全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 10期，第 2274-2279页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.10, 2274-2279
研究报告
Research Report
利用番茄果实特异启动子 E8改造‘外源基因清除’的表达载体及转化金
柑研究
谢玉明 1,2 李益 1,2 严佳文 1,2 姚润贤 1,2 Alessandra Gentile 1,2 邓子牛 1,2*
1湖南农业大学园艺园林学院,长沙, 410128; 2国家柑橘改良中心长沙分中心,长沙, 410128
*通讯作者, deng7009@163.com
摘 要 利用“外源基因清除”技术(‘Gene-Deletor’)，将外源基因从转基因金柑果实中彻底清除，可以达到
用转基因作物生产出非转基因食品的目的。本研究利用引物 pE8F和 pE8R从樱桃番茄中克隆果实特异启
动子 E8，通过 SalⅠ和 SmaⅠ双酶切置换掉“外源基因清除”载体(pCambia-LF-polseed-FLP, 简称 Y-A)中的
花粉、种子特异启动子 PAB5，重新构造“外源基因清除”载体 Y-A-E8，利用农杆菌 EHA105介导转化实生
态金柑，获得转化植株，并通过 nptⅡ基因特异引物 nptⅡ-F和 nptⅡ-R PCR检测阳性转化植株。载体
Y-A-E8 SalⅠ和 SmaⅠ双酶切结果表明，E8启动子成功替换启动子 PAB5，Y-A-E8经 EHA105介导转化成
功获得 11株转化植株且 PCR检测到 6株为 Y-A-E8转基因植株。研究结果可为“外源基因清除”技术在转
基因金柑方面的应用提供参考。
关键词 “外源基因清除”技术,果实特异启动子 E8,载体改造,金柑,遗传转化
Modification of‘Gene-Deletor’Vector with Tomato Fruit-specific Promoter
E8 and Transformation of Kumquat
Xie Yuming 1,2 Li Yi 1,2 Yan Jiawen 1,2 Yao Runxian 1,2 Alessandra Gentile 1,2 Deng Ziniu 1,2*
1 College of Horticulture and Landscape, HNAU, Changsha, 410128; 2 Changsha Branch of National Citrus Improvement Centre, Changsha,
410128
* Corresponding author, deng7009@163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.013.002274
Abstract In order to solve the edible safety problem of transgenic kumquat and get the non-genetic food from
transgenetic crop, the foreign genes were removed from the fruit of the transgenic kumquat by using‘gene-deletor’
technology which has been proven effectively in some transgenetic plants. Here, we cloned fruit specific promoter
E8 from tomato and modified ‘gene-deletor’vector with E8 promoter, in which E8 promoter replace PAB5
promoter to drive recombinase FLP gene, CaMV35S promoter to drive report and selecting gene GUS::NPTⅡ. The
seedling internode stem segments of kumquat (Fortunella crassifolia Swingle cv. Jindan) were transformed with the
‘gene-deletor’vector mediated by Agrobacterium tumefaciens. We obtained 11 resistant plants and 6 transformed
plants confirmed by PCR analysis. The transformed plants will be tested for the gene-deletor function later on. The
improvement application of‘gene-deletor’technology in kumquat provided an alternative for citrus safety transgenic
research.
Keywords ‘Gene-Deletor’vector, E8 promoter, Vector modification, Kumquat, Genetic transformation
基金项目：本研究由国家自然青年基金项目(31201596)和湖南省科技计划项目(2014NK3014)共同资助
随着转基因植物的商业化，其安全性问题已引
起了公众的普遍担忧，严重制约了转基因技术成果
的推广和应用。“外源基因清除”技术(‘Gene-Dele-
tor’)是由美国康涅狄格大学李义教授领衔的研究团
图 1番茄果实特异启动子 E8的 PCR扩增结果
注: M: Trans 5K DNA marker; 1: E8启动子 PCR产物
Figure 1 PCR amplification of tomato fruit specific promoter E8
Note: M: Trans 5K DNA marker; 1: PCR product of E8 promoter
图 2阳性克隆的 PCR鉴定
注: M: Trans 5K DNA marker; 1,3,5,6,8,9: 阳性克隆; 2,4,7:阴
性克隆
Figure 2 PCR testing of cloning product
Note: M: Trans 5K DNA marker; 1,3,5,6,8,9: Positive clones;
2,4,7: Negative clones
图 3载体酶切鉴定图谱
注: A:载体 pEASY-T5-E8酶切鉴定; B:载体 Y-A酶切鉴定;
C: Y-A-E8 载体酶切鉴定 ; M: Trans 5K DNA marker; 1:
pEASY-T5-E8质粒; 2:酶切后 pEASY-T5-E8质粒; 3: Y-A质
粒; 4:酶切后 Y-A质粒; 5: Y-A-E8载体; 6:酶切后 Y-A-E8载
体质粒
Figure 3 Map of vectors digestion
Note: A: Identification of pEASY-E8 vector; B: Identification of
Y-A vector; C: Identification of Y-A-E8 vector; M: Trans 5K
DNA marker; 1: pEASY-T5-E8 vector; 2:pEASY-T5-E8 vector
digested by SalⅠ and SmaⅠ; 3: Y-A vector; 4: Y-A vector di-
gested by SalⅠ and SmaⅠ; 5: Y-A-E8 vector; 6: Y-A-E8 vector
digested by SalⅠ and SmaⅠ
队发明的一种位点特异性重组酶系统的改进技术
(赵德刚等, 2008)。它为解决转基因植物的安全性问
题提供了一条目前最为有效的途径。该技术的基本
原理是利用组织特异性启动子(如花粉,种子特异启
动子 PAB5)与重组酶基因融合，使得外源基因只在
转基因植物的特异组织器官(如花或种子)中被删除，
从而达到防止外源基因逃逸的目的，解决转基因植
物环境安全问题。而转基因植株的其他器官由于没
有组织特异启动子来调控重组酶基因对外源基因进
行删除，因此外源基因会继续发挥其优良功能(张茜
等, 2011)。该技术可以从根本上解决转基因植物的
外源基因逃逸问题和食品安全性问题。利用该技术
可以全部删除转基因烟草花粉和种子中的外源基
因，从而解决了外源基因飘移带来的环境安全问题，
并且外源基因删除效率大幅度地提高，可达到 100%
(Luo et al., 2007)。
桂林金柑(Fortunella crassifolia Swingle cv. Jindan)
是芸香科金柑属植物优良品种之一，一年能多次开
花结果，鲜食营养价值高，又可加工及观赏，是颇具
特色的水果(杨莉, 2012)。为了解决转基因金柑果实
的食用安全性问题，在本课题组前期已引进“外源基
因清除”技术(非专利技术)基础上，本研究拟从番茄
中克隆果实特异启动子 E8，置换“外源基因清除”载
体中的花粉、种子特异启动子 PAB5，并转入实生态
金柑中，获得了转基因株系，以期为“外源基因清除”
技术在柑橘上的应用提供理论依据和参考。
1结果与分析
1.1番茄果实特异启动子 E8的克隆与测序
取樱桃番茄幼苗叶片，利用 CTAB法提取樱桃
番茄基因组 DNA并作为模板，利用特异引物 pE8F
和 pE8R进行 E8启动子的 PCR扩增，得到 2 200 bp
左右的条带(图 1)，与目标片段大小一致，回收目标
条带，用于下一步构建植物表达载体的研究。
将 PCR扩增产物连接到 pEASY-T5克隆载体上
并克隆测序。菌落 PCR鉴定阳性(图 2)，鉴定的 9个
单菌落有 6个 PCR 扩增片段大小为 2 200 bp 左右
为阳性克隆，随机挑取 3个阳性菌落测序。测序结果
序列和 NCBI数据库上的 E8启动子序列比对结果
为 100%同源。结果表明从樱桃番茄中成功克隆得到
E8 启动子。将含有 E8 启动子的克隆载体命名为
pEASY-T5-E8。
1.2 Y-A-E8 重组质粒的构建
含有 E8启动子的克隆载体 pEASY-T5-E8以限
制性内切酶 SalⅠ和 SmaⅠ双酶切(图 3A)，可见约 4 kb
和 2 kb条带，与 pEASY-T5和 E8启动子大小一致；
利用番茄果实特异启动子 E8改造‘外源基因清除’的表达载体及转化金柑研究
Modification of‘Gene-Deletor’Vector with Tomato Fruit-specific Promoter E8 and Transformation of Kumquat 2275
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 4农杆菌 EHA105阳性克隆的 PCR鉴定
注: M: Trans 5K DNA marker; 1,2,3,4:阳性克隆; 5:阴性克隆
Figure 4 PCR testing of cloning product
Note: M: Trans 5K DNA marker; 1,2,3,4: Positive clones; 5:
Negative clones
图 5抗性芽的诱导
Figure 5 Culture of resistant buds
图 6抗性芽试管嫁接
Figure 6 In vitro grafting of resistant buds
图 7温室二次嫁接
Figure 7 Two times the greenhouse grafting
“外源基因清除载体”Y-A以限制性内切酶 SalⅠ和
SmaⅠ双酶切(图 3B)，可见约 15 kb和 2.2 kb条带，
与 Y-A质粒去除 PAB5启动子和 PAB5启动子大小
一致；酶切产物分别电泳后，回收 Y-A质粒切除
PAB5启动子后的线状质粒以及 pEASY-T5-E8质粒
中切下的 E8启动子片段，在 T4 DNA连接酶作用下
将 E8启动子片段连接到无 PAB5启动子的 Y-A载
体中，连接产物转化 DH5α感受态细胞参考，鉴定阳
性克隆并提质粒，对所提质粒进行双酶切鉴定(图 3C)，
酶切结果中得到大小分别为 15 kb和 2 200 bp左右
的片段，与目标条带大小一致。酶切结果表明，已成
功将果实特异启动子 E8置换了外源基因清除载体
Y-A中的花粉、种子特异启动子 PAB5，并将构建的
“重组外源基因清除载体”命名为Y-A-E8。
1.3农杆菌 EHA105的转化和 PCR鉴定
将重组载体 Y-A-E8通过热激法转化至农杆菌
EHA105感受态细胞中，在固体培养基上(LB+50mg/mL
Kan)进行筛选，培养 2 d后，随机挑取单克隆进行菌
落 PCR鉴定(图 4)，5个鉴定菌落中 4个扩增片段大
小为 2 200 bp，表明这 4个克隆重组载体 Y-A-E8成
功转化至农杆菌 EHA105中，并用终浓度 15%甘油
-80℃低温保存。
1.5转化植株的 PCR检测
分别对转化植株提取总 DNA，以未转基因植株
作阴性对照，Y-E质粒作阳性对照，对 nptⅡ基因用
特异引物 nptⅡ-F 和 nptⅡ-R 进行 PCR 扩增检测
(图 8)，其中 6株转基因金柑植株和阳性对照质粒
Y-E均扩增出 nptⅡ的特异条带，而阴性对照未转基
因植株未扩增出特异条带，PCR结果表明改造的“外
源基因清除”载体已整合到金柑的基因组中。
2讨论
番茄果实特异性启动子 E8是目前研究较多的
果实特异启动子，并且已经在多种作物的基因工程
中得到成功应用(王玉霞等, 2008;贺红霞等, 2014)。
1.4转基因 Y-A-E8金柑植株的获得
以金柑35 d龄实生苗上胚轴作为转化材料，上
胚轴经农杆菌工程菌液侵染后，在共培培养基上暗
培养 3 d，然后转移到筛选培养基上进行选择培养
14 d，上胚轴开始分化出抗性芽，抗性芽在筛选培养
基上培养 28 d后，生长健壮，叶片展开(图 5)，将抗性
芽嫁接于 14 d的枳橙试管苗上再生成苗(图 6)。一个
月后进行温室二次嫁接(图 7)，共获得 11株转化植
株。目前转化植株在温室中生长良好。
2276
利用番茄果实特异启动子 E8改造‘外源基因清除’的表达载体及转化金柑研究
Modification of‘Gene-Deletor’Vector with Tomato Fruit-specific Promoter E8 and Transformation of Kumquat
图 8转化植株的 PCR检测结果
注: M: 100 bp DNA ladder marker; 1~6:转基因株系;－:非转
基因对照; +:质粒 DNA
Figure 8 PCR analysis of transformed plants
Note: M: 100 bp DNA ladder marker; 1~6: transformed plants;
－: Non-transgenic plant; +: Plasmid DNA
图 9“外源基因清除”载体的 T-DNA区域
Figure 9 Diagram of T-DNA region of‘Gene-Deletor’vector
Deikman 和 Fischer (1988)及 Deikman 等(1992)对番
茄果实特异性启动子 E8进行了系统的研究。郭淑华
等(2007)研究证实了果实特异启动子 E8P1调控外源
基因在转基因番茄果实中特异表达。Sandhu 等
(2000)研究也证实了果实特异性启动子 E8能有效调
控果实中外源基因表达。基于前人的研究基础，本研
究从番茄中克隆了果实特异启动子 E8，利用 E8启
动子对‘Gene-Deletor’载体进行改造，置换其中的花
粉、种子启动子 PAB5，其目的是使外源基因在转基
因金柑果实中行使完功能后，果实特异启动子 E8启
动子驱使重组酶基因 FLP表达，从而删除果实中所
有外源基因，以解决转基因金柑的食用安全性问题，
而其它器官中由于没有果实特异启动子 E8来调控
这一套删除反应，外源基因继续留在这些器官中发
挥作用。本研究将番茄果实特异启动子 E8应用于柑
橘基因工程育种，该启动子在转基因金柑中对外源
基因表达的调控功能及作用，以及在转基因金柑果
实发育过程中外源基因的清除效果情况，本课题组
还在继续深入研究。
3材料与方法
3.1植物材料
以樱桃番茄(Lycopersivon esculentum Mill.)为克
隆 E8 启动子的实验材料，以桂林金柑(Fortunella
crassifolia Swingle cv. Jindan)的实生苗为转基因的受
体材料。番茄种子购自湖南省农业科学院蔬菜研究
所，桂林金柑果实购自红星水果批发市场。
3.2菌株、质粒与试剂
大肠杆菌 DH5α感受态细胞、凝胶纯化回收试
剂盒与质粒提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有
限公司；根癌农杆菌 EHA105感受态细胞由本实验
室保存；pEASY-T5克隆载体(长度为 3 953 bp)、限制
性内切酶 SalⅠ和 SmaⅠ、T4 DNA连接酶购自北京
全式金生物技术有限公司；其他化学试剂均为进口
或国产分析纯；实验所用引物以及测序由上海博尚
生物技术有限公司完成。
“外源基因清除”载体由美国康涅狄格大学李义
教授惠赠。该载体采用 pCambia-LF-polseed-FLP质
粒，在其 T-DNA 序列中，花粉、种子特异性启动子
PAB5驱动重组酶 FLP基因，35S启动子驱动 gus:nptⅡ
融合基因，还包含两个融合重组位点 LF (LoxP:
FRT)。转基因株系在外源基因发挥作用后，通过花粉
和种子特异性启动子 PAB5来调控重组酶基因 FLP
的表达，并驱动两个融合识别位点之间的序列将转基
因株系的花粉和种子中的外源基因全部清除(图 9)。
3.3 番茄基因组 DNA 的提取及果实特异启动子 E8
的克隆
参考 Deikman 和 Fischer (1988)及 Deikman 等
(1992)报道的番茄果实特异启动子 E8序列(GenBank:
X13437)，设计特异引物 pE8F 和 pE8R (pE8F:
5-CGGGATCCTCCCTAATGATATTGTTCATG-3,
下划线为 SmaⅠ酶切位点; pE8R: 5-GCGTCGACTC
TTTTGCACTGTGAATGAT-3,下划线为 SalⅠ酶切
位点)，用于 PCR扩增。
采用 CTAB法提取樱桃番茄子叶基因组 DNA
(王关林和方宏筠, 2002)。以樱桃番茄的总 DNA作为
模板，pE8F 和 pE8R 为特异引物进行 PCR 扩增，
PCR 反应条件：94℃ 4 min；94℃ 1 min，55℃ 30 s，
72℃ 2 min，30个循环；72℃ 8 min。PCR产物凝胶电
泳并割胶回收纯化目标产物；利用 TA克隆方法将回
收纯化的目标片段连接到克隆载体 pEASY-T5上构
建重组克隆载体，转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，
LB固体培养基(含终浓度 100 mg/L氨苄青霉素) 37℃
过夜培养后挑取 10个菌落进行菌落 PCR，鉴定的阳
性克隆选取 3 个送上海博尚生物技术有限公司测
序，测序结果在 NCBI数据库上通过 Blast进行 E8
启动子同源性比对。
3.4重组质粒的构建
对外源基因清除载体 pCambia-LF-polseed-FLP
2277
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
(Y-A)进行改造，将 Y-A载体中的花粉、种子特异启
动子 PAB5 置换成果实特异启动子 E8，得到载体
Y-A-E8。分别以限制性内切酶 SalⅠ和 SmaⅠ对 Y-A
载体和克隆载体 pEASY-T5-E8进行双酶切，酶切产
物凝胶电泳后，分别回收 Y-A质粒酶切 PAB5启动
子后的线状质粒和重组克隆载体上酶切后的 E8启
动子片段，回收的产物在 T4 DNA连接酶作用下，
16℃过夜连接，连接后转化 DH5α感受态细胞并在
LB固体培养基(含终浓度 50 mg/L卡那霉素)上 37℃
过夜培养；挑取单克隆提取质粒，双酶切鉴定阳性克
隆质粒。
3.5农杆菌 EHA105的转化和 PCR鉴定
农杆菌 EHA105感受态的制备及转化，参考王
关林和方宏筠(2002)的方法，并使用 pE8F、pE8R 引
物进行菌落 PCR鉴定。阳性克隆菌液加入终体积为
15%的甘油，保存于超低温冰箱中。
3.6遗传转化
实生态金柑的遗传转化方法在参照前人(Yang
et al., 2007)的基础上进行了改进。从金柑果实中取出
饱满种子，在超净工作台上剥去外种皮后，75%酒精
消毒 30 s，无菌水冲洗后，1%次氯酸钠溶液消毒
20 min，无菌水再次冲洗后，剥去内种皮，然后播种
于含MS基本培养基的试管中，每管 3粒。培养温度
为(26±1)℃，先暗培养 25 d，光照 10 d后取 35 d苗龄
实生苗节间茎段(1 cm左右)为转化外植体，放置于
农杆菌重悬液(含 100 μmol/L AS, OD600=0.5)中侵染
30min，在无菌滤纸上吸去多余菌液，置于共培养基
(MS+2mg/L6BA+1mg/LNAA+1mg/LKT+100μmol/L
AS)中暗培养 3 d，然后转入筛选培养基(MS+3 mg/L
6BA+50 mg/L Kan+400 mg/L Cef)中进行选择培养，
抗性芽通过试管微芽嫁接再生成苗，试管苗进行温
室二次嫁接。
3.7转基因植株的 PCR鉴定
3.7.1 DNA的提取
以金柑植株的嫩叶为材料，参照 Yang等(2011)
的 CTAB法提取总 DNA。
3.7.2 PCR分子检测
以 nptⅡ基因为 PCR检测目标基因，nptⅡ基因
特异性引物为：nptⅡ-F：5-TCTTTTTGTCAAGACC-
GACC-3，nptⅡ-R：5-GCCACAGTCGATGAATCC-
3，扩增产物为 493 bp。PCR反应体系为 25 μL：1×
PCR Buffer，dNTPs 0.2 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，
引物 0.5-mol/L，Taq酶 1.5 U，模板 50~100 ng。反应
条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1.5 min，
35个循环；72℃ 10 min，4℃保存；检测对象材料为转
基因金柑植株嫩叶，以 Y-E质粒为阳性对照，同时以
未转基因金柑植株嫩叶为阴性对照，所得 PCR产物
经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果。
作者贡献
谢玉明是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，并完成论文的初稿工作；李益和严佳文参与实验
研究的部分工作；姚润贤和 Alessandra Gentile参与
实验结果分析及论文修改；邓子牛是项目的构思者
及负责人，指导实验设计，论文写作与修改。全体作
者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然青年基金项目(31201596)和湖
南省科技计划项目(2014NK3014)共同资助。感谢美国
康涅狄格大学李义教授提供“外源基因清除”载体。
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利用番茄果实特异启动子 E8改造‘外源基因清除’的表达载体及转化金柑研究
Modification of‘Gene-Deletor’Vector with Tomato Fruit-specific Promoter E8 and Transformation of Kumquat
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