全 文 ：　 ［收稿日期］　２０１５－０６－１６；２０１５－０７－１０修回
　 ［基金项目］　浙江省自然科学基金项目 “瓯柑果实活性因子的分离纯化及其抗肿瘤活性研究”（Ｙ３０９０３２９）；铜仁学院博士科研启动基
金项目 “梵净山猕猴桃资源深入调查与引种研究”（ｔｒｘｙＤＳ１３０３）
　 ［作者简介］　张绍阳 （１９８３－），男，讲师，博士，从事果树种质资源与遗传育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｓｈａｏｙａｎｇ６６６＠１２６．ｃｏｍ
　＊通讯作者： 徐昌杰 （１９７２－），男，教授，博士，从事果实品质分子生理学和果实采后分子生理学等研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｊｘｕ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．
ｃｎ
［文章编号］１００１－３６０１ （２０１５）０８－０４１１－００２１－０５
基于Ｓ－ＳＡＰ标记技术的柑橘芽变新品系青瓯柑的鉴别
张绍阳１，２，孙崇德１，徐昌杰１＊，陈昆松１
（１．浙江大学 果实品质生物学实验室／农业部园艺作物生长发育与品质生物学实验室，浙江 杭州
３１００５８；２．铜仁学院 生物与农林工程学院 梵净山特色动植物资源重点实验室，贵州 铜仁５５４３００）
　　 ［摘　要］青瓯柑是在普通瓯柑上新发现的一个疑似芽变品系，其与普通瓯柑和无籽瓯柑的差异为在
采后贮藏３～４个月内青瓯柑果实外果皮仍可保持显著绿色。为进一步确认青瓯柑与普通瓯柑和无籽瓯柑
的亲缘关系，基于新建立的瓯柑ＥｃｏＲⅠ单酶切Ｓ－ＳＡＰ标记技术体系，采用２８０个选扩引物组合，对现有
的全部３种瓯柑 （青瓯柑、普通瓯柑和无籽瓯柑）进行Ｓ－ＳＡＰ标记片段筛选，并从 Ｃ１２ （５′－ＴＴＡ－
ＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＡ－３′）和ＥＡＴ （５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴ－３′）选扩增产物后进行分析。
结果表明：获得１条长约２６０ｂｐ的青瓯柑特异的Ｓ－ＳＡＰ标记片段；青瓯柑属于普通瓯柑芽变，获得的Ｓ－
ＳＡＰ特异标记技术方法可为青瓯柑品种的认定、种苗鉴别及新品种推广提供技术支撑。
［关键词］青瓯柑；芽变新品系；序列特异扩增多态性 （Ｓ－ＳＡＰ）；单酶切
［中图分类号］Ｓ６６ ［文献标识码］Ａ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒｅｅｎ　Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ（ａ　Ｎｅｗ　Ｂｕｄ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｌｉｎｅ　ｏｆ　Ｃｉｔｒｕｓ）
Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｓ－ＳＡＰ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ＺＨＡＮＧ　Ｓｈａｏｙａｎｇ１，２，ＳＵＮ　Ｃｈｏｎｇｄｅ１，ＸＵ　Ｃｈａｎｇｊｉｅ１＊，ＣＨＥＮ　Ｋｕｎｓｏｎｇ１
（１．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｆｒｕｉｔ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｔｈ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｑｕａｌｉｔｙ
Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　３１００５８；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｏｆ　Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｗｉｌｄｌｉｆｅ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｉｎ　Ｆａｎｊｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｇｒｏ－ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｏｎｇｒｅｎ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｏｎｇｒｅｎ，Ｇｕｉｚｈｏｕ５５４３００，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｒｅｅｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｉｓ　ａ　ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ　ｂｕｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ　ｆｒｏｍ　ｃｏｍｍｏｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｍｏｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ａｎｄ　ｓｅｅｄｌｅｓｓ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅｉｓ　ｔｈａｔ　ｅｘｏｃａｒｐ　ｏｆ　ｇｒｅｅｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｓｔｉｌ
ｋｅｅｐｓ　ｇｒｅｅｎ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ～ｆｏｕｒ　ｍｏｎｔｈｓ．Ｔｈｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｇｒｅｅｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ，ｃｏｍｍｏｎ　Ｃ．
ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ａｎｄ　ｓｅｅｄｌｅｓｓ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　２８０ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｎｅｗｌｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ＥｃｏＲⅠｓｉｎｇｌｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　Ｓ－ＳＡＰ　ｍａｒｋｅｒ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍ　Ｃ１２ （５′－ＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＡ－３′）ａｎｄ
ＥＡＴ （５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴ－３′）ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｔｏ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｃｏｎｆｉｒｍ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
ａｍｏｎｇ　ｇｒｅｅｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ，ｃｏｍｍｏｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ａｎｄ　ｓｅｅｄｌｅｓｓ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ
ｓｐｅｃｉａｌ　Ｓ－ＳＡＰ　ｍａｒｋｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　２６０ｂｐ　ｏｆ　ｇｒｅｅｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｉｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｇｒｅｅｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ
ｂｅｌｏｎｇｓ　ｔｏ　ｂｕｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ．Ｔｈｅ　Ｓ－ＳＡＰ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｒｋｅｒ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｃａｎ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｅｅｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ａｎｄ
ｐｏｐｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｗ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇｒｅｅｎ　Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ；ｎｅｗ　ｂｕｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｌｉｎｅ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒ－
ｐｈｉｓｍ（Ｓ－ＳＡＰ）；ｓｉｎｇｌｅ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
　　瓯柑 （Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｕａｖｉｓｓｉｍａ　Ｈｏｒｔ．ｅｘ　Ｔａｎａｋａ）是浙
江南部特色柑橘品种，主要分布在瓯江沿岸。瓯柑
果实风味独特，且医疗保健作用突出［１－６］。目前，瓯
柑分为普通瓯柑、无籽瓯柑和青瓯柑３种，其中，
普通瓯柑为当地主栽品种，无籽瓯柑是从普通瓯柑
中选育出的无籽芽变品种，于２００４年通过浙江省林
木良种审定委员会认定并命名［７］。青瓯柑是２００５年
发现的普通瓯柑疑似芽变品系，在采后贮藏３～４个
月内，其果实外表皮仍可保持明显绿色，而在采后
贮藏１个月内，普通瓯柑和无籽瓯柑果实外表皮完
全变黄，但在其他植株外观形态 （包括苗期植株形
态）方面，并未发现３种瓯柑的差异。
ＤＮＡ分子标记技术已经成为果树芽变鉴别研
究的主要技术手段。其中，Ｓ－ＳＡＰ （Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｓｐｅ－
ｃｉｆｉｃ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，序列特异扩增
多态性）技术［８］在苹果红富士品种一些芽变品系鉴
定中发挥了较好的作用［９－１０］。基于此，笔者采用Ｓ－
ＳＡＰ标记技术对上述３种瓯柑遗传差异进行筛选，
以期为青瓯柑是普通瓯柑新芽变品系提供遗传证
据，同时也为青瓯柑品种认定和种苗鉴别及新品种
推广提供技术支撑。但由于芽变材料与其母本材料
间的遗传差异大都只存在于个别位点［１１］，采用Ｓ－
　贵州农业科学　２０１５，４３ （８）：２１～２５
　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ＳＡＰ技术或其他分子标记，有时也很难检测出遗
传差异。在先前研究中，研究小组曾采用经典Ｓ－
ＳＡＰ技术［８］和２２４个选择性扩增引物组合对３种
瓯柑遗传差异片段筛选，未获得多态性片段。前人
研究发现，基于不同逆转座子的特点和研究目的，
可以在酶切方式和ＰＣＲ扩增引物设计等方面对经
典Ｓ－ＳＡＰ技术进行调整，以使得该技术具有更好
的适用性［１２－１４］。如Ｅｌｉｓ等［１３］和Ｂｅｒｅｎｙｉ等［１４］分别
采用 ＭｓｅⅠ单酶切和ＥｃｏＲⅠ单酶切方式成功地对
豌豆和甘薯进行Ｓ－ＳＡＰ分析。对采用Ｓ－ＳＡＰ标记
技术或其调整后技术鉴别普通瓯柑及其芽变品系，
目前尚未见相关研究报道。鉴于此，笔者对基于
ＭｓｅⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切的经典Ｓ－ＳＡＰ技术进行调
整，建立基于ＥｃｏＲⅠ单酶切的瓯柑Ｓ－ＳＡＰ标记技
术体系，并用其筛选青瓯柑特异的Ｓ－ＳＡＰ标记条
带，为青瓯柑属于普通瓯柑芽变提供有力证据，并
可为青瓯柑品种认定和种苗鉴别及新品种推广提供
技术支撑。
１ 材料与方法
１．１ 材料
瓯柑种类：普通瓯柑、无籽瓯柑和青瓯柑３种
瓯柑。每种瓯柑各从３株树上分别采集叶长小于成
长叶１／４的幼叶，作为３个生物学重复材料，均由
浙江省温州市瓯海区农林渔业局特产站提供。
试剂：ＥｃｏＲⅠ和ｐＢＲ３２２ＭｓｐⅠ－ｄｉｇｅｓｔ　ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ为美国ＮＥＢ公司产品，Ｔ４连接酶和Ｇｅｎｅ－
Ｒｕｌｅｒ　５０ｂｐ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ购于上海生工生物工程
技术服务有限公司，ｒＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ＤＬ２０００
ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ和λ－ＨｉｎｄⅢ ｄｉｇｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ为
Ｔａｋａｒａ公司产品。
标记筛选所用的２８０个选扩引物组合由表所列
的２０条ＥｃｏＲⅠ选扩引物与１４条柑橘ＬＴＲ引物组
合而成。ＬＴＲ 引物 Ｃ１－Ｃ３依据 Ｒｉｃｏ－Ｃａｂａｎａｓ和
Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ等［１５］分离出的甜橙 Ｔｙ１－ｃｏｐｉａ
类型逆转座子 （ＧｅｎＢａｎｋ号为 ＡＭ０４０２６３．２）的
ＲＮａｓｅＨ－ＬＴＲ 片 段 序 列 设 计，Ｃ４－Ｃ６、Ｃ７－Ｃ９、
Ｃ１０－Ｃ１１以及Ｃ１２－Ｃ１４等４组引物分别基于农业部
园艺作物生长发育与品质生物学实验室克隆获得的
４条瓯柑ＲＮａｓｅＨ－ＬＴＲ片段序列设计，１４条ＬＴＲ
引物均参照Ｓｙｅｄ等［１６］方法进行设计。
１．２ 基因组ＤＮＡ样品制备
采用 ＣＴＡＢ 法［１７］从瓯柑幼叶提取基因组
ＤＮＡ。
１．３ ＥｃｏＲⅠ单酶切
反应体系包括１×ＮＥＢ缓冲液４、５００ｎｇ基因
组ＤＮＡ和５ＵＥｃｏＲⅠ （ＮＥＢ，美国），用ｄｄＨ２Ｏ
补充体积至２０μＬ。在３７℃酶切３ｈ后于６５℃灭活
２０ｍｉｎ。
１．４ ＥｃｏＲⅠ酶切接头连接
首先制备接头，即各取５０μＬ　１０μｍｏｌ／Ｌ的
ＥＦ （５′－ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ－３′） 和 ＥＲ
（５′－ＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＣＡＧＴＣＴＡＣ－３′）引物溶液进
行均匀混合，９５℃温浴５ｍｉｎ，随即取出，室温自
然冷却，产物即为５．０μｍｏｌ／Ｌ的ＥｃｏＲⅠ接头溶
液。然后进行连接，反应体系包括１．０μＬ　１０×
Ｔ４ＤＮＡ连接酶缓冲液、５．０μＬ酶切产物、１．０
μＬ　５．０μｍｏｌ／Ｌ　ＥｃｏＲ Ⅰ接头以及０．４μＬ　５Ｕ／
μＬ　Ｔ４ＤＮＡ连接酶，用ｄｄＨ２Ｏ补充体积至１０μＬ。
于１６℃连接８ｈ后于６５℃灭活２０ｍｉｎ。
表 Ｓ－ＳＡＰ技术选扩增分析所用引物
Ｔａｂｌｅ　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓ－ＳＡＰ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ＥｃｏＲ　Ｉ选扩引物
ＥｃｏＲ　Ｉ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｉｍｅｒｓ
名称 序列 （５′→３′）
ＬＴＲ引物
ＬＴＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ
名称 序列 （５′→３′）
ＥＡ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡ　 Ｃ１ ＧＴＣＣＡＴＡＴＡＣＡＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＣＡＡＧ
ＥＣ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＣ　 Ｃ２ ＧＴＣＣＡＴＡＴＡＣＡＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＣＡＡＡ
ＥＧ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＧ　 Ｃ３ ＧＴＣＣＡＴＡＴＡＣＡＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＣＡＡＴ
ＥＴ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴ　 Ｃ４ ＡＡＴＣＴＧＣＴＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡＣ
ＥＡＡ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡ　 Ｃ５ ＡＡＴＣＴＧＣＴＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡＧ
ＥＡＣ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣ　 Ｃ６ ＡＡＴＣＴＧＣＴＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡ
ＥＡＧ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧ　 Ｃ７ ＴＣＧＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＣＡＧ
ＥＡＴ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴ　 Ｃ８ ＴＣＧＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＥＣＡ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡ　 Ｃ９ ＴＣＧＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＣＡＡ
ＥＣＣ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＣＣ　 Ｃ１０ ＴＧＴＡＴＴＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＣＡＡＧ
ＥＣＧ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＣＧ　 Ｃ１１ ＴＧＴＡＴＴＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＣＡＡＣ
ＥＣＴ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＣＴ　 Ｃ１２ ＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＡ
ＥＧＡ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＧＡ　 Ｃ１３ ＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＧ
ＥＧＣ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＧＣ　 Ｃ１４ ＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＣ
ＥＧＧ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＧＧ
ＥＧＴ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＧＴ
ＥＴＡ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＡ
ＥＴＣ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＣ
ＥＴＧ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＧ
ＥＴＴ　 ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＴ
·２２·
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　贵 州 农 业 科 学
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
１．５ ＰＣＲ扩增
１）预扩增。反应体系总体积为４０μＬ，包括：
２８．４μＬ　ｄｄＨ２Ｏ、４．０μＬ　１０×ＰＣＲ缓冲液 （不
含 Ｍｇ２＋）、３．２μＬ　２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２溶液、４．０μＬ
ｄＮＴＰ混合液 （每种碱基浓度均为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、
２．０μＬ　１０μｍｏｌ／Ｌ　ＥＯ （５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ－
３′）预扩增引物、２．０μＬ连接产物以及０．４μＬ
５Ｕ／μＬ　ｒＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶。ＰＣＲ循环参数为９４℃预
变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５６℃退火１ｍｉｎ，７２℃
延伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃再延伸７ｍｉｎ。扩增产
物用ｄｄＨ２Ｏ稀释２０倍后作为选扩增模板。
２）选扩增。反应体系总体积为２０μＬ，包括：
１０．２μＬ　ｄｄＨ２Ｏ、２．０μＬ　１０×ＰＣＲ缓冲液 （不
含 Ｍｇ２＋）、１．６μＬ　２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２溶液、２．０
μＬ每种碱基浓度均为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ混合
液、１．０μＬ　１０ μｍｏｌ／Ｌ　ＥｃｏＲⅠ 选 扩 增 引 物、
１．０μＬ　１０μｍｏｌ／Ｌ柑橘的ＬＴＲ引物、２．０μＬ已
稀释２０倍的预扩增产物以及０．２μＬ　５Ｕ／μＬ
ｒＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶。ＰＣＲ循环参数为９４℃预变性５
ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，６５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１
ｍｉｎ，１３个循环，其中，退火温度从第一个循环的
６５℃开始，以后１２个循环每个循环逐次降低０．
７℃；然后９４℃变性３０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延
伸１ｍｉｎ，３０个循环；最后７２℃延伸７ｍｉｎ。
１．６ ＰＡＧＥ检测
采用３．５％非变性ＰＡＧＥ检测选扩增产物多
态性。电泳条件为恒功率６０Ｗ电泳约７０ｍｉｎ。采
用简易银染［１８］方法进行银染，先用０．１％硝酸银
银染２０ｍｉｎ，然后单蒸水漂洗１０ｓ，再显影 （显影
液中ＮａＯＨ和甲醛质量分数为１．５％和０．３％）
３～５ｍｉｎ使ＤＮＡ条带清晰显现，再用单蒸水漂洗
１～２ｍｉｎ，最后自然晾干凝胶以进行图像扫描及分
析。
１．７ 标记筛选与验证
基于建立的 ＥｃｏＲＩ单酶切Ｓ－ＳＡＰ技术体系，
采用２８０个Ｓ－ＳＡＰ选扩引物组合 （表），对每种瓯
柑各取１个生物学样品选扩产物进行差异条带筛
选，对筛选的候选标记每种瓯柑各取３个生物学样
品重复进行验证确认。
２ 结果与分析
２．１ 瓯柑基因组ＤＮＡ提取产物
提取的瓯柑基因组ＤＮＡ产物，在琼脂糖凝胶
电泳后点样孔处无杂质残留 （图１），紫外分光光度
计检测Ａ２６０／Ａ２８０值均处于１．８～２．０，其纯度能够
满足试验需要；该瓯柑基因组ＤＮＡ产物，片段大于
２０ｋｂ，无降解，完整性也很好。因此，采用提取的
瓯柑基因组ＤＮＡ样品，可以用于Ｓ－ＳＡＰ标记分析。
２．２ 基于ＥｃｏＲ　Ｉ单酶切建立的Ｓ－ＳＡＰ技术体系
在建立的ＥｃｏＲ　Ｉ单酶切Ｓ－ＳＡＰ技术体系分析
中，酶切产物呈弥散分布，大小多集中在５００ｂｐ
以上 （图２ａ）；预扩产物多集中在２００～２　０００ｂｐ，
有数条明亮的条带 （图２ｂ）；选扩产物则主要集中
在１００～１　０００ｂｐ，也有数条明亮条带 （图２ｃ）。
　注：Ｍ１和 Ｍ２分别为λ－ＨｉｎｄⅢｄｉｇｅｓｔ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ和ＤＬ２０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ。样品１～３：青瓯柑植株１～３；样品４～６：普通瓯柑植株１
～３；样品７～９：无籽瓯柑植株１～３ （下同）。
　Ｎｏｔｅｓ：Ｍ１ａｎｄ　Ｍ２ａｒｅλ－ＨｉｎｄⅢｄｉｇｅｓｔ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ　ａｎｄ　ＤＬ２０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ（Ｔａｋａｒａ，Ｃｈｉｎａ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．１～３，ｇｒｅｅｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ
ｓａｍｐｌｅｓ；４～６，ｃｏｍｍｏｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｓａｍｐｌｅｓ；７～９，ｓｅｅｄｌｅｓｓ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂｅｌｏｗ．
图１ 瓯柑基因组ＤＮＡ提取产物１．０％琼脂糖凝胶电泳检测
Ｆｉｇ．１　１．０％ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍＣ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ
图２ 瓯柑Ｓ－ＳＡＰ标记酶切 （ａ）、预扩 （ｂ）和选扩 （ｃ）产物
　　　　　Ｆｉｇ．２　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ（ａ），ｐｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｂ）ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｃ）ｉｎ　Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ
ｂｙ　Ｓ－ＳＡＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ
·３２·
　张绍阳 等　基于Ｓ－ＳＡＰ标记技术的柑橘芽变新品系青瓯柑的鉴别
　ＺＨＡＮＧ　Ｓｈａｏｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒｅｅｎ　Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ（ａ　Ｎｅｗ　Ｂｕｄ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｌｉｎｅ　ｏｆ　Ｃｉｔｒｕｓ）Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｓ－ＳＡＰ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
　注：Ｍ３和 Ｍ４分别为ｐＢＲ３２２ＤＮＡ－Ｍｓｐ　Ｉ　ｄｉｇｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ和ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ　５０ｂｐ　Ｌａｄｄｅｒ；样品１～３：青瓯柑植株１～３；样品４～６：普
通瓯柑植株１～３；样品７～９：无籽瓯柑植株１～３。Ｃ１２和ＥＡＴ引物序列分别为５′－ＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡＡ－３′和５′－ＧＡＣＴＧＣＧ－
ＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴ－３′。
　Ｎｏｔｅｓ：Ｍ３ａｎｄ　Ｍ４ａｒｅ　ｐＢＲ３２２ＤＮＡ－Ｍｓｐ　Ｉ　ｄｉｇｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ａｎｄ　ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ　５０ｂｐ　Ｌａｄｄｅｒ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．１～３，ｇｒｅｅｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｓａｍ－
ｐｌｅｓ；４～６，ｇｏｍｍｏｎ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｓａｍｐｌｅｓ；７～９，ｓｅｅｄｌｅｓｓ　Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ　ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃ１２ａｎｄ　ＥＡＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｒｅ　５′－ＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡ－
ＣＡＡ－３′ａｎｄ　５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴ－３′ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图３ 瓯柑Ｃ１２／ＥＡＴ引物组合选扩产物３．５％非变性ＰＡＧＥ电泳图谱
　　　　　Ｆｉｇ．３　３．５％ｎｏｎ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ＰＡＧＥ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｃ１２／ＥＡＴ　ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ
２．３ 青瓯柑特异Ｓ－ＳＡＰ标记筛选
筛选出一个特异于青瓯柑的Ｓ－ＳＡＰ标记，产生
该标记的选扩引物组合为Ｃ１２和ＥＡＴ （表），该引
物组合选扩产物在３．５％非变性ＰＡＧＥ胶上形成约
２０个Ｓ－ＳＡＰ选扩产物片段，其中有１条长约２６０ｂｐ
的Ｓ－ＳＡＰ标记片段为青瓯柑特有 （图３）。该Ｓ－ＳＡＰ
标记稳定，经多次重复 （包括在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ＡＧ　６３２１
和Ｂｉｏ－ＲＡＤ　Ｃ１０００ＴＭ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　２种型号ＰＣＲ
仪上重复），其都能够稳定重复出现。
３ 结论与讨论
在本研究中，应用经典的双酶切Ｓ－ＳＡＰ技术
未能获得特异条带，而应用基于ＥｃｏＲ　Ｉ单酶切的
Ｓ－ＳＡＰ技术体系则成功获得１条长约２６０ｂｐ的青
瓯柑特异条带，究其原因与基因组ＤＮＡ酶切方式
有关。Ｓ－ＳＡＰ多态性标记片段来源于ＬＴＲ （Ｌｏｎｇ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｒｅｐｅａｔｓ，长末端重复序列）逆转座子
插入位点相近的酶切识别位点、选择性碱基结合位
点及ＬＴＲ引物结合位点等几种突变［８］，ＥｃｏＲ　Ｉ和
Ｍｓｅ　Ｉ酶切识别位点分别是由６个和４个碱基组
成，而单个ＥｃｏＲ　Ｉ酶切识别位点的突变概率是单
个 Ｍｓｅ　Ｉ酶切识别位点的１６倍。因此，基于ＥｃｏＲ
Ｉ单酶切Ｓ－ＳＡＰ技术体系是经典Ｓ－ＳＡＰ技术体系
的有效补充，可增加芽变材料得到鉴别的可能性。
研究获得的Ｓ－ＳＡＰ标记为青瓯柑属于普通瓯
柑芽变提供有力的遗传学证据，也可为青瓯柑以后
品种审定、种苗鉴别和新品种推广提供便利，同时
基于ＥｃｏＲ　Ｉ单酶切的Ｓ－ＳＡＰ标记技术体系可为其
他果树上的同类工作提供借鉴。Ｓ－ＳＡＰ标记技术
包括酶切、连接、预扩增、选择性扩增及ＰＡＧＥ
电泳和银染等步骤，操作相对繁琐。因此，通常期
望能将相应标记转化为ＳＣＡＲｓ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｃｈａｒａｃ－
ｔｅｒｉｚｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｒｅｇｉｏｎｓ，序列特异扩增区）标
记，以更方便应用［１９］。研究还对获得Ｓ－ＳＡＰ标记
进行了ＳＣＡＲｓ标记转化的尝试，但尚未成功。从
先前报道可知，各类标记，如 ＲＡＰＤ （Ｒａｎｄｏｍ
Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ，随机扩增多态性
ＤＮＡ）和 ＡＦＬＰ （Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，扩增片段长度多态性）等，实现
ＳＣＡＲｓ标记转化的成功率往往不高，与序列本身
特征等有关［２０］。研究获得的Ｓ－ＳＡＰ标记条带清
晰，重复性好，仍可直接应用于生产和研究。
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·５２·
　张绍阳 等　基于Ｓ－ＳＡＰ标记技术的柑橘芽变新品系青瓯柑的鉴别
　ＺＨＡＮＧ　Ｓｈａｏｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒｅｅｎ　Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ（ａ　Ｎｅｗ　Ｂｕｄ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｌｉｎｅ　ｏｆ　Ｃｉｔｒｕｓ）Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｓ－ＳＡＰ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ