全 文 ：青藏高原气候条件恶劣，具有极端高温、低温，
昼夜温差大等特征，长期生活在这种特殊环境下的
植物，必定形成了一定的特殊抗性。 如果能从分子
生物学的角度，筛选出相关抗性基因，弄清抗性机
制，对培育农作物新品种、改良农作物特性，将可能
有很大的作用[1]。 目前，在转录水平上对高山植物高
温胁迫应答机制的研究几乎未见。
我们对狭果葶苈（Draba stenocarpa）高温差异
表达基因进行了初步分析，旨在探索高山植物高温
响应机制。
1 材料与方法
1．1 材料
狭果葶苈种子于 2008 年 10 月在云南德钦白
马雪山采集，在实验室种植，生长至株高 3～5 cm 时
转移到人工气候箱中培养 （人工气候箱的温度设置
见图 1），培养到第 3 d，分别于 37℃和 4℃时采样，
采集后立即放入液氮中。
1．2 总 RNA的提取和 mRNA的分离
总 RNA 用植物总 RNA 提取试剂盒 （TIAN-
GEN） 提取 ，mRNA 用 mRNA 提取试剂盒 （TIAN-
DEN）分离，具体方法参照试剂盒说明书。
1．3 高温差异表达基因的分离
以 37℃时采集的样品为 tester，4℃时采集的样
品为 driver，采用磁珠（Promega）介导的抑制消减杂
［收稿日期］ 2011－03－02
［基金项目］ 国家自然科学基金面上项目（30871704）；
中国科学院百人计划项目
［作者简介］ 刘德团（1984－ ），男，硕士研究生
［通信作者］ 胡向阳，（E－mail）Huxiangyang＠mail．kib．ac．cn
doi: 10．3969 ／ j．issn．1009－0002．2011．05．004 研究报告
狭果葶苈高温响应表达序列标签的分离与初步分析
刘德团 a,b，李婉莎 a，杨永平 a，胡向阳 a
中国科学院 a． 昆明植物研究所，云南 昆明 650204； b． 研究生院，北京 100049
［摘要］ 目的：分离与分析白马雪山流石滩地区植物狭果葶苈高温响应基因，研究高山植物高温耐受机制。 方法：应
用磁珠介导的抑制消减杂交分离差异表达序列标签（EST），通过测序与 Blastx 比对，用 Blast2go 程序进行功能注释
和代谢路径分析。结果：大部分 EST 功能与物质能量代谢、生物合成、蛋白和脂肪结合、转移酶活性相关，还有一些胁
迫响应的基因。 结论：狭果葶苈高温胁迫应答机制是非常复杂的，需要众多基因的参与。
［关键词］ 狭果葶苈；高温响应；抑制消减杂交；表达序列标签；注释；Blast2go 程序
［中图分类号］ Q78 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1009－0002(2011)05－0617－06
Isolation and Primary Analysis of High Temperature Responsive
EST from Draba stenocarpa
LIU De－Tuana,b, LI Wan－Shaa, YANG Yong－Pinga, HU Xiang－Yanga
a． Kunming Institute of Botany, Kunming 650204; b． Graduate University, Beijing 100049;
Chinese Academy of Sciences, China
［Abstract］ Objective: To isolate the high－temperature responsive differential expressed sequence tag （EST） from
Draba stenocarpa, study the mechanism of alpine plants responsive to high temperature． Methods: Suppression sub-
tractive hybridization （SSH） based on magnetic beads technology was used to isolate the EST． After sequencing,
Blastx, functional annotation and metabolism analysis were conducted with Blast2go． Results: Most EST related to
material and energy metabolism, biosynthetic process, lipid binding, protein binding and transferase activity; and a
few genes responsive to stress． Conclusion: The mechanism of D．stenocarpa responsive to high temperature is very
complicated, which needs lots of interactional genes．
［Key words］ Draba stenocarpa; high－temperature response; suppression subtractive hybridization; expressed se-
quence tag; annotation; Blast2go
生 物 技 术 通 讯
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．5 Sep．, 2011 617
生 物 技 术 通 讯
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．5 Sep．, 2011
交（SSH）法分离高温差异表达基因，转化大肠杆菌
DH5α 感受态细胞后， 随机挑取克隆进行菌液 PCR
鉴定，阳性克隆送上海 Sangong公司测序[2］。
1．4 差异表达序列标签（EST）分析
测序结果用 Blast2go 进行 Blastx 比对、mapping
映射获取 GO terms、GO slim（goslim＿plant．obo)精简
注释结果；然后从细胞成分、分子功能、生物过程等
3 个方面进行分类 ， 分类结果用 Microsoft Excel
2003 做图，随后进行 KEGG（Kyoto Encyclopedia of
Genes and Genomes）代谢通路分析；最后用 Fisher＇s
Exact Test对胁迫响应基因进行富集分析[3］。
2 结果
2．1 总 RNA的提取和 mRNA的分离
图 2 为狭果葶苈高低温总 RNA 琼脂糖凝胶电
泳图，图中有明显的 28S 与 18S 条带，经浓度、纯度
检测，D260nm ／D280nm值为 1．8～2．0，RNA 质量较好，可用
于后续试验。
2．2 差异 cDNA的 PCR扩增
图 3为差异 EST 的 PCR 产物，图 4 为差异 EST
的菌液 PCR结果。
2．3 差异 EST的 Blastx比对结果
比对结果见表 1。
2．4 差异基因功能分类
功能分类结果见图 5， 这些 EST 在结构上可以
划分为如下类别：①非膜结合细胞器；②细胞器；③
细胞部分；④膜结合细胞器。 其中大部分基因来自
细胞器部分（51％），其次是膜结合的细胞器（41％）。
在基因功能上，这些 EST 聚为 7 类，包括：①转移酶
活性；②蛋白结合；③核酸结合；④核苷酸结合；⑤
序列特异性 DNA 结合转录因子活性；⑥脂质结合；
⑦水解酶活性。 具体分类比例详见图 6。 其中，大部
分基因具转移酶活性，占 45％；其次，与蛋白、脂类
结合的基因也占 24％。 这些基因参与以下生物学过
程（图 7）：生殖过程；细胞平衡；分解代谢；生物质调
控；大分子代谢过程；细胞发育过程；对外部刺激反
应；结构发育；生物合成过程；生物刺激反应；内生
刺激反应；非生物刺激反应；小分子代谢过程；初级
代谢过程；氮素代谢过程；细胞代谢过程；细胞信息
传递；生物过程调控；胁迫反应；次级新陈代谢过
程；信号过程；多细胞生物发育；定位建立过程。
2．5 KEGG通路分析
KEGG通路分析结果见表 2。
2．6 富集分析
胁迫响应基因的 Fisher＇s exact test 结果见表
图 1 人工气候箱温度－时间变化曲线图
图 4 阳性克隆鉴定
1－13：cDNA克隆的菌液 PCR产物；M：DNA Marker
图 3 差异 cDNA的 PCR扩增
M：DNA Marker；1：差异 cDNA
图 2 狭果葶苈总 RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
1：4℃；2：37℃
图 5 差异表达基因的细胞定位
图 6 差异表达基因的分子功能
618
表 1 狭果葶苈高温差异表达基因的 Blastx 结果
序列 相似蛋白及物种 长度 E 值 相似度 得分
CG－1
CG－2
CG－3
CG－4
CG－5
CG－6
CG－7
CG－8
CG－9
CG－10
CG－11
CG－12
CG－13
CG－14
CG－15
CG－16
CG－17
CG－18
CG－19
CG－20
CG－21
CG－22
CG－23
CG－24
CG－25
CG－26
CG－27
CG－28
CG－29
CG－30
CG－31
CG－32
CG－33
CG－34
CG－35
CG－36
CG－37
CG－38
CG－39
CG－40
CG－41
CG－42
CG－43
CG－44
CG－45
CG－46
CG－47
CG－48
CG－49
CG－50
CG－51
CG－52
CG－53
CG－54
CG－55
CG－56
CG－57
CG－58
CG－59
CG－60
CG－61
钙池调控钙离子进入蛋白［黏菌属］
预测的蛋白［杨树］
未命名蛋白［人］
假定蛋白［醉蝶化］
转导素蛋白 ／ WD－40 重复家族蛋白［拟南芥］
17．6kD 家族Ⅰ热激蛋白［拟南芥］
预测蛋白［杨树］
假定蛋白［梭菌］
假定蛋白［肠杆菌］
钙池调控钙离子进入蛋白［黏菌属］
假定蛋白［深叶南芥变种］
核酮糖二磷酸羧化酶［深叶南芥变种］
假定蛋白［深叶南芥变种］
假定蛋白［深叶南芥变种］
假定蛋白［疟原虫］
钙池调控钙离子进入蛋白［杆菌］
RNA 介导的 DNA 聚合酶相似蛋白［拟南芥］
假定蛋白［深叶南芥变种］
60S 核糖体蛋白 L37a［拟南芥］
早期响应脱水 8［深叶南芥变种］
预测蛋白［杨树］
假定蛋白［深叶南芥变种］
谷胱甘肽转移酶［拟南芥］
假定蛋白［疟原虫］
钙池调控钙离子进入蛋白［黏菌属］
假定蛋白［疟原虫］
假定蛋白［梭菌］
假定蛋白［疟原虫］
氯霉素乙酰基转移酶［启动子探针载体］
未命名蛋白［人］
天冬酰胺蛋白激酶家族蛋白［深叶南芥变种］
17．6kD 家族Ⅰ热激蛋白［深叶南芥变种］
钙池调控钙离子进入蛋白［黏菌属］
17．6kD 家族Ⅰ热激蛋白［拟南芥］
未命名蛋白［葡萄］
假定蛋白［梭菌］
DNAJ 热激蛋白 N 端域包含蛋白［拟南芥］
钙池调控钙离子进入蛋白［黏菌属］
未命名蛋白［人］
17．6kD 家族Ⅰ热激蛋白［拟南芥］
内源木聚糖转移酶［深叶南芥变种］
假定蛋白［深叶南芥变种］
硫氧还蛋白 H 型 5［深叶南芥变种］
D－半胱氨酸脱巯基酶［深叶南芥变种］
假定蛋白［深叶南芥变种］
80kD 外膜蛋白［拟南芥］
果糖 1，6－二磷酸酶［结球白菜］
预测蛋白［杨树］
GASA1 赤霉素、脱落酸调控的蛋白［拟南芥］
假定蛋白［梭菌］
假定蛋白［疟原虫］
假定蛋白［烟草］
假定蛋白［烟草］
细胞色素 P450 相似的 TBP［烟草］
未知［大豆］
假定蛋白［疟原虫］
假定蛋白［疟原虫］
ST244［盐芥］
未命名蛋白［人］
假定蛋白［疟原虫］
假定蛋白［疟原虫］
1121
1143
1160
1164
1189
1174
1107
1178
1203
1194
1198
1184
1157
1141
1207
1149
961
1118
1157
1175
1186
1155
1169
1140
1183
1142
1141
1164
1134
1137
1140
1178
1170
1145
1145
1155
1140
1144
1135
1120
1156
1135
1137
1122
1088
1103
1105
1121
1104
1195
1205
1198
1158
1183
1181
1180
1218
1234
1208
1198
1072
1．34E－18
3．15E－23
1．33E－61
1．07E－34
7．34E－71
2．32E－42
1．00E－26
3．28E－31
1．68E－38
1．46E－18
1．39E－85
6．18E－62
1．32E－85
1．29E－85
2．14E－33
4．75E－11
1．13E－14
6．80E－31
2．06E－46
1．96E－68
1．05E－22
1．52E－49
5．70E－44
2．17E－32
1．10E－18
1．64E－26
4．08E－31
8．48E－40
1．26E－16
3．08E－71
3．51E－91
7．02E－58
7．04E－18
7．91E－67
1．03E－66
2．15E－19
2．80E－72
1．37E－18
3．06E－71
1．23E－64
4．17E－31
8．96E－55
9．99E－38
8．36E－37
4．63E－53
2．45E－25
3．50E－72
5．41E－28
8．15E－37
3．60E－25
1．80E－32
8．34E－30
1．96E－31
7．89E－40
4．94E－19
1．38E－53
3．46E－28
2．36E－35
3．37E－71
1．82E－45
3．60E－33
62
98
100
98
98
93
96
100
81
62
98
98
98
98
84
86
70
98
100
98
95
87
89
77
61
70
100
89
100
100
90
97
61
95
97
81
88
62
100
95
98
94
81
95
91
66
97
98
91
100
89
94
96
76
95
100
97
90
100
92
86
99
114
242
152
272
173
126
141
165
99
321
243
321
321
148
74
75
139
191
264
91
201
183
144
99
105
140
169
92
273
340
229
96
259
258
101
277
99
273
252
140
219
162
159
213
121
277
130
159
121
145
112
114
147
100
215
84
154
273
188
147
刘德团等：狭果葶苈高温响应表达序列标签的分离与初步分析 619
生 物 技 术 通 讯
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．5 Sep．, 2011
续表 1
序列 相似蛋白及物种 长度 E 值 相似度 得分
CG－62
CG－63
CG－64
CG－65
CG－66
CG－67
CG－68
CG－69
CG－70
CG－71
CG－72
CG－73
CG－74
CG－75
CG－76
CG－77
CG－78
CG－79
CG－80
CG－81
CG－82
CG－83
CG－84
CG－85
CG－86
CG－87
CG－88
CG－89
CG－90
CG－91
CG－92
CG－93
CG－94
CG－95
CG－96
CG－97
CG－98
CG－99
CG－100
CG－101
CG－102
CG－103
CG－104
CG－105
CG－106
CG－107
CG－108
CG－109
CG－110
核酮糖 1，5－二磷酸羧化酶 ／加氧酶［甘蓝型油菜］
假定的叶绿素 A ／ B 结合蛋白［蓖麻］
假定蛋白［疟原虫］
未命名蛋白［人］
假定的保守蛋白［人虱］
未命名蛋白［人］
未命名蛋白［人］
推测的谷胱甘肽转移酶［拟南芥］
假定蛋白［螺旋菌］
细胞色素 P450 相似的 TBP［烟草］
假定蛋白［梭菌］
细胞色素 P450 相似的 TBP［烟草］
细胞色素 P450 相似的 TBP［烟草］
假定蛋白［疟原虫］
未知［大豆］
17．6kD 家族Ⅱ热激蛋白［大白菜］
叶绿体光系统Ⅲ叶绿素 a ／ b－结合蛋白［榨菜］
未知［大豆］
假定蛋白［疟原虫］
假定蛋白［疟原虫］
假定蛋白［疟原虫］
成花相关 FLO ／ LFY 类似蛋白［豆属］
氯霉素乙酰转移酶［启动子探针载体］
未命名蛋白［人］
假定蛋白［深叶南芥变种］
未命名蛋白［人］
17．6kD 家族Ⅰ热激蛋白［拟南芥］
假定蛋白［深叶南芥变种］
假定蛋白［疟原虫］
假定蛋白［疟原虫］
假定蛋白［疟原虫］
核酮糖 1,5－二磷酸羧化酶 ／加氧酶大单位［蔊菜］
假定蛋白［梭菌］
推测的衰老相关蛋白［百合］
17．6kD 家族Ⅱ热激蛋白［大白菜］
肽基脯氨酰异构酶［深叶南芥变种］
假定蛋白［梭菌］
假定蛋白［梭菌］
假定蛋白［梭菌］
假定蛋白［疟原虫］
推测的衰老相关蛋白［柏树］
假定蛋白［疟原虫］
17．6kD 家族Ⅰ热激蛋白［拟南芥］
假定蛋白［深叶南芥变种］
假定蛋白［疟原虫］
假定蛋白［疟原虫］
推测的核糖体蛋白 S3 ［豇豆］
细胞色素 P450 相似的 TBP ［烟草］
假定蛋白［深叶南芥变种］
1072
1210
1208
1237
1248
1176
1206
1209
1225
1211
1143
1124
1139
1041
1074
1050
1062
1064
1059
1060
1012
1020
1030
1035
1029
1065
1069
1060
1073
1079
1061
1026
1018
1040
1034
1032
1032
995
1002
1019
1006
1003
1011
1007
1025
928
932
896
923
9．14E－46
3．39E－63
1．42E－53
4．92E－49
1．06E－19
3．59E－70
1．75E－35
9．22E－69
1．24E－28
1．81E－39
6．99E－31
1．04E－38
1．93E－30
1．70E－41
4．29E－19
9．20E－27
1．44E－35
4．22E－19
5．65E－32
1．72E－31
1．87E－37
2．59E－10
1．10E－16
2．67E－71
6．54E－86
6．86E－56
1．18E－61
6．79E－86
1．15E－48
1．16E－48
1．13E－48
1．05E－51
2．92E－30
2．00E－42
4．01E－27
3．68E－89
3．51E－31
1．49E－31
5．74E－31
1．89E－37
4．55E－44
2．57E－47
4．42E－63
1．19E－68
5．38E－40
6．80E－52
5．11E－23
3．00E－40
5．45E－86
98
98
100
80
71
99
69
92
59
76
100
75
72
93
95
94
100
95
76
91
100
80
100
100
96
97
92
96
97
97
97
99
98
97
96
95
100
100
100
100
96
100
95
94
97
100
96
76
96
189
247
215
200
102
270
155
265
132
146
139
143
116
174
100
126
155
100
143
131
161
71
92
273
322
175
242
322
198
198
198
208
137
178
127
333
140
141
139
161
183
194
246
265
169
209
113
146
322
3，去除了 FDR＞0．05 或 P＞0．05 的基因。 结果可见，
胁迫响应的基因是富集表达的，具有显著差异性。
3 讨论
本实验在抑制差减杂交中，磁珠的采用极大地
简化了操作步骤，节约时间，有效防止了 RNA 的降
解。 实验中使用的大部分试剂均参照 L觟nneborg 等
配制[2]，节省实验开支。
狭果葶苈为十字花科葶苈属植物，多生于河滩
坡地、石岩等高海拔地区，是高原具有代表性的物
种之一。 我们从狭果葶苈中分离的 110个 EST序列
中有 31 个在拟南芥中找到具有较高同源性的基
因， 其中 7 个基因与拟南芥中小分子量家族Ⅰ ／Ⅱ
620
表 2 酶的 KEGG 代谢路径
代谢途径 酶 酶 ID 序列
鞘脂代谢
苯丙素生物合成
糖酵解 ／异生
乙醛酸和二羧酸代谢
半胱氨酸和蛋氨酸代谢
药物代谢－细胞色素 P450
果糖和甘露糖代谢
丙酸酯代谢
苯丙氨酸代谢
异生物的细胞色素 P450 代谢
代谢途径
代谢途径
代谢途径
代谢途径
谷胱甘肽代谢
丙酮酸代谢
戊糖磷酸途径
次级代谢的生物
次级代谢的生物
甲烷代谢
甲烷代谢
其他糖链降解
苯丙素生物合成
苯丙素生物合成
光合作用有机物的碳固定
光合作用有机物的碳固定
葡糖苷鞘酰胺酶
过氧化物酶
果糖二磷酸酶
二磷酸核酮糖羧化酶
D－半胱氨酸脱巯基酶
谷胱甘肽转移酶
果糖二磷酸酶
1－氨基环丙烷－1－羧酸脱氨酶
过氧化物酶
谷胱甘肽转移酶
二磷酸核酮糖羧化酶
葡糖苷鞘酰胺酶
果糖二磷酸酶
过氧化物酶
谷胱甘肽转移酶
乳酸酰谷胱苷肽裂解酶
果糖二磷酸酶
果糖二磷酸酶
过氧化物酶
果糖二磷酸酶
过氧化物酶
葡糖苷鞘酰胺酶
果糖二磷酸酶
过氧化物酶
二磷酸核酮糖羧化酶
果糖二磷酸酶
ec：3．2．1．45
ec：1．11．1．7
ec：3．1．3．11
ec：4．1．1．39
ec：4．4．1．15
ec：2．5．1．18
ec：3．1．3．11
ec：3．5．99．7
ec：1．11．1．7
ec：2．5．1．18
ec：4．1．1．39
ec：3．2．1．45
ec：3．1．3．11
ec：1．11．1．7
ec：2．5．1．18
ec：4．4．1．5
ec：3．1．3．11
ec：3．1．3．11
ec：1．11．1．7
ec：3．1．3．11
ec：1．11．1．7
ec：3．2．1．45
ec：3．1．3．11
ec：1．11．1．7
ec：4．1．1．39
ec：3．1．3．11
CG－38
CG－69
CG－47
CG－93，CG－12，CG－62
CG－44
CG－23，CG－69
CG－47
CG－44
CG－69
CG－23，CG－69
CG－93，CG－12，CG－62
CG－38
CG－47
CG－69
CG－23，CG－69
CG－69
CG－47
CG－47
CG－69
CG－47
CG－69
CG－38
CG－47
CG－69
CG－93，CG－12，CG－62
CG－47
表 3 胁迫响应基因的富集分析
GO ID 基因名 假阳性发现率（FDR） 显著性 P 值 检验数 参考数 富集 ／缺失
GO：0006950
GO：0050896
GO：0009628
GO：0016740
GO：0005515
GO：0009607
GO：0003824
GO：0051234
GO：0006810
GO：0044260
胁迫响应
刺激物响应
非生物刺激物响应
转移酶活性
蛋白结合
生物刺激物响应
催化活性
定位建立
转运
细胞大分子代谢
1．53E－10
1．53E－10
1．53E－10
7．64E－04
0．005317
0．010446
0．013019
0．026125
0．026125
0．047145
0
0
5．93E－13
4．30E－04
0．001257
0．002005
0．007327
0．007384
0．007384
0．014578
26
26
23
3
11
5
10
4
4
1
0
5
5
30
6
0
41
0
0
15
over
over
over
under
over
over
under
over
over
under
的热激蛋白基因 （CG－32、CG－34、CG－40、CG－77、
CG－88、CG－96、CG－104）高度同源，相似性达 97％。
热激蛋白是细胞响应外界刺激时产生的一组蛋白
质，在植物受到高温等逆境胁迫时大量表达，对减
轻植物逆境胁迫伤害有重要作用，广泛存在于从低
等原核生物到高等动植物中 [4]。 狭果葶苈在受到高
温胁迫时，体内产生大量热激蛋白，以抵御高温造
成的伤害，保护植物正常生长。
EST 中的 5 个序列 （CG－54、CG－71、CG－73、
CG－74、CG－109） 与细胞色素 P450 基因高度同源。
细胞色素 P450 在植物防御体系中起重要作用，赋
予植物抵抗各种胁迫因子的能力，可被多种胁迫因
子诱导表达[5]。 核糖体蛋白 S3（CG－108）在信号转导 图 7 差异表达基因参与的生物过程
刘德团等：狭果葶苈高温响应表达序列标签的分离与初步分析 621
生 物 技 术 通 讯
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．5 Sep．, 2011
方面有重要作用[6]。 衰老相关蛋白（CG－95、CG－102）
也是胁迫诱导相关蛋白，高温逆境胁迫能诱导其表
达，致使植物早衰[7]。
经 Fisher＇s 精确检验发现， 实验中得到的胁迫
差异基因 （CG－6、CG－12、CG－20、CG－23、CG－27、
CG－32、CG－34、CG－37、CG－40、CG－42、CG－43、CG－
45、CG－49、CG－54、CG－61、CG－62、CG－69、CG－77、
CG －86、CG －88、CG －89、CG －96、CG －97、CG －104、
CG－105、CG－110），FDR 值和 P 值都小于 0．05，表明
它们在狭果葶苈响应高温胁迫过程中富集表达，具
有显著差异性，可能对狭果葶苈热耐受性起关键作
用。
KEGG 结果中，过氧化物酶（CG－69）可能与提
高狭果葶苈耐热性相关，植物为逃避或抵抗高温胁
迫伤害， 激起或提高了体内抗氧化防御系统的活
性，包括过氧化物酶、抗坏血酸、谷胱甘肽、硫氧还
蛋白等 [8]。 谷胱甘肽转移酶（CG－23、CG－69）在植物
抗渗透胁迫、胁迫耐受、信号转导和代谢过程中行
使重要功能[9]。
本研究结果为日后进一步对狭果葶苈等高山
植物抗性机理的研究奠定了基础。 植物的抗逆是一
个极其复杂的生理过程，植物在逆境下会产生复杂
的生物化学和生理学响应，而引起这些响应的分子
机制至今尚未完全阐明。 相信随着植物基因组及蛋
白质组数据库的日益完善，将会有更多的与抗性相
关的蛋白或基因被挖掘，更能全面地揭示植物抗逆
性的本质。
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