免费文献传递   相关文献

鲤鱼赤小豆汤对阿霉素肾病大鼠CD2AP及Nephrin表达影响



全 文 :第48卷 第1期
2012年2月
青 岛 大 学 医 学 院 学 报
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE QINGDAO UNIVERSITATIS
Vol.48,No.1
February 2012
[收稿日期]2011-08-12; [修订日期]2011-10-20
[基金项目]国家自然科学基金项目(81072754)
[作者简介]王鑫(1986-),男,硕士研究生。
[通讯作者]沈卫(1950-),男,教授,硕士研究生导师。
鲤鱼赤小豆汤对阿霉素肾病大鼠CD2AP及
Nephrin表达影响
王鑫1,刘剑英2,吴慧1,郭云良1,周晓彬1,田小剑3,徐常杰4,沈卫1
(1 青岛大学医学院中西医结合中心,山东 青岛 266021; 2 中国人民解放军济南军区青岛第一疗养院营养科;
3 天津中医药大学第二附属医院营养科; 4 天津医科大学三中心临床学院)
[摘要] 目的 观察阿霉素肾病大鼠肾小球足细胞Nephrin和CD2相关蛋白(CD2AP)的表达及鲤鱼赤小豆
汤对其表达的影响。方法 SPF级 Wistar雄性大鼠50只,随机分为正常组(N组)10只及造模组40只。造模组一
次性尾静脉注射阿霉素6.5mg/kg以制备肾病模型,造模成功后随机分为模型组(M组)、福辛普利组、鲤鱼赤小豆
汤低剂量组、鲤鱼赤小豆汤高剂量组。实验干预7周。检测各组大鼠12h尿蛋白、血清总蛋白、清蛋白,免疫组织
化学方法检测各组大鼠肾小球内Nephrin及CD2AP的阳性表达水平。结果 与N组相比,其他各组12h尿蛋白
含量均升高(t=2.38~4.77,P<0.05),尤以 M组升高显著。与 N组比较,其他各组肾小球中 Nephrin与CD2AP
的表达减弱(t=3.78~11.06,P<0.05);与 M 组相比,各干预组肾小球中 Nephrin与CD2AP的表达都有所增强
(t=2.11~3.48,P<0.05)。结论 鲤鱼赤小豆汤可通过上调其肾小球足细胞Nephrin和CD2AP的表达,起到保
护肾小球滤过屏障的作用。
[关键词] Nephrin;CD2相关蛋白;肾病;大鼠;鲤鱼赤小豆汤
[中图分类号] R247.1  [文献标志码] A  [文章编号] 1672-4488(2012)01-0010-03
EFFECT OF LIYU CHIXIAODOU TANG ON EXPRESSIONS OF NEPHRIN AND CD2-ASSOCIATED PROTEIN IN ADRIAMYCIN-
INDUCED NEPHROSIS IN RATS WANG Xin,LIU Jianying,WU Hui,GUO Yunliang,ZHOU Xiaobin,TIAN Xiaojian,
XU Changjie,SHEN Wei (Institute of Integrative Medicine,Qingdao University Medical Colege,Qingdao 266003,China)
[ABSTRACT]Objective To observe the expressions of nephrin in podocytes and CD2-associated protein(CD2AP)in adria-
mycin-induced nephrosis(AIN)in rats,and study the effect of Liyu Chixiaodou Tang(a traditional Chinese decoctions)on them.
Methods Fifty male Wistar rats in SPF grade were randomly divided into two groups,10in normal group(N group)and 40for
pre-model group.A nephrotic model was created in 40rats in the pre-model group by a single injection of adriamycin(6.5mg/kg)
in tail vein.Upon completion of the models,the rats were divided into model group(M group),fosinopril group,low-dose Liyu
Chixiaodou Tang group,and high-dose Liyu Chixiaodou Tang.The trial lasted for seven weeks.The 12-hour urine protein,total
serum protein and total albumin were detected.The expressions of nephrin and CD2AP were measured by immunohistochemistry.
Results Compared with the N group,the 12-hour urine protein levels of the other groups were elevated(t=2.38-4.77,P<
0.05),being especialy higher of the M group;the expressions of nephrin and CD2AP in glomerular were decreased(t=3.78-
11.06,P<0.05).Compared with the M group,the expressions of nephrin and CD2AP were enhanced in each intervention group
(t=2.11-3.48,P<0.05). Conclusion Liyu Chixiaodou Tang can protect the glomerular filtration barrier by up-regulating the
expressions of nephrin and CD2AP.
[KEY WORDS] nephrin;CD2-associated protein;nephrosis;rats;Liyu Chixiaodou Tang
  CD2相关蛋白(CD2AP)是近年来发现的与蛋
白尿发生密切相关的足细胞裂孔隔膜(SD)蛋白[1]。
Nephrin也是SD的主要结构蛋白,在控制肾小球滤
过屏障通透性方面起关键性作用。本实验通过尾静
脉注射阿霉素的方法建立大鼠肾病模型,用鲤鱼赤
小豆汤对其进行干预,观察其尿蛋白、血生化及肾小
球足细胞CD2AP与Nephrin的表达,以探讨鲤鱼
赤小豆汤治疗作用,为其推广应用提供实验依据。
现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物及来源
SPF级雄性 Wistar大鼠50只,8周龄,体质量
(200±20)g,由山东鲁抗医药集团医药有限公司提
供。在青岛大学医学院中西医结合动物实验室分笼
饲养,每笼5只,自然光照,温度(24±2)℃,相对湿
度45%~75%,自由饮水和进食。
 
1期 王鑫,等.鲤鱼赤小豆汤对阿霉素肾病大鼠CD2AP及Nephrin表达影响 11
1.2 药物及试剂
鲤鱼赤小豆汤:于河南水产科学院武陟黄河鲤
鱼良种场现场捕捞8月龄黄河鲤,捕捞后2h内以
0~-17℃冷藏保存;赤小豆产于内蒙古突泉县。
按《本草纲目》原方记载取鲤鱼250g、赤小豆100g,
按比例煎煮,滤出鱼汤,并浓缩至含3.50kg/L生
药,用聚乙烯塑料袋分袋密封包装,置-17℃冰箱
中冷藏备用。阿霉素购自浙江海正药业股份有限
公司,批号:091203。福辛普利钠片购自中美上海
施贵宝制药有限公司,批号:1005086。CD2AP抗
体和Nephrin抗体购自北京博奥森生物技术有限
公司。SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有
限公司。
1.3 实验动物模型制备及分组
实验大鼠适应性喂养1周,测尿蛋白阴性后入
选实验。首先将大鼠随机分成正常组(N组)和造模
组。N组10只,造模组40只。造模组按照6.5mg/
kg计算每只大鼠阿霉素尾静脉注射用量,一次性尾
静脉注射以制备肾病模型。N组大鼠尾静脉注射等
剂量的生理盐水。造模组造模成功后随机分为模型
组(M组)、福辛普利组(F组)、鲤鱼赤小豆汤低剂
量组(DD组)、鲤鱼赤小豆汤高剂量组(DG组)。
1.4 实验动物的干预
造模1周后对实验大鼠进行灌胃干预,每日1
次,共干预7周。DD组按鲤鱼赤小豆汤9mL/kg
灌胃(考虑到要将外部因素降到最低,所以此组以含
生药3.50kg/L鲤鱼赤小豆汤加等量自来水,成为
含生药1.75kg/L鲤鱼赤小豆汤,即灌胃剂量由原
来4.5mL/kg变为9mL/kg,与 DG 组灌胃量等
同);DG组按9mL/kg灌胃;F组以0.09g/L福辛
普利10mL/kg灌胃;N组及 M 组大鼠以等量自来
水10mL/kg灌胃。
1.5 观察指标
1.5.1 一般情况 观察大鼠的精神状态、食量、饮
水量、体质量、体毛、两便及活动情况。
1.5.2 尿蛋白 处死前1d,分别将大鼠放入代谢
笼中,一鼠一笼,收集其12h尿液,作为终末标本,
检测其尿蛋白含量。
1.5.3 血生化 实验大鼠腹腔麻醉后腹主动脉取
血,血液静置半小时后以4 000r/min离心10min
分离血清,采用全自动生化测定仪检测清蛋白、总蛋
白的水平。
1.5.4 肾脏组织病理形态学观察 取肾脏组织,行
苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察肾小球毛细血
管的改变。
1.5.5 CD2AP及Nephrin的检测 所有标本按常
规方法固定、脱水、包埋,4μm厚切片。切片常规脱
蜡至水,加过氧化氢,高压热修复,随后依次滴加
BSA封闭液、一抗(1∶200)、二抗、SABC、DAB显
色液。阳性表达区域着色后冲洗、复染、封片。显微
镜下拍照,并用Image-Pro Plus专业图像分析软件
检测肾组织中CD2AP、Nephrin的表达。
2 结  果
2.1 一般状况
N组大鼠体质量增加较快,精神状态良好,皮毛
光泽,动作灵敏,饮食、饮水正常,两便无异常。注射
阿霉素后,所有造模组的大鼠均出现不同程度的精
神萎靡、摄食饮水减少、体质量减轻、腹泻等症状。
药物急性反应期过后,腹泻有所减轻。经过几周的
干预治疗后,各干预组大鼠的状况均有不同程度改
善,M组由于未给予任何治疗措施,其一般状况与
干预组相比改善缓慢。因阿霉素的药物毒性作用,
从造模后到干预结束,共死亡10只大鼠,其中 M 组
4只,F组3只,DD组1只,DG组2只。
2.2 大鼠12h尿蛋白及血生化测定
与N组相比,各组12h尿蛋白含量均明显升高
(t=2.38~4.77,P<0.05),尤以 M组升高显著;与
M组相比,各干预组12h尿蛋白含量均有不同程度
降低,但差异无显著性。
与N组相比,M组大鼠血清总蛋白含量明显下
降(t=2.85,P<0.05),各干预组虽亦有下降,但差
异均无显著性;与 M 组相比,各干预组血清总蛋白
均有所升高,但仅 DG组差异有显著性(t=2.54,
P<0.05)。与N组相比,其余各组大鼠血清清蛋白
含量均明显下降(t=6.22~7.42,P<0.05);与 M
组相比,DG组血清清蛋白含量明显升高(t=2.41,
P<0.05),F组与DD组亦有升高,但差异无显著
性。见表1。
表1 各组大鼠12h尿蛋白含量及血生化比较(珔x±s)
组别 n 12h
尿蛋白
含量(mg/d)
总蛋白
(ρ/g·L-1)
清蛋白
(ρ/g·L-1)
N 组 10  14.83± 2.61  68.29±1.36  23.18±0.31
M 组 6  139.32±28.26  59.37±2.56  11.13±0.83
F 组 7  76.92±23.38  65.95±4.14  13.08±1.69
DD组 9  127.03±23.83  64.35±1.10  12.32±1.08
DG组 8  121.42±25.93  68.25±2.23  15.52±2.13
 
12 青 岛 大 学 医 学 院 学 报 48卷
2.3 肾小球组织结构观察
光镜下N组肾小球及肾小管结构清晰,肾小球
无球囊粘连,肾小管内未见管型,间质内未见炎症细
胞浸润;M组肾小球数量减少,肾小球毛细血管与
肾小球囊粘连,肾小管上皮细胞肿胀,可见蛋白管
型,肾小管管腔内出现大量蛋白管型,肾间质内有明
显淋巴细胞浸润,部分肾间质出现纤维化;各干预组
光镜下病变情况较模型组均有所减轻。
2.4 CD2AP及Nephrin的表达
免疫组织化学结果显示,N组 Nephrin阳性表
达为Nephrin沿肾小球毛细血管壁(即足细胞附着
处)呈较为连续的粗线条状分布,且其表达较强;M
组的阳性表达亦在毛细血管壁,但其阳性区域呈点
状或小团块状分布,表达明显减弱;F组、DD组和
DG组的阳性表达分布较 M 组增强,点状及团块状
表达区域增多,但仍未呈较为连续的分布。CD2AP
分布与 Nephrin相似,都表达在足细胞,亦为 N组
表达较强,M组表达减弱,各干预组表达较 M 组增
强。与N组相比,其他各组大鼠肾组织中CD2AP
及Nephrin蛋白的表达均降低(t=3.78~11.06,
P<0.05),而且与 M 组相比较,各干预组CD2AP
及Nephrin蛋白表达均有所增强(t=2.11~3.48,
P<0.05),但F组、DD组、DG组之间蛋白的表达
差异无显著性。
表2 各组大鼠CD2AP及Nephrin的表达比较(珔x±s)
组别 n  Nephrin  CD2AP
N 组 10  0.371±0.019  0.361±0.012
M 组 6  0.321±0.009  0.329±0.009
F 组 7  0.338±0.013  0.342±0.012
DD组 9  0.337±0.015  0.342±0.015
DG组 8  0.339±0.009  0.339±0.013
3 讨  论
近年有关足细胞生理学功能的研究进展提示,
足细胞是众多肾小球疾病的主要病变部位。足细胞
即肾小球脏层上皮细胞,其胞体、足突以及足突间的
SD构成了肾小球滤过屏障的最外层,在维持肾小球
结构和功能中发挥重要作用。CD2AP是多功能蛋
白,参与细胞骨架的构建和肾小球足细胞的信号转
导,在足细胞内吞、生存、分化、分裂、黏附等过程中
起重要作用[2-3]。Nephrin是第一种被确认的足细
胞裂孔隔膜蛋白,相邻足细胞间的 Nephrin分子相
互作用,在裂孔隔膜部位形成特殊结构,在控制肾小
球滤过屏障通透性方面起关键性作用[4]。
祖国医学有药食同源之说,鲤鱼、赤小豆虽为寻
常食品,但擅消水之功,鲤鱼味甘性温、平、无毒,入
脾、肺、肾经,具有补脾胃、益肾气、利水消肿、通乳祛
瘀、清热解毒之功效。当代文献对以鲤鱼为主药的
方剂多有记载,其中涉及肾病综合征水肿[5-6]、妊娠
水肿[7]、羊水过多[8]、癌性胸腹水[9]等疾病的疗效独
特,尤对肾性水肿疗效显著。这可能与鲤鱼赤小豆
汤中的某些成分对蛋白尿有特殊疗效有关。
本实验结果显示,各干预组大鼠的体质量及精
神状态等一般状况均有不同程度改善,M 组由于未
给予任何治疗措施,其一般状况改善缓慢;与 M 组
比较,各干预组血浆清蛋白、总蛋白水平升高,这表
明鲤鱼赤小豆汤能改善阿霉素肾病大鼠的一般情
况,提高其清蛋白及总蛋白水平。通过比较 Neph-
rin与CD2AP的蛋白表达,结果显示,M 组的表达
量较N组明显下降,提示阿霉素肾病大鼠的足细胞
及基膜遭受严重损伤,导致其肾小球滤过屏障遭到
破坏,从而出现大量蛋白尿。而各干预组 Nephrin
与CD2AP的蛋白表达均有不同程度上升,提示
Nephrin和CD2AP的表达异常是阿霉素肾病大鼠
病情进展的重要分子机制,并可通过上调其肾小球
足细胞Nephrin和CD2AP的表达起到保护肾小球
滤过屏障的作用。
[参考文献]
[1] SHIH N Y,LI J,KARPITSKII V.Congenital nephritic syn-
drome inrilice lacking CD2-associaed protein[J].Science,
1999,286(5438):312-315.
[2] SCHIFFER M,MUNDEL P,SHAW A S,et al.A novel role
for the adaptor molecule CD2-associated protein in transfor-
ming growth factor beta induced apeptusis[J].J Biol Chem,
2004,279(35):37004-37012.
[3] TOSSIDOU I,KARDINAL C,PETERS I,et al.cD2AP/
cIN85balance determines receptor tyresine kinase signaling re-
sponse in podocydes[J].J Biol Chem,2007,282(10):7457-
7464.
[4] PATRAKKA J,TRYGGVASON K.Nephrin-a unique struc-
tural and signaling protein of the kidneyfilter[J].Trends Mol
Med,2007,13(9):396-403.
[5] 常克,吕斌,钟柏松.新制鲤鱼汤去除肾病综合征蛋白尿的临
床观察[J].现代中西医结合杂志,2001,10(16):1536-1537.
[6] 赵丽敏.中西医结合治疗肾病综合征36例[J].河南中医,
2004,24(8):55.
[7] 高翠霞,张翠英.鲤鱼白术汤加减治疗妊娠水肿60例疗效观
察[J].世界中西医结合杂志,2009,4(2):123-124.
[8] 王一波.“千金鲤鱼汤”治疗羊水过多46例[J].江苏中医药,
2003,24(6):38.
[9] 袁海燕,张岩,洪大秋.千金鲤鱼汤治疗癌性胸腹水30例[J].
实用中医内科杂志,2004,18(4):345.
(本文编辑 厉建强)