全 文 ：　湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES） 2015年 8月　
4· · 农业生物技术　
2015，(8)：4-7
在真核生物细胞核中，染色质是由 DNA 和组蛋
白一起被压缩成一个高度有序的结构，以核小体为基
本结构单位。由 146 bp 的 DNA 围绕一个八聚体的组
蛋白（两分子的 H2A-H2B 二聚体，两分子的 H3 和
两分子的 H4）形成核小体的核心结构，核小体之间
由组蛋白 H1 与 DNA 结合，并经过进一步的折叠缠
绕及自我组装形成染色质高级结构 [1-4]。然而，高度
致密的染色质结构会影响 DNA 的复制、重组、链裂
解、转录和修复等 [5-7]，调节染色质的结构是真核基
因表达调控的关键步骤。在染色体水平上研究蛋白质
与 DNA 的相互作用过程能有效地反映体内蛋白质调
控基因表达的真实状况。
序 列 特 异 性 DNA 结 合 蛋 白（Sequence-specific
DNA binding proteins) 能与 DNA 上特定的靶位点相互
作用，从而在基因的表达和 DNA 复制、重组等过程
中进行调控，与细胞周期中染色体的一系列变化相
关，包括组蛋白、转录因子、单链结合蛋白、解链酶、
DNA 聚合酶以及 RNA 聚合酶等 [8]。吕湘等 [9] 研究表
明，DNA 结合蛋白与 DNA、组蛋白先形成复合物，
再通过招募染色质重塑复合物，可引起染色质重塑，
而应用不同的组装因子也可将 DNA 模板组装成适当
的染色质结构 [10]。
本研究通过提取真核细胞 DNA 结合蛋白，与基
因组 DNA 相互作用，建立起无细胞的染色质体外组
装，以期为进一步研究如何改变染色体空间构象和引
起基因的激活或抑制转录提供理论基础。
1　材料与方法
1.1　试材的处理
挑选长势相近的 1 年生金柑（Fortunella margarita
(Lour.) Swingle），摘取叶片若干，保存于－ 80℃超低
温冰箱中，备用。
1.2　方法
　DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.08.002
金柑DNA结合蛋白的分离及染色质体外组装研究 
李梦芸 1，李光锋 1,2，杨　华 1，黎子云 1，吴小平 1，饶力群 1
（1. 湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128；2. 湖南食品药品职业学院，湖南长沙
410208）
摘　要：为了研究 DNA 与 DNA 结合蛋白的相互作用，以及无细胞的染色质体外组装过程，从金柑叶片中提取总 DNA，利用微晶纤维素得到
DNA- 纤维素层析配体，经 DNA- 纤维素层析分离得到 DNA 结合蛋白，再将纯化的 DNA 和 DNA 结合蛋白在低盐条件下按一定比例混合，并
进行电镜观察。结表表明，该混合物产生絮状沉淀，电镜观察发现念珠状的小黑圆点，因此推测 DNA 和 DNA 结合蛋白发生互作，可能形成核
小体引起染色质体外组装。
关键词：金柑；DNA 结合蛋白；纤维素层析；体外组装
中图分类号：S666　　　　　文献标识码：A　　　　　　文章编号：1006-060X（2015）08-0004-04
 Separation of Kumquat DNA-Binding Proteins and Chromatin Assembly in Vvitro
LI Meng-yun1，LI Guang-feng1,2，YANG Hua1，LI Zi-yun1，WU Xiao-ping1，RAO Li-qun1
（1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC;
2. Hunan Food and Drug Vocational College, Changsha 410208, PRC）
Abstract：In order to study the interaction between DNA and DNA-binding proteins, an acellular system of chromatin assembly in
vitro was established. The total DNA of kumquat leaves were extracted, the DNA-cellulose chromatography ligand was obtained with
the microcrystalline cellulose, and then DNA-binding proteins were isolated through the DNA- cellulose chromatography. Finally, the
purified DNA and DNA-binding proteins were mixed at a certain proportion under low salt conditions and then observed with electron
microscopy. The results showed that the mixture produced flocculent precipitates, and beaded little black dots were found out by the
electron microscopy. It indicated that DNA and DNA-binding proteins had interactions, which might lead to the formation of nucleosomes
and cause chromatin assembly in vitro.
Key words：kumquat; DNA-binding protein; cellulose chromatography; assembly in vitro
收稿日期：2015-06-25
基金项目：国家自然科学基金 (No. 31200963)；湖南省教育厅优秀青
年项目（No.13B046）；湖南省科技计划项目（No. 2009NK3096）；
湖南省教育厅科学研究项目（No.13C576）
作者简介：李梦芸（1988-），女，湖南双峰县人，硕士研究生，研
究方向：植物抗逆生物化学；并列第一作者：李光锋（1964-），男，
湖南宁远县人，博士研究生，研究方向：植物抗逆生物化学。
通讯作者：杨　华，饶力群
5· ·
李梦芸 等：金柑 DNA结合蛋白的分离及染色质体外组装研究
农业生物技术　
1.2.1　金柑叶片蛋白质的提取　用液氮将 30 g 金
柑叶片研磨成粉末 ；加入 100 mL 蛋白质提取液 [20
mmol/L Hepes (pH 值 7.5)，1.5 mmol/L MgCl2，0.4 mol/
L NaCl，0.2 mmol/L EDTA，25 ％ 甘 油，0.5 mmol/L
DTT，0.2 mmol/L PMSF]，充分混匀 ；4℃条件下浸提
2 h，12 000 r/min 离心 20 min ；上清液即为金柑叶片
蛋白质溶液。
1.2.2　DNA-纤维素层析分离 DNA结合蛋白　将层
析管中装入纤维素晶粉固定的双链化 DNA，先用 0.1
mol/L NaCl 溶液平衡 ；再用 5 mL 金柑叶片蛋白质溶
液上柱，仍用 0.1 mol/L NaCl 溶液洗脱；待洗净杂质后，
改用 1 mol/L NaCl 溶液洗脱。按 2 mL 每管进行收集，
同时用紫外可见分光光度计测定吸光度，直至流出液
的吸光度回归基线，将洗脱获所得的 DNA 结合蛋白
混合备用 [11-12]。
1.2.3　蛋白质 SDS-PAGE电泳　蛋白质样品和 DNA
结合蛋白混合样品均加入 5 倍样品缓冲液中混匀，沸
水浴 5 min，离心并等量点样，采用 4％浓缩胶及
12.5％分离胶进行不连续垂直平板电泳，扫描拍照，
使用 PDQuest 1-D 软件对图像进行分析处理。
1.2.4 DNA结合蛋白的酶解及质谱鉴定 参照考王鸿
丽 [13] 和廖翔 [14] 的研究方法进行。
1.2.5　染色质体外组装　取 1.2.2 中经 1 mol/L NaCl 洗
脱收集得到的蛋白质溶液 1 mL，加入浓度 OD260 为
10 的金柑叶片 DNA 溶液 50 μL，温和混匀，4℃静
置 3 h，再加入 9 mL 0.01 mol/L 的 EDTA 溶液，温和
混匀，4℃静置，并观察直至絮状的沉淀出现，用双
蒸 H2O 分散少量沉淀并滴加到铜网上，待水分晾干后，
使用投射电镜观察并拍照。
2  结果与分析
2.1 DNA- 纤维素层析制备 DNA 结合蛋白
先用 0.1 mol/L NaCl 溶液洗涤杂蛋白，从第 8 管
起出现紫外吸收峰，至第19管出现最大紫外吸收峰值，
其后出现 2 个吸收峰，第 48 管后，其紫外吸光度低
于 0.001，持续洗脱到第 100 管，其紫外吸光度均低
于0.001。再更换1 mol/L NaCl溶液洗脱DNA结合蛋白，
从第 107 管起出现紫外吸收峰，至第 113 管出现第一
个峰，此后出现几个未分开的吸收峰，到第 135 管后
紫外吸光度低于 0.001，为确保 DNA 结合蛋白洗脱干
净，持续使用 1 mol/L NaCl 溶液洗脱至第 170 管，其
紫外吸光度均低于 0.001。将 DNA 结合蛋白和杂蛋白
洗脱峰面积分别积分，其积分比约为 1 ∶ 9（图 1）。
2.2 SDS-PAGE 分析 DNA 结合蛋白
从图 2 可以看出，经过 DNA- 纤维素层析得到的
DNA 结合蛋白条带明显比总蛋白条带要少，是因为
总蛋白中一些低丰度的蛋白得到了富集，而大部分高
丰度的蛋白得以去除，DNA 结合蛋白相对分子质量
基本上小于 974 000，是以小分子量的蛋白为主。
图 1　DNA-纤维素层析分离金柑叶片 DNA结合蛋白的洗脱
曲线
图 2　总蛋白的 SDS-PAGE分析及 DNA结合蛋白的
DNA-纤维素层析分离
（1~3 泳道为总蛋白；4~6 泳道为 DNA- 纤维素层析分离的 DNA 结合蛋白）
2.3　DNA 结合蛋白的质谱鉴定
将 DNA- 纤维素层析获得的蛋白质样品利用 LC-
MS/MS 分析，共获得 2 062 个肽段的信息，经检索鉴
定得到 28 个同源蛋白（表 1）。这些蛋白包括组蛋白、
磷酸激酶、RNA 合成相关的蛋白及一些功能未知的
蛋白质等。
2.4　染色质体外组装
将金柑叶片的 DNA 与 DNA 结合蛋白在高盐的
条件下混合，通过 10 倍稀释法使盐浓度降低，在稀
释过程中发现溶液中逐渐出现絮状沉淀，随着絮状沉
淀增多，絮状沉淀慢慢地靠拢聚集形成马尾状（图 3）。
挑取少量马尾状沉淀，用双蒸 H2O 分散，再通
过透射电镜下观察，发现沉淀物有如植物根系般，盘
根错节，进一步发现在某些主链上有许多的分支，而
这些主链和分支均是由一些球状体连接而成（见图 4）。
在染色质体外组装体系中，成分有 DNA、蛋白
质以及无机盐（以 NaCl 为主）。显然，单独的纯的
DNA 或蛋白质，亦或是无机盐都不会在稀释的过程
0.20
0.18
016
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
吸
光
度
（
28
0
nm
）
0.1 mol/L NacI 1 mol/L NacI
更换洗脱液
洗脱管数
1 21 41 61 81 101 121 141
974 000
662 000
430 000
310 000
201 000
144 000
Marker 1 2 3 4 5 6
　湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES） 2015年 8月　
6· · 农业生物技术　
图 3　DNA与 DNA结合蛋白体外重建染色质
图 4　体外组装的染色质的电镜观察
中产生沉淀，因此，沉淀的出现极可能是 DNA 和
DNA 结合蛋白相互作用形成了 DNA-DNA 结合蛋白
复合物。据赵忠亮等 [10] 提出的 4 种体外染色质组装
体系方法中，有一种为利用组蛋白转运媒介物（如 ：
盐浓度透析、组蛋白结合蛋白等），形成组蛋白体系，
此体系可产生规范的核小体，但是形成的核小体分布
却不规则。因此，图 4 中如念珠状的小黑圆点极可能
是核小体，进而推测 DNA 和 DNA 结合蛋白互作发
生了染色质体外组装现象。
3　结论与讨论
所有在真核细胞中发生的如转录、复制、重组以
及修复等生命过程，都需要染色质的参与。赵忠亮等
[10] 研究表明，高度包装的染色质是无法进行转录的，
而在转录延伸的过程中，染色质必须经过解体才能完
成转录，这就存在一个问题，即 ：蛋白质是如何涉足
解体后的染色质的重新组装？而最早研究体外染色质
的重新组装是在生理条件下依赖爪蟾卵母细胞的提取
物，这些提取物富含酸性蛋白、核质蛋白以及组蛋白
等，它们能有序地结合到 DNA 上，装配成有一定空
间距离的多核小体，进而组装成染色质 [15]。Monique
Barat [12] 的研究表明，利用 DNA 纤维素层析的 DNA
结合蛋白能与爪蟾卵母细胞的线粒体 DNA 在低盐条
件下按约 1 ∶ 1 的比例结合形成如念珠状的核小体染
色质。
本研究中利用纯化的基因组 DNA 和 DNA 结合
蛋白进行了染色质的体外组装，结果表明二者可以发
生相互作用，产生沉淀，通过电镜观察到类似念珠
状的核小体。这一方面说明能有效采用 DNA- 纤维素
层析方法获取得到 DNA 结合蛋白 ；另一方面也说明
DNA 与 DNA 结合蛋白也可以发生相互作用，组装
成类似分布不规则的核小体，仍需进一步确认染色质
是否重建。现代技术能在染色质包装的核小体水平上
对转录的启动和延伸进行相关的生化与分子方面的研
究，若能构建无细胞的染色质组装体系，这对于进一
步研究蛋白质调控基因的表达具有重要意义。
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表 1　SDS-PAGE分离的 DNA结合蛋白质谱部分结果
编 号 同源蛋白 肽段序列 登录号
1 histone H1 KASGPPVSELITK 005312
2 histone H2B AMGIMNSFINDIFEKAQEASRLARYNKKPTITSREIQTSVRLV 563329
3 histone H2B-2 SMGIMNSFINDIFEK 3021483
4 histone H2A NDEELNKLLGK 122009
5 histone H3 YRPGTVALR 38648851
6 histone H4 ISGLIYEETR 08436
7 hnRNP A2/B1 IDTIEIITDRGGGGNFGPGPGSNFR 6647752
8 HnRNP A3 GFAFVTFDDHDTVDK 51980308
9 40S ribosomal protein S4 GSFETIHLQDALGHEFATR 192912988
10 40S ribosomal protein S3 ELAEDGYSGVEVR 15225107
7· ·
李梦芸 等：金柑 DNA结合蛋白的分离及染色质体外组装研究
农业生物技术　
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（责任编辑 ：石 君）
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（责任编辑 ：石 君）
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