全 文 ：醋炙对甘遂 3 种三萜类成分的影响及肠上皮细胞的毒性
王文晓， 杨艳菁， 曹亮亮， 张 丽* ， 丁安伟
(南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 /中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联
合工程研究中心，江苏 南京 210023)
收稿日期:2014-07-24
基金项目:国家自然科学基金项目 (30973940，81373972) ;国家重点基础研究发展计划 (973)项目 (2011CB505300，
2011CB505303) ;江苏省“六大人才高峰”项目 (2010 年度) ;江苏省政府留学奖学金项目 (JS-2009-061) ;江苏高校优势学科建设工程资
助项目 (ysxk-2014)
作者简介:王文晓，硕士生。Tel:18252066631，E-mail:zwangwenxiao@ 163． com
* 通信作者:张 丽，教授，从事中药炮制与质量控制研究，Tel: (025)85811519，E-mail:zhangliguanxiong@ 163． com
摘要:目的 研究甘遂醋炙前后 3 种三萜类成分 (大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol)含有量变化及其对肠
上皮细胞的毒性。方法 采用 HPLC法分别在 210、255、270 nm测定甘遂和醋甘遂饮片中该 3 种成分的量。采用MTT
法检测 3 种成分对大鼠小肠隐窝上皮细胞 IEC-6 细胞增殖的影响。结果 醋炙后大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-
kansenonol含有量均降低，降低率分别为 13. 43%、15. 15%、14. 79%。对 IEC-6 细胞的 IC50分别为 71. 41、15. 27 和
14. 53 μmol /L。结论 甘遂醋炙后 3 种三萜类成分含有量的降低与醋炙减毒有一定的相关性。
关键词:甘遂;醋炙;IEC-6;大戟二烯醇;kansenone;11-oxo-kansenonol
中图分类号:Ｒ283 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)05-1045-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 05. 026
Triterpenes change of processing Kansui Ｒadix with vinegar and their toxicity to
intestinal epithelial cells
WANG Wen-xiao， YANG Yan-jing， CAO Liang-liang， ZHANG Li* ， DING An-wei
(Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Ｒesources Industrialization，and National and Local Collaborative Engineering Center of Chi-
nese Medicinal Ｒesources Industrialization and Formulae Innovative Medicine，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China)
ABSTＲACT:AIM To study the content changes of euphol，kansenone and 11-oxo-kansenonol from Kansui Ｒa-
dix before and after processing with vinegar and their toxicity to intestinal epithelial cells． METHODS The assay
of triterpenes in processing Kansui Ｒadix with vinegar was measured at 210 nm，255 nm and 270 nm by HPLC，re-
spectively． The MTT assay was employed to examine the growth inhibition of IEC-6 cells which were pretreated with
these triterpenes． ＲESULTS The contents of the three kinds of triterpenes decreased during the processing，and
the reduction rates were 13. 43%，15. 15%，and 14. 79%，respectively． The IC50 values of IEC-6 cells were
71. 41，15. 27，and 14. 53 μmol /L，respectively，after being pretreated with triterpenes． CONCLUSION The
experimental data indicate that there is a certain correlation between the reduction in the three kinds of triterpenes’
contents and the attenuation during processing with vinegar．
KEY WOＲDS:Kansui Ｒadix;processing with vinegar;IEC-6;euphol;kansenone;11-oxo-kansenonol
甘遂为大戟科大戟属植物甘遂 Euphorbia kansui
T． N． Liou ex T． P． Wang的干燥块根，味苦，性
寒，有毒，素有峻下逐水圣药之称［1］。但甘遂强
烈的皮肤刺激性，严重的肝脏、胃肠道毒性以及促
炎、诱发肿瘤等毒性［2］，严重制约了其临床的安
全应用。历代中医采用醋制法降低甘遂的毒性和刺
激性，缓和其泻下作用。研究表明，甘遂的毒性成
分主要集中在石油醚和乙酸乙酯部位中的二萜与三
萜类成分［3-4］。然而既往甘遂醋炙减毒的物质基础
报道多集中在甘遂中二萜类成分毒性方面，较少涉
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及甘遂中三萜类化合物的毒性以及与醋炙减毒相关
性的研究［5-7］。因此，本实验拟以大鼠小肠隐窝上
皮细胞 (IEC-6)为研究对象，探讨甘遂中大戟二
烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol 这 3 种三萜类
成分对肠上皮细胞的毒性并比较醋炙前后该 3 种成
分的含有量变化，为进一步阐明甘遂醋炙减毒的物
质基础提供依据。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 Waters 2695 高效液相色谱仪 (美国
Waters公司)、Waters 2996 PDA 检测器、BP211D
型电子天平 (精确到 0. 01 mg)、SW-CJ-1FD 超净
工作台 (苏州净化设备有限公司)、CO2 恒温培养
箱 (日本 SANYO公司)、倒置显微镜 (日本 Olym-
pus公司)、powerwave X340 全波长酶标仪 (美国
Bio-Tek公司)。
1. 2 试剂 甲醇 (色谱纯，江苏汉邦科技有限公
司)，乙腈 (色谱纯，美国 Tedia公司) ，水为重蒸
水，DMEM高糖培养基干粉 (Gibco，赛默飞世尔
科技有限公司) ，胎牛血清 (维森特生物技术有限
公司，批号 085-150)，磷酸缓冲盐 (PBS，博士微
生物工程有限公司，批号 AＲ0030) ，胰蛋白酶
(韩国 Bio-sharp公司，批号 27250-018) ，MTT (北
京索莱宝科技有限公司，批号 M8180)。
1. 3 实验材料
1. 3. 1 药材 甘遂药材购自陕西宝鸡赤沙乡，经
南京中医药大学王春根教授鉴定为大戟科 Euphor-
biaceae植物甘遂 Euphorbia kansui T． N． Liou ex T．
P． Wang的干燥块根，批号 20131008。取生甘遂，
大小分档，除去杂质，即为甘遂生品。取净甘遂，
照《中国药典》2010 年版一部醋炙法 (附录Ⅱ
D)加醋拌匀，闷透，待醋被吸尽后，将炒锅加热
到 260 ℃左右，不断翻炒，9 min 后出锅，放凉，
即为甘遂醋炙品。每 100 kg 甘遂用醋 30 kg。颜色
加深，略有焦斑。
1. 3. 2 对照品 大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-
kansenonol为实验室自制，经 HPLC 法检测，纯度
均大于 98%。化学结构见图 1。
1. 3. 3 细胞 大鼠小肠隐窝上皮细胞株 IEC-6
(购自 ATCC细胞库)。
2 方法与结果
2. 1 甘遂醋炙前后三萜类成分变化
2. 1. 1 供试品溶液的制备 分别称取生甘遂、醋
甘遂粉末 (过 4 号筛)各 0. 2 g，精密称定，置于
具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 10 mL，密塞，称定
A． 大戟二烯醇 B． kansenone C． 11-oxo-kansenonol
A． euphol B． kansenone C． 11-oxo-kansenonol
图 1 成分化学结构
Fig. 1 Structure of compounds
质量，超声提取 (功率 250 W，频率 50 kHz)30
min，放冷，密塞再称定质量，用甲醇补足减少的
质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2. 1. 2 对照品溶液的制备 精密称取大戟二烯醇、
kansenone、11-oxo-kansenonol对照品适量，加甲醇
制成分别为 1. 082、0. 894、1. 100 mg /mL 的对照
品贮备液。取各对照品贮备液适量，制成含大戟二
烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol分别为 259. 6、
14. 31、13. 20 μg /mL的 1 号混合对照品溶液。
2. 1. 3 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱
(4. 6 mm × 150 mm，5 μm) ;流动相为水 (A)-
乙腈 (B)，梯度洗脱 (0 ～ 13 min，50% ～ 20%
A;13 ～ 19 min，20% ～ 15% A;19 ～ 22 min，
15% ～10% A;22 ～ 30 min，10% A;30 ～ 35 min，
10% ～50% A)。体积流量 1. 0 mL /min;检测波长
210 nm (大戟二烯醇)、255 nm (kansenone)、270
nm (11-oxo-kansenonol);柱温 30 ℃;进样量 20
μL。此条件下样品中大戟二烯醇、kansenone、11-
oxo-kansenonol 与其他成分可达到基线分离。见
图 2。
2. 1. 4 方法学考察
2. 1. 4. 1 线性关系考察 精密量取 1 号混合对照
品溶液 5 mL 置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇
匀，得 2 号混合对照品溶液，同法，采用逐步稀释
法，分别制得 3 ～ 6 号混合对照品溶液。按
“2. 1. 3”项下色谱条件，精密吸取上述各对照品
溶液 20 μL注入高效液相色谱仪，每份溶液平行进
样 2 次。按标准曲线法以峰面积计算，以各对照品
峰面积平均值为纵坐标 (Y)，对照品质量浓度
(μg /mL)为横坐标 (X) ，绘制标准曲线，得各成
分回归方程为:大戟二烯醇 Y = 231 828. 110X －
611 120. 995 0 (r = 0. 999 3); kansenone Y =
13 397. 678X + 714. 039 8 (r = 0. 999 6) ;11-oxo-
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A． 对照品 B． 生甘遂 C． 醋甘遂 1． 大戟二烯醇 (210 nm) 2． kansenone (255 nm) 3. 11-oxo-kansenonol (270 nm)
A． referonce substances B． Kansui Ｒadix C． Kansui Ｒadix processing with vinegar 1． euphol (210 nm) 2． kansenone (255 nm)
3. 11-oxo-kansenonol (270 nm)
图 2 甘遂醋炙前后 HPLC图
Fig. 2 HPLC chromatograms of Kansui Ｒadix before and after beging processed with vinegar
kansenonol Y = 4 444. 400 X + 251. 422 9 (r =
0. 999 6)。表明大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-
kansenonol 的进样量分别在 0. 162 ～ 5. 192 μg，
0. 009 ～ 0. 282 μg，0. 008 3 ～ 0. 264 μg 之间呈良好
的线性关系。
2. 1. 4. 2 精密度试验 在上述色谱条件下，以 4 号
混合对照品溶液为考察对象，依法测定，连续进样
6次，得大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol
峰面积的 ＲSD分别为 0. 8%、1. 0%、1. 1%。
2. 1. 4. 3 重复性试验 精密称取同一批甘遂生品
6 份，均依法处理并进行测定。计算得大戟二烯
醇、kansenone、11-oxo-kansenonol 的 ＲSD 分别为
1. 1%、1. 3%、1. 8%。
2. 1. 4. 4 稳定性试验 取供试品溶液，分别于 0、
2、4、6、8、12 h进样 20 μL，测定峰面积，计算
得大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol 峰面
积的 ＲSD分别为 1. 1%、0. 9%、1. 4%。
2. 1. 4. 5 加样回收率试验 取已知含有量的甘遂生
品粉末约 0. 1 g，共 6份，精密称定。分别加入各对
照品适量，按“2. 1. 1”项下方法制备供试品溶液，
依法测定峰面积，计算回收率，结果见表 1。
表 1 加样回收试验结果
Tab. 1 Ｒesults of recovery tests
测定成分 序号 称样量 / g 样品中量 /μg 加入量 /μg 测得量 /μg 回收率 /% 平均值 /% ＲSD /%
大戟二烯醇 1 0. 100 9 170. 4 168. 7 336. 1 98. 2 99. 5 1. 6
2 0. 100 7 170. 1 168. 7 337. 3 99. 1
3 0. 099 9 168. 7 168. 7 339. 1 101. 0
4 0. 101 1 170. 8 168. 7 342. 0 101. 5
5 0. 100 2 169. 2 168. 7 333. 6 97. 4
6 0. 100 9 170. 4 168. 7 338. 8 99. 8
kansenone 1 0. 100 9 9. 506 9. 303 18. 98 101. 8 97. 4 2. 9
2 0. 100 7 9. 487 9. 303 18. 65 98. 5
3 0. 099 9 9. 412 9. 303 18. 08 93. 1
4 0. 101 1 9. 525 9. 303 18. 57 97. 3
5 0. 100 2 9. 440 9. 303 18. 41 96. 4
6 0. 100 9 9. 506 9. 303 18. 54 97. 1
11-oxo-kansenonol 1 0. 100 9 8. 421 8. 581 16. 81 97. 8 97. 3 2. 4
2 0. 100 7 8. 404 8. 581 16. 80 97. 9
3 0. 099 9 8. 337 8. 581 16. 99 100. 8
4 0. 101 1 8. 438 8. 581 16. 62 95. 3
5 0. 100 2 8. 362 8. 581 16. 45 94. 2
6 0. 100 9 8. 421 8. 581 16. 82 97. 9
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2. 1. 5 样品测定 分别取甘遂、醋甘遂粉末约
0. 2 g，精密称定，按“2. 1. 1”项下方法制备供试
品溶液，依法测定，每份溶液连续进样 2 次。以峰
面积平均值按标准曲线法计算各供试品样品中大戟
二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol 的量，变化
率计算公式为: (生品平均值 －醋品平均值) /生
品平均值 × 100%。结果见表 2。
表 2 甘遂炮制前后成分测定结果 (n =6)
Tab. 2 Ｒesults of quantitative determination of Kansui Ｒa-
dix before and after beging processed (n =6)
含量
大戟二烯醇
/(mg·g － 1)
kansenone
/(mg·g － 1)
11-oxo-kansenonol
/(mg·g － 1)
生甘遂 1. 689 0. 094 22 0. 083 46
醋甘遂 1. 462 0. 079 94 0. 071 12
变化率 /% 13. 43 15. 15 14. 79
2. 2 对肠上皮细胞的毒性实验
2. 2. 1 供 试 品 的 制 备 取 大 戟 二 烯 醇、
kansenone、11-oxo-kansenonol 适量，精确称定，加
DMSO溶解制成质量浓度为 10 mg /mL 的样品贮备
液，以 0. 22 μm滤器推滤除菌，4 ℃保存备用。实
验时以 DMEM培养液稀释至所需质量浓度 (C1 ～
C5) ，其中大戟二烯醇质量浓度 (C1 ～ C5)分别为
1. 5、3. 0、6. 0、12. 0、24. 0 μg /mL;kansenone 和
11-oxo-kansenonol的质量浓度 (C1 ～ C5)分别为
0. 75、1. 5、3. 0、6. 0、12. 0 μg /mL。
2. 2. 2 细胞培养 IEC-6 细胞常规培养于含 10%
胎牛血清的 DMEM 培养液中，置于 37 ℃，5%
CO2 的饱和湿度细胞培养箱中培养。每天换液，取
对数生长期细胞用于本实验。
2. 2. 3 MTT 法测定大戟二烯醇、kansenone、11-
oxo-kansenonol 对 IEC-6 细胞相对增殖抑制率
(IC50) 取对数生长期的 IEC-6 细胞，用含
0. 03% EDTA-0. 25%胰蛋白酶液消化，用含 10%
胎牛血清的培养液制成单细胞悬液，调整细胞密度
为 1 × 105 个 /mL，每孔 100 mL 接种于 96 孔板中，
置于 37 ℃，5% CO2 的饱和湿度培养箱中培养。
孵育 24 h 后，轻轻吸弃上清，随机分为空白对照
组、大戟二烯醇给药组、kansenone 给药组、11-
oxo-kansenonol给药组。各给药组分别加入 100 mL
不同质量浓度 (C1 ～ C5)的供试品溶液，每个质
量浓度设 6 复孔。空白对照组加入等体积的 DMEM
细胞培养液，置于 37 ℃，5% CO2 的饱和湿度培
养箱中培养 48 h 后，每孔加入新鲜配制的 5
mg /mL的 MTT溶液 20 μL，继续培养 4 h，轻轻吸
弃上清，每孔加入 DMSO 溶液 150 μL，水平摇床
混匀后，酶标仪于 490 nm 波长处测定吸光度
(A)。按下式计算甘遂各供试品对 IEC-6 细胞增殖
的相对抑制率 (IＲ)。
IＲ% = (1 － A给药组均值 /A空白对照组均值) × 100 %
2. 2. 4 数据分析 实验数据采用 SPSS 20. 0 软件
进行统计分析，各组定量检测数据以 x ± s 表示，
两组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方
差 (one-way ANOVA)分析，组间比较采用 LSD
检验。
2. 2. 5 实验结果 实验结果表明，kansenone、11-
oxo-kansenonol对 IEC-6 均有较强的增殖抑制作用，
且随浓度的增加，抑制作用增强。大戟二烯醇、
kansenone、11-oxo-kansenonol 对 IEC-6 细胞的 IC50
分别为 71. 41、15. 27、14. 53 μmol /L。实验结果见
图 5。
图 5 大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol对 IEC-6
细胞增殖的影响 (n =6)
Fig. 5 Dose-dependent inhibition effects of euphol，
kansenone and 11-oxo-kansenonol on IEC-6 cell
proliferation (n =6)
3 讨论
肠黏膜屏障具有保护胃肠黏膜免受酸、碱、
酶、细菌和毒素等肠道内容物损伤的作用［8］。但
在创伤、应激等情况下，其结构和功能可受到严重
损害，从而引起一系列病理生理的变化［9］。隐窝
细胞的增殖是肠黏膜病理性损伤后，修复重建上皮
完整性和维护黏膜屏障的关键［8］。由于甘遂的毒
性主要表现在胃肠道部位，故本实验采用肠上皮细
胞进行相关的研究。大鼠小肠隐窝上皮细胞 (IEC-
6)保持了小肠上皮干细胞未分化的特性，与增殖
性隐窝细胞没有明显差别［10］，其广泛用于研究小
肠上皮细胞的生长、分化、代谢等功能，药物作用
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以及各种致病因素作用下的肠黏膜的病理生理改变
及其发病机制等，是研究和检查黏膜愈合、细胞增
殖反应等较合适的体外模型［11-12］。
《中国药典》2010 年版甘遂含量测定项下采用
C8 柱、乙腈-水 (95 ∶ 5)、检测波长 210 nm 测定
甘遂中大戟二烯醇的量，因 kansenone、11-oxo-
kansenonol与大戟二烯醇具有相同的母核，极性较
小，宜采用 C8 柱，且均具有共轭结构，在紫外下
有较强吸收，故本实验采用高效液相色谱-多波长
检测法，根据 3 个成分的最大吸收波长，在 C8 色
谱柱上同时检测大戟二烯醇 (210 nm)、kansenone
(255 nm)和 11-oxo-kansenonol (270 nm)。
本实验室前期研究表明，乙酸乙酯部位为甘遂
的毒性部位，而大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-
kansenonol 3 种成分均由乙酸乙酯部位分离纯化得
到［13］。本实验结果表明醋炙后 3 种成分的含有量
均有一定程度的降低，分析其原因可能是由于在醋
炙过程中经历酸性高温的环境后，引发了氧化、水
解或重排等反应，导致含有量改变和结构转化。在
前期研究中发现，甘遂醋炙后其乙酸乙酯部位对小
鼠肠损伤明显低于醋炙前，本实验中亦观察到
kansenone、11-oxo-kansenonol对 IEC-6 细胞的增殖
有较强的抑制作用，且呈浓度依赖性。由此，推测
甘遂经醋炙后对 IEC-6 细胞的减毒效应可能与其醋
炙后大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol 等
3 种成分的减少有关，为进一步探讨醋炙减毒物质
基础提供了依据。但本实验所用药材饮片仅为主产
地一批，且主要研究了三萜类毒性代表性物质炮制
前后的含有量变化，因此，后续将对多产地多批次
的药材以及炮制后化学成分的转化及其产物毒性评
价做进一步研究。
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