全 文 ：中 国 南 方 果 树 ２０１４年　第４３卷　第４期
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研究简报 ·柑桔类果树·
广西金柑黑点病病原菌形态学及分子生物学鉴定
阳廷密１，刘冰浩１，邓明学１，门友均１，娄兵海１，覃 旭１，２，张素英１，
邓光宙１，区善汉１，陈贵峰１，唐明丽１，王明召１，甘海峰１
（１ 广西柑桔生物学重点实验室／广西柑桔研究所，广西桂林，５４１００４；２ 广西亚热带作物研究所）
　收稿日期：２０１３　０８　０８；修回日期：２０１４　０４　１２
基金项目：广西柑桔生物学重点实验室项目（桂柑科２０１２０１ｚ００３和桂柑科２０１３０１Ｘ０１０）；国家现代农业产业技术体系
广西柑桔创新团队桂林柑桔综合试验站建设项目资助。
作者简介：阳廷密，女，农艺师，主要从事柑桔病虫害防治研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｊａｕｏｕｙａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ
摘　要：近年广西金柑黑点病发生呈逐年上升趋势，为鉴定广西金柑黑点病的病原，从广西阳朔县
和融安县１０年生金柑上采集黑点病组织样品，按柯赫法则获取病原，采用形态学方法对病原进行
初步鉴定，然后采用ｒＤＮＡ－ＩＴＳ系列分析技术及系统发育分析方法对其进一步鉴定。结果表明，金
柑黑点病分离病原真菌为柑桔间座壳菌Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ　ｃｉｔｒｉ （无性态为Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ　ｃｉｔｒｉ）。
关键词：金柑黑点病；柯赫法则；ｒＤＮＡ－ＩＴＳ；柑桔间座壳菌Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ　ｃｉｔｒｉ
中图分类号：Ｓ　４３６．６６１．１＋３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００７－１４３１（２０１４）０４－００３８－０３
　　近年来广西各金柑产区不同程度发生了黑点病
（金柑果面和叶面出现黑点症状）。目前，尚未见有
关金柑黑点病的研究报道。为探明金柑黑点病的病
原，笔者开展了本研究。
１ 材料与方法
１．１ 病原菌的分离与纯化
在广西阳朔县白沙镇和融安县大将镇１０年生
金柑植株上，采集带黑点病典型症状的病枝、病叶和
病果。用组织分离法［１］在病健交界处剪取２ｍｍ×２
ｍｍ组织块，依次在７５％酒精消毒５秒，０．１％升汞
分别消毒２０秒、３０秒、４０秒、５０秒，无菌水中连续
漂洗３次，取出病斑朝下置马铃薯蔗糖琼脂培养基
（ＰＳＡ）平板上，于（２６±１）℃暗培养。待培养基长
出菌落后，挑取菌落边缘少许菌丝接种到另一ＰＳＡ
平板上，于（２６±１）℃暗培养。重复操作，直至获得
纯培养物。
１．２ 分离物的反接与再分离
纯化菌株在ＰＳＡ上培养２０天后，用清水洗下
菌丝及分生孢子，配成孢子悬浮液。在柑桔新梢长
到３～５ｃｍ嫩叶未展时，于傍晚雨后用孢子悬浮液
均匀喷雾接种。接种日期分别为２０１１年６月９日
和２０１３年３月２７日，接种对象分别为１年生脱毒
嫁接容器苗及３年生田间栽培苗。接种后覆盖薄
膜，翌日早晨掀膜，此后进行正常管理。待嫩叶发病
后按“１．１”方法进行病原菌的再分离。
１．３ 病原菌的分子鉴定
基因组ＤＮＡ的提取：分离菌株在ＰＳＡ上纯培
养２０天后，将菌丝从培养基上刮下，采用ＣＴＡＢ法
提取菌株基因组ＤＮＡ。
　　ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列ＰＣＲ扩增：采用通用引物ＩＴＳ１
（５’－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３’）和ＩＴＳ４（５’－
ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３’）进 行 ＰＣＲ 扩
增。反应体系为２×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　１２．５μＬ（包含０．１Ｕ
Ｔａｐ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／μＬ，５００ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ，２０ｍｍｏｌ／
Ｌ　ＴｒｉｓＨＣｌ，１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，３ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２），１０
μｍｏｌ／Ｌ的ＩＴＳ１和ＩＴＳ４引物各０．５μＬ，模板 ＤＮＡ
１μＬ，最后加ｄｄＨ２Ｏ补足至２５μＬ。反应条件为９４
℃预变性３分钟→９５℃变性１分钟，５４℃退火４０
秒，７２ ℃延伸４０秒，３４个循环→７２ ℃延伸１０
分钟。
　　ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列测定和分析：委托上海生工生
物工程有限公司进行测序。通过 ＮＣＢＩ在线工具
ＢＬＡＳＴｎ，将获得的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列与 ＧｅｎＢａｎｋ数
据库中的核酸序列进行同源性分析。运用 Ｃｌｕｓｔ－
ａｌＷ软件对本研究获得的序列和６个参照序列进行
８３
DOI:10.13938/j.issn.1007-1431.2014.04.016
　２０１４年　第４３卷　第４期 中 国 南 方 果 树
多重序列比对［２］，用 ＭＥＧＡ　５软件测试核苷酸最适
替换模型［３］，并用最大似然法（Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｌｉｋｅｌｉ－
ｈｏｏｄ，ＭＬ）构建系统发育树。采用 Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｌｌａ
ｃｏｒｙｌｉｎａ　ｓｔｒａｉｎ　ＣＢＳ　１２１１２４作为外组（ｏｕｔｇｒｏｕｐ）。
用Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ对系统发生关系进行自举检验，１　０００
次重复。
２ 结果与分析
２．１ 分离菌株培养性状及形态特征
培养２０天后经镜检发现，分离菌株在ＰＳＡ培
养基上生长较慢，用０．１％升汞分别消毒２０秒、３０
秒、４０秒和５０秒均可培养出白色稀疏棉絮状菌丝，
其上有浅黄色孢子堆（见图１）。分生孢子分为两
型：Ｉ型为卵形，单胞无色，上有油球１～４个；Ⅱ型为
丝状或钩状，无色单胞（见图２）。经形态学［４］初步
判断该病菌属于半知菌亚门的Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ　ｃｉｔｒｉ。反
接种分离菌株，１０～１４天后植株的嫩叶、嫩茎均出
现典型的黑点症（见图３和图４）。采集发病叶片进
行再分离，所得菌株与从田间病样（见图５和图６）
分离纯化的菌株一致。
图 1 PSA 培养基上菌丝状 图 2 10×40 视野孢子形态
图 3 接种后 14 天嫩叶上黑点
图 4 接种 14 天嫩梢上黑点
图 5 田间病果症状 图 6 田间病叶症状
２．２ 分离菌株ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析鉴定
ＰＣＲ扩增产物经１．２％琼脂糖凝胶电泳检测，
得到大小约６００ｂｐ的片段（见图７）。通过双向直接
测序获得５５１ｂｐ的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列。ＢＬＡＳＴｎ分
析结果显示，本研究获得的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列与Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ数据库中的多个 Ｄ．ｃｉｔｒｉ菌株的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ
序列同源性达到１００％。与中国柑桔上的３种Ｄｉａ－
ｐｏｒｔｈｅ属真菌（Ｄ．ｃｉｔｒｉ、Ｄ．ｃｉｔｒｉａｓｉａｎａ和Ｄ．ｃｉｔ－
９３
中 国 南 方 果 树 ２０１４年　第４３卷　第４期
ｒｉｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）［５］的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列进行系统发育分析
的结果显示，金柑黑点病分离菌株ｊｉｎｇａｎｈｅｉｄｉａｎｂｉｎｇ
与Ｄ．ｃｉｔｒｉ形成一个单独的分支，Ｄ．ｃｉｔｒｉａｓｉａｎａ和
Ｄ．ｃｉｔｒｉｃｈｉｎｅｎｓｉｓ则各自形成独立分支（见图８）。由
此推断，金柑黑点病分离菌株为Ｄ．ｃｉｔｒｉ。
Mark
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
空白 分离株
600 bp
图７　金柑黑点病分离菌株的ＩＴＳ扩增产物
３ 结论与讨论
针对广西金柑黑点病，按柯赫法则获取病原，首
先采用形态学方法对病原进行了初步鉴定，然后采
用内转录间隔区（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　Ｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）
序列分析技术［６］及系统发育分析方法对菌种作进一
步的鉴定。鉴定结果显示，近年广西金柑果面和叶
面上发生的黑点病的病原为柑桔间座壳菌 Ｄｉａ－
ｐｏｒｔｈｅ　ｃｉｔｒｉ。
　　柑桔间座壳菌Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ　ｃｉｔｒｉ（无性态为柑桔
拟茎点霉Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ　ｃｉｔｒｉ）是柑桔园中常见的一种
病害真菌，在柑桔上可引起多种病害［７－９］，如温州蜜
柑沙皮病、柑桔贮藏期病害蒂腐病、柑桔枝梢枯死
病、流胶病等。该病原菌在金柑上为害并无典型“沙
皮”感，过去也未见相关报道。金柑是广西的优势柑
桔品种，近年在广西金柑产区大力推广使用了“三
避”技术，改变了树体微域环境，这可能给病害的发
0.02
Diaporthe citri strain S141(KC357554)
jinganheidianbing
Diaporthe citri strain B212(KC357548)
Diaporthe citrichinensis strain ZJUD39(KC357559)
Diaporthe citrichinensis strain ZJUD34(JQ954648)
Diaporthe citriasiana strain ZJUD33(JQ954658)
Diaporthe citriasiana strain ZJUD30(JQ954645)
Diaporthella corylina strain CBS121124(KC343004)
73
91
70
94
96
注：ｊｉｎｇａｎｈｅｉｄｉａｎｂｉｎｇ为金柑黑点病分离菌株，括号中的编码为各菌株在ＧｅｎＢａｎｋ数据
库中的登录号；采用Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｌｌａ　ｃｏｒｙｌｉｎａ　ｓｔｒａｉｎ　ＣＢＳ　１２１１２４作为外组（ｏｕｔｇｒｏｕｐ）。
图８ 基于最大似然法构建的金柑黑点病分离菌株ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列系统发育树
生与流行提供了适宜条件。目前，该病在各金柑产
区均有发生且有流行趋势，应引起重视。柑桔间座
壳菌Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ　ｃｉｔｒｉ在金柑上为害后病斑扩展受限
表现为黑点症，但是在金柑上表现为黑点症的病原
物是否均为柑桔间座壳菌 Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ　ｃｉｔｒｉ 尚待
研究。
参　考　文　献
［１］ 方中达．植病研究方法［Ｍ］．３版．北京：中国农业出
版社，１９９８：１２４
［２］ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｊ　Ｄ，Ｈｉｇｇｉｎｓ　Ｄ　Ｇ，Ｇｉｂｓｏｎ　Ｔ　Ｊ．ＣＬＵＳＴ－
ＡＬ　Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ　ｍｕｌ－
ｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｅｉｇｈ－
ｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇａｐ　ｐｅｎａｌｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｔｒｉｘ
ｃｈｏｉｃｅ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２（２２）：
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［３］ Ｔａｍｕｒａ　Ｋ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｄ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．ＭＥＧＡ５：
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍａｘｉ－
ｍｕｍ　ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｄｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ　ｍａｘｉ－
ｍｕｍ　ｐａｒｓｉｍｏｎｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０１１，２８（１０）：２７３１－２７３９
［４］ 陆家云．植物病害诊断［Ｍ］．２版．北京：中国农业出
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ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　ｏｎ　ｃｉｔｒｕｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｆｕｎｇａｌ　Ｄｉ－
ｖｅｒｓｉｔｙ，２０１３，６１（１）：２３７－２５０
［６］ Ｋｒéｎ　Ｏ，Ｈｇｂｅｒｇ　Ｎ，Ｄａｈｌｂｅｒｇ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｔｅｒ－ａｎｄ　ｉｎ－
ｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＩＴＳ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｒＤＮＡ　ｏｆ　ｅｃ－
ｔｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　ｆｕｎｇｉ　ｉｎ　Ｆｅｎｎｏｓｃａｎｄｉａ　ａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ
ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｎｅｗ　Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，１９９７，
１３６（２）：３１３－３２５
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及用药方法研究［Ｊ］．浙江柑桔，２０１０，２７（２）：２６－２９
［８］ 曾炳隆，曾知富，朱晓云，等．南丰蜜桔果实黑点病发生
规律与综合防治措施［Ｊ］．浙江柑桔，２０１０，２７（２）：２４－２６
［９］ 余华梅，徐法三．柑桔黑点病发病因素调查和田间消
长观察初报［Ｊ］．浙江农业科学，２０１１（６）：１３６４－１３６５
（责任编辑：李治飞）
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