全 文 ：方药揽胜
旱金莲提取物祛斑作用的实验研究
Experimental Study of Depigmenting Effects of Nasturtium Extract
复旦大学附属华山医院皮肤科
Department of Dermatology , Huashan Hospital , Fudan Hospital
(上海　200032) 　
马晶波
MA Jing-bo 　
黄　岚
HUANG Lan　
冯淑芳
FENG Shu-fang　
郑志忠
ZHENG Zhi-zhong
　　摘要:为研究旱金莲提取物对黑素瘤 B16细胞的作用 ,建立鼠 B16黑素瘤细胞培养体系 ,在添
加旱金莲提取物后 ,测定黑素瘤细胞活力 、酪氨酸酶活性以及黑素含量的变化 ,并与氢醌的实验结
果进行比较 。结果显示旱金莲提取物抑制人黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成 ,具有药物浓度依
赖性关系 ,对黑素细胞的活力影响较小。提示旱金莲提取物具有抑制黑素合成的功效 ,可作为美白
剂进一步开发研究。
　　关键词:旱金莲;黑素细胞;酪氨酸酶
中图分类号:R 285.5;R 965　　文献标识码:B　　文章编号:1007-1334(2003)05-0056-03
[ 作者简介] 马晶波(1976-),男 , 贵州人 , 在读博士研究生 ,
主要从事色素性皮肤病的研究。
　　皮肤色素增生常见于黄褐斑 、老年斑及皮肤炎
症后。对外观影响较大 ,其重要的决定因素黑色素
由表皮基底层中黑素细胞内的黑素体生成。酪氨酸
酶是黑素生成的主要限速酶 ,催化酪氨酸转化为多
巴进而形成多巴醌。
　　旱金莲提取物在国外已经被用于皮肤的美白祛
斑 ,目前国内一些化妆品厂家也开始使用该物质作
为美白添加剂。本文采用鼠 B16黑素瘤细胞为受试
细胞 ,研究旱金莲提取物对黑素细胞的增殖 、酪氨酸
酶活性及黑素生成量的影响 ,并与氢醌比较 ,为初步
评价其安全性和进一步的临床祛斑的应用提供理论
依据 。
　　一 、 材料和方法
　　1.材料
　　(1)试剂:旱金莲提取物 ,由法国 Silab公司提
供;氢醌(hydroquinone),由北京贝丽莱日用化工厂提
供;酪氨酸酶 、左旋多巴(L -Dopa),购自美国 Sigma
公司 。
　　(2)仪器:倒置显微镜(Nikon),EXL-800自动
酶标仪(U.S.A)。
　　2.方法
　　(1)B16细胞的培养:细胞株购于本市中科院
细胞生物学研究所 。用 RPMI 1640 培养液 ,细胞生
长至融合状态 ,0.25%胰蛋白酶消化 ,以每瓶 105 个
细胞左右传代至 25cm2 培养瓶 , 37℃、5%CO2 饱和
湿度环境培养 ,每 3天传代 1次 。
　　(2)测定黑素细胞活力[ 1 ,2] :待细胞生长到对
数生长期 ,PBS 洗涤 , 0.25%胰酶消化 ,锥虫蓝染色
血球计数板计数 。调整细胞 2×104 个细胞/mL ,每
孔取 100μL 量接入 96 孔板 ,12h 后添加待测药物。
药物终浓度设为10 、33 、67 、100μg/mL ,每一浓度设置
4个孔 , 对照组不加药物 , 空白孔不接种细胞。
37℃、5%CO2 孵箱中孵育72h。药物作用 72h后 ,每
孔加入 5g/L 的MTT 溶液 20μL ,继续孵育 4h 。弃去
上清液 ,每孔加二甲基亚砜 150μL ,选择 490nm波长
以空白孔调零 ,在酶联免疫检测仪上测各孔吸光度
值 。
　　细胞生长抑制率 =(1 -A各浓度平均吸光度值/
A对照组平均吸光度值)×100%.
　　(3)细胞酪氨酸酶活性测定:以 L-Dopa 为底
物 ,参考Nakajima M[ 3] 等改良方法测定细胞酪氨酸
酶活性:药物作用 3d后 ,弃去上清液 ,PH 7.4的 PBS
洗涤 2 次 , 每孔加 10ml/L 的 Triton X -100 溶液
90μl ,震荡5min 溶解细胞 ,经 37℃预温后每孔加入
第37卷第 5期
2003年5月
上 海 中 医 药 杂 志
　
SHANGHAI JOURNALOF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
VOL.37 NO.5
MAY , 2003
1%的 L—多巴 10μl , 37℃孵育 30min。于 490nm 波
长处测吸光度 ,以空白孔调零 ,测各孔吸光度值。
　　酪氨酸酶活性抑制率=(1-A各浓度平均吸光度值 ÷
A对照组平均吸光度值)×100%
　　(4)细胞黑素含量测定:采用 Hideya Ando 的
方法[ 4] 。将 B16黑素瘤细胞以 1×104 个/cm2 密度
接种于 6孔板 ,24h后换液 ,添加受试药物每种药物
3个孔 ,最终药物浓度为 0.01g/L , 对照组以 MCDB
153培养液代替药物溶液。5%CO2 、37℃孵育 3d后
弃去上清液。每孔加入 2.5g/L 胰酶 1mL 于室温下
消化 5min 。加入 4mL 培养液中止消化 ,吹打成单细
胞悬液。取 0.5mL 作细胞计数 , 其余细胞悬液
1500r/min离心 10min ,弃上清 ,加入 1mL 1mol/L 的
NaOH ,震荡 5min。选择 490nm波长在酶联免疫检测
仪上测吸光度值 。
　　黑素合成抑制率=[ 1-(药物孔吸光度值 ÷药
物孔细胞密度)÷(对照孔吸光度值 ÷对照孔细胞密
度)] ×100%。
　　3.统计方法
　　全部数据均以 x ±s表示 ,并采用 SPSS医用统
计软件包进行单因素方差分析。
　　二 、结果
　　1.对黑素细胞的细胞毒作用
　　随着药物浓度的增加 ,细胞的增殖抑制率增加 ,
细胞活力逐渐降低。氢醌 100μg/ml组由于细胞毒
性过强 ,48小时换液时 ,细胞全部脱落死亡 ,细胞生
长抑制率达 100%。见表 1。
　　2.对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响
　　旱金莲提取物对酪氨酸酶活性呈浓度依赖性抑
制 ,且与氢醌对酪氨酸酶的抑制比较差异有显著性
意义(P<0.05)。氢醌对酪氨酸酶活性的抑制具有
波动性。在 100μg/ml 时由于细胞毒性大而无法检
测 。见表2。
　　3.对黑素合成的影响
　　如表 3所示:随着药物浓度的增加 ,旱金莲提
取物对黑素细胞黑素合成抑制率(%)增加 。与氢醌
比较差异有显著性意义(P<0.05)。见表 3。
表 1 旱金莲提取物与氢酸对 B16 细胞增殖抑制率的比较( x±s , %)
组别 药物浓度(μg/ml)
10 33 67 100
旱金莲提取物 6.51±2.56＊ 26.24±4.13＊ 42.35±5.12＊ 60.12±3.91＊
氢醌 33.21±3.19 45.39±8.24 52.14±9.25 100.00±0.00
注:以对照组细胞生长率为 100%,每组各设三个孔 ,与氢醌比较 , ＊P<0.05(下同)。
表 2 旱金莲提取物与氢醌对酪氨酸酶活性抑制率的比较( x±s , %)
组别 药物浓度(μg/ml)
10 33 67 100
旱金莲提取物 23.16±5.24＊ 39.25±3.24＊ 46.45±7.15 60.42±4.51
氢醌 16.51±3.81 28.19±4.52 24.68±5.62 —
表 3 旱金莲提取物与氢醌对 B16 细胞黑素合成抑制率的比较( x±s , %)
组别 药物浓度(μg/ml)
10 33 67 100
旱金莲提取物 18.54±3.93＊ 34.22±5.42＊ 45.28±5.12＊ 54.29±5.89
氢醌 8.52±3.28 14.25±6.56 35.64±4.25 —
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　　三 、 讨论
　　黑素细胞属于腺细胞 ,合成黑色素并通过树突
输送黑素颗粒至角质形成细胞 。黑素细胞合成黑色
素的量直接影响皮表的颜色。黑素细胞的黑色素合
成机制较为复杂 ,其中酪氨酸酶具有重要的作用 ,兼
具酪氨酸转化酶活性(催化酪氨酸转化为多巴)和多
巴氧化酶活性(催化多巴转化为多巴醌)双重功能 ,
是黑素细胞合成黑素的关键因素。
　　植物旱金莲富含多酚类物质 ,含有能够抑制酪
氨酸酶活性的氢化桂皮酸 ,它是一种天然的抑制酪
氨酸酶活性的物质。研究表明 ,旱金莲提取物对鼠
B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性呈浓度依赖性抑制 ,
对酪氨酸酶有较强抑制作用 ,可明显抑制黑素生成 。
　　氢醌被用于治疗色素沉着性疾病已有很久的历
史 ,在研究祛斑药物时常作为对照 。近年来发现其
可引起皮肤永久性色素减退等不良反应[ 5] 。研究发
现它可抑制酪氨酸酶活性和黑素合成 ,有明显美白
功效 ,但在 10μg/ml时即可造成细胞的大量死亡 ,随
浓度的增加其细胞毒性越高。与氢醌比较 ,旱金莲
提取物对黑素细胞的毒性较低 ,是一种较为理想的
治疗色素性疾病的美白剂 。
参考文献:
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学杂志 , 1997 ,10(4):220.
编辑:季春来
收稿日期:2003-03-10
Abstract:
　　To study the effects of Nasturtium extract on cultured B16
cells , the Nasturtium extract was added into the B16 cells and the
cellular viability , tyrosinase activity and melanin content were mea-
sured.Results:The Nasturtium extract could inhibit the tyrosinase
activity and melanin synthesis;and its inhibition increased with its
concentration;it had little effects on cellular viability.It is suggest-
ed that the Nasturtium ext ract can be used in clinical practice to
whiten skin.
Key Words:
　　Nasturtium;melanin cell;tyrosinase
征 文 通 知
　　为了交流学术信息 ,检阅研究成果 ,扩大学术影响 ,《江西中西药》杂志社拟于 2003年组织召开以下
全国性学术研讨会 。现正在征集论文 ,请广大读者 、作者踊跃赐稿。
　　1　第二届全国医学与社会发展暨中医临床学术研讨会　于 2003年 8月在江西井冈山召开。征文
内容:医学与社会发展战略研究 、医药管理理论与实践 、临床各科研究等。
　　2　全国针灸文献与针灸临床学术研讨会　于 2003年 8月在江西庐山召开 。征文内容:针灸文献
研究及临床各科针灸治疗经验。
　　3　全国无创痛穴疗及其文献学术研讨会　于 2003年 11月在广西南宁召开 。征文内容:无创痛穴
疗的渊源　发展及治疗经验总结等 。
　　论文形式不拘 ,题目自拟 ,要求具有科学性 、创新性。稿件上务请注明作者姓名 、单位 、电话 ,信封上
注明是何研讨会征文。地址:江西省南昌市阳明路56号(330006)《江西中医药》查青林收。电话:(0791)
6814440。入选论文将在会议上交流 ,公开发表 ,并颁发继续教育学分证书。
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