全 文 ：第 35 卷第 10 期 西 南 大 学 学 报 (自然科学版) 2013年10月
Vol. 35 No. 10 Journal of Southwest University (Natural Science Edition) Oct. 2013
文章编号:1673-9868(2013)10-0031-05
转基因锦橙中甲型肝炎病毒衣壳蛋白
融合基因的遗传和表达稳定性研究
①
彭爱红1，3， 雷天刚1，3， 许兰珍1，3， 刘小丰1，3，
何永睿1，2，3， 姚利晓1，2，3， 陈善春1，2，3
1. 中国农业科学院 柑桔研究所，重庆 400712;2. 国家柑桔工程技术研究中心，重庆 400712;
3. 国家柑桔品种改良中心，重庆 400712
摘要:为考察甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因在转基因锦橙株系及其无性繁殖后代中的遗传和表达稳定性，以 2
个单拷贝的转基因锦橙株系为试材，通过嫁接的方式无性繁殖 2 代，应用 PCＲ 技术、Southern blot 杂交、Ｒeal-time
PCＲ技术进行研究，结果表明:2 个转基因锦橙株系在无性繁殖过程中，甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因都能稳定
遗传;甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因在转基因锦橙株系 JTH1 及其无性繁殖后代之间能够稳定的表达，而在转基
因锦橙株系 JTH2 及其无性繁殖后代之间不能稳定的表达，T0 代中目的基因的相对表达量显著高于 T2 代．
关 键 词:转基因锦橙;甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因;遗传稳定性;表达稳定性
中图分类号:Q786;S666. 3 文献标志码:A
转基因技术已成为一项将外源基因导入受体基因组中行之有效的方法，但外源基因在宿主基因组内是
否能稳定遗传和表达，直接影响着转基因植物的利用． 转基因植物在无性繁殖过程中包括转化细胞分裂繁
殖、愈伤组织的诱导等，这些复杂过程向外源基因的遗传稳定性提出了严峻的挑战． 有研究表明转基因在
无性繁殖后代中能稳定的遗传和表达，Noel. B 等对甘蔗转基因株系 22. 2 无性繁殖 3 代，并对转基因株系
及其无性繁殖后代中 pat基因进行表达稳定性研究，表明 pat 基因在转基因株系及其无性繁殖后代中能稳
定表达［1］． 杜涛等对 3 年无性繁殖获得的转基因泡桐子代进行遗传稳定性研究，表明 shiva-1 基因能通过无
性繁殖的方式稳定遗传给子代［2］． 丛郁等为创制矮化的苹果砧木，将 rolC 基因转入乔化砧木八棱海棠中，
并对 3 个株系转 rolC基因的八棱海棠无性增殖获得的第 1，2，3 代继代苗以及通过叶片再生获得的第 1，2
代再生苗，应用 PCＲ、Southern blot杂交和 ＲT-PCＲ技术，研究了外源 rolC基因在转基因八棱海棠无性繁殖
过程中的遗传稳定性和转录水平上表达的稳定性，结果表明:转 rolC基因八棱海棠在无性繁殖过程中外源
rolC基因不仅能够稳定遗传，而且能够在转录水平上稳定表达［3］． 但迄今已在多种植物中观察到转基因在
无性繁殖后代中的表达会发生变化，Courtney-Gutterson等用基因工程的手段将 CHS基因以有义和反义方向
导入开粉红色花的菊花品种‘Moneymaker’中，获得开白花的转基因植株，白花转基因植株通过无性繁殖仍
能稳定地遗传下去，但表达不稳定，导致白花转基因植株的后代中仍有一些花为粉红色［4］． Andrew
J. E. Bettany等在研究转基因高羊茅的无性繁殖后代中 GUS 基因的表达稳定性时发现，转基因高羊茅无性
繁殖后代中，GUS基因表达不稳定，T1、T2、T3 代中 GUS基因表达量下降，而在 T4、T5 代中 GUS基因的表
① 收稿日期:2012-07-23
基金项目:岗位科学家项目(CAＲS-27) ;863 计划(2011AA100205) ;948 项目(2011-G212) ;长江学者和创新团队发展计划(IＲT0976) ;
重庆市自然科学基金(CSTC2011GGA1187)资助．
作者简介:彭爱红(1974-) ，女，江西萍乡人，硕士，助理研究员，主要从事植物生物技术研究．
通信作者:陈善春，研究员．
达更稳定［5］． 因此研究外源基因在无性繁殖作物的无性繁殖过程中的遗传和表达的稳定性是非常有必要
的．
关于利用植物表达乙型肝炎病毒表面抗原基因和外膜蛋白的研究有很多［6 － 7］，而表达甲型肝炎病毒衣
壳蛋白的研究却很少． 本实验室对甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因转入柑桔进行了多年的研究，将甲型肝
炎病毒衣壳蛋白融合基因转入柑桔品种锦橙中，已获得多个转基因“疫苗型”锦橙株系［8］． 本文通过研究转
基因锦橙株系及其无性繁殖后代中甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因的遗传和表达的稳定性，获得能稳定遗
传和表达甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因的转基因“疫苗型”锦橙株系，从而为利用转基因锦橙生产口服疫
苗奠定基础．
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验材料为根癌农杆菌介导法获得的 2 个单拷贝的转基因锦橙株系，来自于中国农业科学院柑桔研究
所国家柑桔品种改良中心． 该转基因株系中目的基因为甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因．
1. 2 试 剂
DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I购自 Ｒoche，Trizol购自 Invitrogen公司，TaKaＲa
Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0、PrimeScriptTM ＲT reagents Kit、SYBＲ Premix Ex TaqTM Kit、DL2000
Marker、Taq酶、dNTP、琼脂糖等购自 TaKaＲa公司，其他化学试剂为国产分析纯．
1. 3 转基因锦橙株系及其无性繁殖后代的 PCＲ检测和 Southern blot杂交
对转基因锦橙株系通过嫁接的方式无性繁殖 2 代． 采用 CTAB法提取转基因锦橙株系及其无性繁殖后
代和野生型植株的总 DNA，用紫外分光光度法结合琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的浓度和纯度．
以总 DNA为模板，以甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因的特异引物扩增甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基
因，引物为:P1:5-GCAGTGATGGACATTACAGGAGTG-3;P2:5-GATCTGATGTATGCCTGG ACTCT-3，扩
增产物长 511 bp． PCＲ反应体系为:10 × PCＲ buffer 2. 5 μL，MgCl2(25 mmol /L)1. 5 μL，dNTPs(2. 5 mmol /
L)1. 5 μL，上下游引物(10 μmol /L)各 0. 75 μL，template DNA(50 ng /μL)1 μL，Taq酶(5 U /μL)0. 15 μL，
加 ddH20 至终体积 25 μL． PCＲ反应程序为:95 ℃变性 5 min，32 次扩增循环(94 ℃ /60 s，56 ℃ /45 s，72
℃ /60 s) ，72 ℃延伸 10 min． 扩增产物用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测．
将 30 μg的总 DNA用 SmaⅠ进行单酶切，过夜，用 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全． 将完
全酶切的产物进行 Southern blot杂交． 探针与上述 PCＲ引物相同，探针的标记和 Southern blot 杂交的具体
方法按 DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I试剂盒操作说明进行．
1. 4 转基因锦橙株系及其无性繁殖后代的 Ｒeal-time PCＲ分析
转基因锦橙株系及其无性繁殖后代的总 ＲNA 提取:以转基因锦橙株系及其无性繁殖后代的幼嫩叶片
为材料，提取总 ＲNA;ＲNA的提取用 Trizol试剂盒进行，操作按说明书;用紫外分光光度法结合琼脂糖凝
胶电泳检测 ＲNA的浓度和纯度，并将 ＲNA的浓度稀释为 500 ng /μL，－ 80 ℃保存备用．
ＲNA样品的反转录:利用 PrimeScriptTM ＲT reagents Kit试剂盒进行 ＲNA的反转录，操作按说明书，反
转录产物保存在 － 20 ℃的冰箱中．
标准品的制备:以反转录产物为模板 DNA，用 actin基因作内参，actin 的引物为:上游引物，5-CATC-
CCTCAGCACCTTCC-3;下游引物，5-CCAACCTT AGCACTTCTCC-3． 目的基因所用引物:上游引物，5-
GTCTTTTGCTTTGGATCAGGAAG-3;下游引物，5-TGCTGACCAACTGAATCTGAAG-3． 在 PCＲ 仪上分别扩
增任一样品的内参和目的基因，然后利用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 纯化产物，然后将纯化产
物用紫外分光光度仪定量，以 2 ng为初始浓度，然后进 10 倍梯度稀释，得到 6 个不同浓度的标准品［9］．
转基因锦橙株系及其无性繁殖后代的Ｒeal-time PCＲ分析:利用 SYBＲ Premix Ex TaqTM试剂盒，在 Bio-Ｒad
IQ5 PCＲ仪上同时进行标准品、样品内参、目的基因的扩增． 25 μL反应体系中包含:SYBＲ Premix Ex TaqTM(2
×)12. 5 μL，PCＲ上游引物(10 μM)0. 5 μL，PCＲ下游引物(10 μM)0. 5 μL，反转录产物 1 μL，ddH2O 10. 5
μL． 反应条件为:95 ℃预变性90 s;95 ℃，30 s，57 ℃，20 s，72 ℃，20 s，40个循环;72 ℃，60 s，65. 0 ～95. 0
℃做溶解曲线，每 0. 3 ℃读一次板． 每个样品设 3个重复，进行 3次独立的试验．
23 西南大学学报(自然科学版) http:/ / xbbjb. swu. cn 第 35 卷
2 结果与分析
2. 1 甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因在转基因锦橙株系及其无性繁殖后代中的遗传稳定性
2. 1. 1 转基因锦橙株系及其无性繁殖后代的 PCＲ检测
将 2个转基因锦橙株系分别编号为 JTH1 和 JTH2，对这 2 个转基因株系无性繁殖 2 代，获得 JTH1-T1、
JTH1-T2 和 JTH2-T1、JTH2-T2，运用 PCＲ技术对这2个转基因锦橙株系及其无性繁殖后代进行检测，初步表明
目的基因在 2个转基因锦橙株系的无性繁殖过程中可以遗传给后代(图 1)．
2. 1. 2 转基因株系及其无性繁殖后代的 Southern blot杂交
由于 PCＲ技术容易产生假阳性的结果，因而有必要对这 2 个转基因株系及其无性繁殖后代进行进一步的
Southern blot杂交，以确定 PCＲ阳性植株是否为真正的转基因植株． 对 2个转基因锦橙株系及其无性繁殖后代进
行 Southern blot杂交，结果表明，目的基因在 2个转基因锦橙株系及其无性繁殖后代中能稳定遗传(图 2)．
M:DL2000 Marker;1:JTH1-T0;2:JTH1-T1;3:JTH1-T2;4:JTH2-
T0;5:JTH2-T1;6:JTH2-T2;7:质粒阳性对照;8 阴性对照;9:水
对照． 黑色箭头表示 511 bp的特异扩增带．
图 1 2 个转基因锦橙株系及其
无性繁殖后代的 PCＲ检测
1:JTH1-T0;2:JTH1-T1;3:JTH1-T2;4:JTH2-T0;5:JTH2-T1;6:
JTH2-T2;W:阴性对照．
图 2 2 个转基因锦橙株系及其
无性繁殖后代的 Southern blot杂交
2. 2 转基因锦橙株系及其无性繁殖后代的表达稳定性分析
2. 2. 1 ＲNA的提取
提取的总 ＲNA用紫外分光光度计检测 A260 /A280，并进行 1. 2%琼脂糖凝胶电泳，结果表明所提取的
总 ＲNA A260 /A280 在 1. 8 ～ 2. 0 之间，未见 ＲNA的明显降解． 说明所提取的总 ＲNA可用来进行下一步的
反转录分析的模板使用(图 3)．
2. 2. 2 转基因锦橙株系及其无性繁殖后代中目的基因的表达
本试验采用相对定量的方法来检测目的基因的相对表达量，选用 JTH1-T0 作为参照样品制作标准曲
线． 标准曲线的回归方程分别为:y = － 3. 319x + 11. 537 和 y = － 3. 257x + 29. 909，样品内参 actin基因和目
的基因的扩增效率分别为 100. 1%和 102. 8%，r2 分别为 0. 998 和 0. 999． 结果表明参照样品内参 actin基因
和目的基因的扩增效率具有可比性，标准曲线可以很好地为正确量化做基础．
通过对每个样品的目的基因和内参 actin 基因分别进行扩增，获得扩增曲线，得到每个样品的 Ct 值．
由于目的基因的扩增效率和内参 actin基因的扩增效率具有可比性，因而根据相对定量的公式 2 － ΔΔCt，得到
每个样品中目的基因的相对表达量．
运用 SPSS 13. 0 统计分析软件对每个转基因锦橙株系及其无性繁殖后代进行统计学分析，转基因锦橙
株系 JTH1 及其无性繁殖后代之间 p ＜ 0. 05，而转基因锦橙株系 JTH2-T0 与 JTH2-T2 之间 p ＞ 0. 05． 表明甲
型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因在转基因锦橙株系 JTH1 及其无性繁殖后代之间能够稳定的表达，而在转基
因锦橙株系 JTH2 及其无性繁殖后代之间不能稳定的表达，T0 代中目的基因的相对表达量显著高于 T2 代，
但 T0 代与 T1 代之间，T1 代与 T2 代之间没有显著差异(图 4)．
33第 10 期 彭爱红，等:转基因锦橙中甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因的遗传和表达稳定性研究
M:DL2000 Marker;1:JTH1-T0;2:JTH1-T1;3:JTH1-T2;4:JTH2-
T0;5:JTH2-T1;6:JTH2-T2 ．
图 3 2 个转基因锦橙株系及其
无性繁殖后代的总 ＲNA
1:JTH1-T0;2:JTH1-T1;3:JTH1-T2;4:JTH2-T0;5:JTH2-T1;6:
JTH2-T2;7:阴性对照．
图 4 2 个转基因锦橙株系及其
无性繁殖后代中目的基因的相对表达量
3 讨 论
关于外源基因在转基因植物中的有性阶段遗传稳定性研究国内外均有较多报道，大部分的研究表明外
源基因呈孟德尔遗传［10 － 13］，也有遗传不稳定或遗传紊乱现象［14 － 15］． 而对于转基因在无性繁殖过程中的稳
定性研究较少． 一般认为外源基因一旦整合到植物细胞的基因组后，其稳定性与核基因是同等的，能够通
过细胞分裂稳定地传递给下一代，因而从理论上来说，转基因在无性繁殖过程中是能够稳定遗传的． 但由
于外源基因在转基因植株中存在嵌合现象［16 － 17］，以及外源基因容易被植物基因组中存在的修饰与限制系
统所识别并加以修饰和抑制等原因［18 － 19］，使得外源基因不能在受体植物的无性世代中得到稳定遗传，因
而有必要对转基因植株的无性繁殖后代进行筛选，获得能稳定遗传的转基因株系． 本试验运用 PCＲ、South-
ern blot杂交技术证明甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因在 2 个转基因锦橙株系及其无性繁殖后代中都能够
稳定的遗传．
获得外源基因能稳定遗传和表达的转基因植株是转基因育种的重要环节． 关于外源基因在转基因植株
及其无性繁殖后代中能否稳定的表达有不同的结果［1，5］． 影响外源基因表达的因素很多，包括外源基因的
整合特性，外源基因的启动子或编码区域的甲基化以及外界环境因素等． Courtney-Gutterson 等认为导致白
花转基因菊花的后代中仍有一些花为粉红，这是因为环境影响所致［4］;同样，Andrew J. E. Bettany等指出转
基因高羊茅无性繁殖后代中，GUS 基因表达不稳定并不是因为转基因的丢失，也不是启动子的甲基化所
致，可能是受外界环境的影响［5］． 本研究中的转基因锦橙株系 JTH2-T0 代中目的基因的相对表达量显著高
于 JTH2-T2 代，其原因有待进一步的研究．
参考文献:
［1］ NOEL B L，SANDＲA J S． Stability of Gene Expression and Agronomic Performance of a Transgenic Herbicide-Ｒesistant Sugar-
cane Line in South Africa［J］． Crop Science，2003(43) :671 － 677．
［2］ 杜 涛，郭剑华，张海州，等． 转基因泡桐 shiva-1 基因遗传与表达分析 ［J］． 西北植物学报，2005，25(12) :
2386 － 2390．
［3］ 丛 郁． 转基因八棱海棠的获得及其表达研究［D］． 博士学位论文，南京:南京农业大学，2006．
［4］ COUＲTNEY-GUTTEＲSON N，NAPOLI C，LEMIEUX C，et al． Modification of Flower Colour in Florists Chrysanthemum:Pro-
duction of a White-Flowering Variety Through Molecular Genetics［J］． Bio /Technology，1994(12) :268 －271．
［5］ ANDＲEW J E B，SUSAN J D，EMMA T，et al． Stability of Transgene Expression During Vegetation Propagation of Protoplast-
Derived Tall Fescue (Festuca arundinacea Schreb. )Plants［J］． Journal of Experimental Botany，1998，49(328) :1797 －
1804．
［6］ 王逸群，李 田． 乙肝病毒表面抗原基因对番茄的遗传转化及转基因番茄植株的获得［J］． 西南大学学报:自然科学
版，2008，30(7) :78 － 83．
［7］ 王 丹，童师雯，张红敏，等． 乙型肝炎病毒外膜蛋白真核表达质粒的构建和表达［J］． 西南大学学报:自然科学版，
43 西南大学学报(自然科学版) http:/ / xbbjb. swu. cn 第 35 卷
2012，34(6) :25 － 29．
［8］ 胡 蓉，魏 泓，陈善春，等． 甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因植物表达载体的构建与遗传转化柑橘的研究［J］． 遗
传，2004，26(4) :425 － 431．
［9］ 王 艳，金小宝，朱家勇，等． 家蝇抗菌肽基因的表达模式研究［J］． 中国科学 C辑:生命科学，2009，39(7) :685 －691．
［10］ FENG Dao-rong，XU Xin-ping，QIU Guo-hua，et al． Inheritance and Expression of Multiple Disease and Insect Ｒesistance
Genes in Transgenic Ｒice［J］． Chinese Science Bulletin，2001，46(2) :102 － 107．
［11］ LIU Yun-jun，WANG Guo-ying． The Inheritance and Expression of cry1A Gene in Transgenic Maize［J］． 植物学报，2003，45
(3) :253 － 256．
［12］刘 志，郭旺珍，朱协飞，等． 转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花中抗虫基因及其抗虫性的遗传稳定性［J］． 作物学报，
2004，30(1) :6 － 10．
［13］李三和，林 刚，张金锐，等． 转基因小麦外源基因在主栽小麦种质中的遗传规律［J］． 麦类作物学报，2005，259
(5) :23 － 26．
［14］谢小波，崔海瑞，沈圣泉，等． 水稻转基因植株后代中外源基因异常分离的研究［J］． 遗传学报，2002，29(11):1005 －1011．
［15］董 静，张玉平，潘青华，等． 外源转入基因 CBF1在转基因草莓中的遗传分析［J］． 分子植物育种，2009，7(1) :63 －
66．
［16］ ANTONIO D，MAGDALENA C，ＲOSA M P，et al． Characterisation of Ｒegenerants Obtained Under Selective Conditions After
Agrobacterium-Mediated Transformation of Citrus Explants Ｒeveals Production of Silenced and Chimeric Plants at Unexpected
High Frequencies［J］． MolecularBreeding，2004(14) :171 － 183．
［17］ SCHMULLING T，SCHELL J． Transgenic Tobacco Plants Ｒegenerated from Leaf Disks Can be Periclinal Chimeras［J］． Plant
Molecular Biology，1993(21) :705 － 708．
［18］ KUMPATLA S P，CHANDＲASEKHAＲAＲAM M B，LYEＲ L M，et al． Genome Intruder Scanning and Modulation Systems and
Transgene Silencing［J］． Plant Science，1998(3) :97 － 104．
［19］ BＲOEＲ I． Stress Inactivation of Foreign Genes in Transgenic Plants［J］． Field Crop Ｒesearch，1996(45) :19 － 25．
Study on the Inheritance and Expression Stability
of Hepatitis A Virus Capsid Protein Fusion Gene in
Transgenic Jincheng (Citrus sinensis (L. )Osbeck)
PENG Ai-hong1，3， LEI Tian-gang1，3， XU Lan-zhen1，3， LIU Xiao-feng1，3，
HE Yong-rui1，2，3， YAO Li-xiao1，2，3， CHEN Shan-chun1，2，3
1. Citrus Ｒesearch Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712，China;
2. National Citrus Engineering Technology Ｒesearch Center，Chongqing 400712，China;
3. National Citrus Improvement Center，Chongqing 400712，China
Abstract:In order to investigate the stability of inheritance and expression of hepatitis A virus capsid protein fusion
gene in transgenic Jincheng (Citrus sinensis (L. )Osbeck)lines and their vegetative propagation generations，two
single-copy transgenic Jincheng lines were used as experiment materials and propagated vegetatively to produce 2
generations through grafting． PCＲ，Southern blotting and real-time PCＲ were performed． The results demonstrated
that hepatitis A virus capsid protein fusion gene was stably inherited in the process of vegetative propagation of both
transgenic Jincheng lines and was stably expressed between JTH1 and its vegetatively propagated descendant． How-
ever，it was not stably expressed between JTH2 transgenic Jincheng line and its vegetatively propagated descendant．
The gene relative expression of T0 generation was significantly higher than that of T2 generation．
Key words:transgenic Jincheng;hepatitis A virus capsid protein fusion gene;inheritance stability;expression sta-
bility
责任编辑 欧 宾
53第 10 期 彭爱红，等:转基因锦橙中甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因的遗传和表达稳定性研究