为乳
白色 , 菌落圆形 ,隆起 , 外型光滑 , 不透明 , 边缘整齐 , 细胞短杆
形 , 革兰氏阴性. 培养在 LB培养基中细菌形态 (图 3). 由于
16S rDNA序列分析表明 ,该菌株与 Enterobacter cancerogenus具
有最高的序列相似性为 99. 3% (见本文的 2. 3部分). 因此 ,
我们将该菌株与 En terobacter cancerogenus进行了常规生理生
化特征比较 (表 1). 结果表明 , 该菌株为好氧菌 , 具有氧化葡
萄糖 、产酸产气和氧化酶阴性等特征.根据生理生化特征初步
判断它为肠杆菌科 , 且根据它分解利用 PPT的特性暂命名为
Enterobacter sp. PPT.
图 3　菌株 En teroba cter sp. PPT的扫描电镜照片 (×22 500)
Fig. 3　E lectronm icrograph s ofEn terobacter sp. PPT (×22 500)
表 1　菌株 Enterobacter sp. PPT与 E. cancerogenus的生理生化鉴定比较
Table 1　Physio log ical and b io chem ica l com pa rison between Enterobacter sp. PPT and E. cancerogenus
菌株 St rains En terobacter sp. PPT　　　　E. cancerogenus 菌株 S trains En terobacter sp. PPT　　　　E. cancerogenus
革兰氏染色 G ram stain ing - - D -纤维二糖 D - cellob iose + +可溶性淀粉 Solub le starch - - 葡萄糖氧化发酵试验 Glucose fermen tation experim ent + +
蔗糖 Sucrose + + 需氧性试验 Aerob ic test + +
D -树胶醛糖 D - gum aldose - + H 2 S + -山梨糖 Sorb inose - - V. P + +乳糖 Lactose + + 甲基红 M ethy l red - -
葡萄糖 G lu cose + + 吲哚 Indo le - -密三糖 Raff inose + + 反硝化 An ti- n itration - +
鼠李糖 Rham nose + + 精氨酸双水解酶 A rgin in dihyd rolase - -覃糖 a, a T rehalose d ihyd rate + + 过氧化氢酶 C ata lase + +
D -木糖 D - xy lose + + 发酵产酸 Producing acid s + +甘露糖 m annose + + 产气 Produce gas + +
D -果糖 D - fru ctose + + 氧化酶 Oxidase - -明胶 G lu tin - - 运动性 M ob ility + +
甘露醇 M ann itol + + 脲酶 U rease - -
D -半乳糖 D - galactose + + 黄色素 Yellow p igm en t - -
　　+:阳性 Posi tive; -:阴性 Negative
216 　　　　　　　　应 用与 环 境生 物学 报　　Chin J App lEnviron B io l　　　　　　　　　　　　　　 　　　11卷
2. 3　菌株 Enterobacter sp. PPT 16S rDNA序列分析及
分子鉴定
以 Enterobacter sp. PPT的基因组 DNA为模板 , 用细菌 16S
rDNA特异引物 F27和 R1522进行 PCR扩增 , 得到约 1. 5 kb的
PCR产物 ,产物片段经纯化插入 pGEM - Tea sy载体中. 将扩增
产物进行测序 (由上海华诺生物科技有限公司完成), 该序列
在 GenBank数据库中登录号为:AY596467. 将该菌的 16S rDNA
基因序列与 GenBank数据库中已发表 、并被承认的 9条序列进
行了核酸同源性比对.表 2列出了相似序列的登录号 、菌株名
称及相似性. 与这 9条相似性较高序列的系统发育树如图 4所
示 , 从系统进化树可以看出与该序列相似性达 99. 25%的是 E.
cancerogenus,表明它与 E. cancerogenus亲缘性最近.
表 2　相似序列的登录号 、菌株名称及相似性
Tab le 2　Accession num ber and sim ila rity o f sim ilar sequence
S train s Accession num ber S im ilarity
E. cancerogenu s Z96078 99. 25%
K lebsiella pneumon ia e X87276 98. 64%
E. d isso lvens Z96079 98. 77%
S erratiam arcescen s AF124038 98. 03%
B uttiauxella agrest is AJ233400 97. 96%
Raou ltella plan tico la AF181574 98. 09%
B uttiauxella iza rd ii AJ233404 97. 82%
E. n im ipressura lis Z96077 97. 95%
B uttiauxella brenn erae AJ233401 97. 62%
图 4　菌株 En teroba cter sp. PPT的 16S rDNA基因系统发育进化树
Fig. 4　Phylogenetic trees for 16S rDNA sequen ce ofEn teroba cter sp. PPT
3　讨 论
已有研究表明 ,许多微生物能降解除草剂 , 包括假单胞菌
属 、芽孢杆菌属 、不动杆菌属 、产碱菌属和农杆菌等 [ 8] , 但尚未
发现肠杆菌属降解除草剂的报道.本研究从喷洒有除草剂的土
壤中成功分离纯化到了一株具有高强度降解 PPT活性的菌
株 , 该菌在以除草剂 PPT为唯一碳源的培养基上生长 , 能利用
PPT的最高浓度为 2. 7 g /L, 从而为下一步研究该菌株降解除
草剂的机理奠定了基础. 常规生理生化鉴定方法表明 , 该菌株
为好氧菌 , 具有氧化葡萄糖 、产酸产气和氧化酶阴性等特征 ,属
于肠道菌属. 进一步用 16S rDNA序列分析法鉴定发现 ,该菌株
与肠道菌属中 E. cancerogenus的 16S rDNA基因序列同源性高
达 99. 25%. 该结果与常规生理生化鉴定结果相吻合 ,说明 16S
rDNA序列分析法确实能够很好地应用于微生物的菌种鉴定.
将该菌株命名为 Enterobacter sp. PPT,据了解 , 这也是第 1例关
于肠杆菌属降解除草剂的报道. 目前对该菌株降解 PPT的机
理及其安全性方面的研究正在进行之中.
致 谢　感谢张永光博士对菌株 Enterobacter. sp PPT的 16S rD-
NA基因系统发育进化分析提供的帮助.
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