全 文 ：《食品工业》2015 年第36卷第 12 期 208
研究探讨
*通讯作者；基金项目：北京市优秀人才培养资助D类
（201400002012G034）
赤小豆萌芽过程中抗氧化活性及多酚类成分变化分析
李丽1，李驰荣2，任晗堃1，龚盛昭3，陈庆生3，董银卯1*
1. 北京工商大学，北京市植物资源重点实验室（北京 100048）；2. 空军杭州航空医学鉴定训练中心（杭州 310007）；
3. 广州环亚化妆品科技有限公司（广东 510663）
摘 要 通过FRAP还原力测定试验考察赤小豆萌芽过程中抗氧化活性的变化, 通过LC/MS法, 通过与对照品比
对、对比保留时间及对比分子量的方法, 定性鉴别不同天数赤小豆萌芽中所含酚酸及黄酮类成分的结构类型。结
果表明: 赤小豆萌芽过程中, 抗氧化能力在0~1 d和4~5 d呈现两次上升趋势, 并且在萌芽第5天抗氧化能力最高, 萌芽
第1天, 酚酸种类迅速增加, 随着萌芽的进行, 酚酸种类逐渐减少, 与此同时黄酮类成分种类增多, 并且在第5天最多,
并进一步推测萌芽第5天发挥抗氧化活性的主要物质为4种酚酸及7种黄酮类成分。
关键词 赤小豆; 抗氧化; 酚酸; 黄酮
Changing of Antioxidant Activity and Active Polyphenols in the
Sprouting Process of the Rice Bean
Li Li1, Li Chi-rong2, Ren Han-kun1, Gong Sheng-zhao3, Chen Qing-sheng3, Dong Yin-mao1*
1. Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, Beijing Technology and Business University
(Beijing 100048); 2. Hangzhou aviation Medical Appraisal and Training Center (Hangzhou 310007);
3. Guangzhou Uniasia Cosmetic Technology Co., Ltd. (Guangzhou 510663)
Abstract The changing of antioxidant activity in the sprouting process of the Rice bean was tested by the method of FRAP.
The active polyphenols were tested by the method LC/MS and identifi ed through comparing with the retention time and
molecular weight of the references. The results of antioxidant activity test showed two times of increasing from the beginning
to the 1 d and the 4 d to the 5 d. The best activity was tested on the 5th day. The results of LC/MS showed that phenolic
acids increased on the 1st day and then decreased, but in the same time, fl avonoids increased. On the 5th day, there were 4 phenolic
acids and 7 fl avonoids existing in the sprouts, which contributed to the best antioxidant activity.
Keywords rice bean; antioxidant activity; phenolic acids; fl avonoids
赤小豆（Rice bean），又名红小豆，为豆科草本
植物赤小豆（Vigna umbellata）的成熟种子，赤小豆
先载于《神农本草经》，视为中品。作为中国的传统
中药，药用历史悠久，在民间广泛使用，具消肿解
毒、利水除湿、和血排脓等功效。早在秦汉时就有关
于豆芽栽培历史的记载，现今关于豆芽的最早记载见
于《灵枢经》和《神农本草经》。豆芽含丰富营养，
便于吸收，品质好，口感柔嫩，并具有上佳的医疗保
健作用[1-2]。赤小豆（V. umbellata）主产于江西、浙
江、湖南、广西、广东、吉林等省区，产量较赤豆
小，为我国部分地区使用品种。日本、朝鲜、菲律宾
及其他东南亚国家也有栽培[3-4]。
种子是一种植物最初的生命状态，其中包含了大
量潜在的生物活性物质及多种能够帮助生长的酶，但
是未经激发的种子其活性物质种类少，生物酶活性
低；然而种子萌芽是天然的激发过程，随着萌芽过
程，酶活性提高，活性物质增加，新陈代谢水平提
高，使得包括多酚在内的次级代谢产物大量生成，从
而提高植物本身的药理活性[5-7]。
考察赤小豆萌芽过程中抗氧化活性的变化，并通
过LC/MS法，对赤小豆萌芽中多酚类活性成分的变化
进行鉴定，确定赤小豆萌芽中活性成分的结构并总结
其在萌芽过程中的变化，为赤小豆萌芽作为抗氧化功
能食品应用提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
萌芽0~6 d赤小豆粉末。
1.2　 FRAP还原力测定
1.2.1　仪器与试剂
CQ-250超声波清洗器：上海超声波仪器厂；
JA5003电子天平：上海精密科学仪器有限公司；
HH·S21-8电热恒温水浴锅：北京长安科学仪器厂；
酶标仪：Thermo Science。
FeSO4溶液对照品（10 mmol/L）、TPTZ稀释液、
TPTZ溶液、检测缓冲液、Trolox溶液（10 mmol/L），
《食品工业》2015 年第36卷第 12 期 209
研究探讨
上述试剂均为分析纯。
1.2.2　试验方法
对照品溶液：把10 mmol/L FeSO4标准溶液稀释成
0.15，0.3，0.6，0.9，1.2和1.5 mmol/L溶液。以吸光度
A为纵坐标，相应FeSO4标准溶液浓度为横坐标，绘制
标准曲线。
供试品溶液：取萌芽0~6 d赤小豆粉末各1.0 g于
试管中，加入75%甲醇10 mL，超声提取30 min，以
12 000 r/min离心5 min，取上清液，待测。
FRAP工作液的制备：精密吸取TPTZ稀释液
（7 500 μL），TPTZ溶液（750 μL）于试管中，充
分摇匀，再精密吸取检测缓冲液（750 μL）注入其中
充分摇匀于37 ℃下孵育待用。
操作步骤：
1) 96孔板的每个检测孔中加入180 μL FRAP工
作液。
2) 空白对照孔中加入5 μL 75%甲醇；标准曲线检
测孔内加入5 μL各种浓度的FeSO4标准溶液；样品检
测孔内加入5 μL各种样品或0.15~1.5 mmol/L的Trolox
作为阳性对照。轻轻混匀。
3) 37 ℃孵育3~5 min后测定吸光度（A593 nm）。
4) 根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。
1.2.3　统计方法
每个试验重复3次，结果以x±s表示。数据结果
采用SPSS v17.0软件进行统计分析。
1.3　LC/MS定性分析萌芽过程中酚酸类成分
1.3.1　仪器与试剂
安捷伦科技 LC/MSD Trap XCT Plus， 高效液相
色谱： 安捷伦1100 系列， 软件： Data Analysis-
Agilent。
甲醇：Fisher Gold；水：Millipore超纯水，电阻率
18.24 MΩ·cm；乙酸：Sigma公司。
1.3.2　色谱条件
流动相：A（0.2% 乙酸-水），B（甲醇）。
梯度洗脱条件：0~15 min，10%~30% B；15~20
min 30% B；20~30 min，30%~53% B；30~45 min，
53%~70% B；46~46 min，70%~100% B；46~65 min，
100% B。
流速：0.4 mL/min，进样量：5 μL，检测波长：
280 nm，柱温：25 ℃，色谱柱：Agilent ZORBAX
Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，3.5-Micron）
1.3.3　质谱条件
干燥温度：350 ℃，喷射压力（set）：40.00 psi，
干燥气体 （set）：12.00 L/min，毛细管电压： 4 500
V，扫描范围： 100~600 m/z。
1.3.4　对照品溶液制备
精密称量对照品莽草酸（1，0.89 mg），香草酸
（6，0.9 mg），对香豆酸（9，1.08 mg），阿魏酸
（10，0.99 mg），鞣花酸（11，0.93 mg），肉桂酸
（12，1.25 mg），没食子酸（7，1.21 mg），龙胆酸
（8，1.11 mg），羟基苯甲酸（9，1.50 mg），绿原
酸（10，0.96 mg），咖啡酸（11，0.91 mg），丁香酸
（12，1.07 mg）用甲醇（体积分数75%）分别定容至
1.5 mL。4 ℃下保存，作为储备溶液。将储备液稀释
后配制成质量浓度分别为莽草酸95.70 μg/mL，香草酸
24.33 μg/mL，香豆酸29.20 μg/mL，阿魏酸26.76 μg/
mL，鞣花酸50.28 μg/mL，肉桂酸16.83 μg/mL，没食
子酸32.85 μg/mL，龙胆酸120.03 μg/mL，羟基苯甲酸
40.55 μg/mL，绿原酸25.95 μg/mL，咖啡酸24.74 μg/
mL，丁香酸28.79 μg/mL混合对照品储备液。
精密吸取上述混标储备液5.0 μL，过0.22 μm微
孔滤膜，注入LC/MS，分析。对照品色谱图及TIC图，
如图1和图2所示。
注：1-莽草酸；2-没食子酸；3-龙胆酸；4-羟基苯甲酸；
5-绿原酸；6-香草酸；7-咖啡酸；8-丁香酸；9-对香豆酸；
10-阿魏酸；11-鞣花酸；12-肉桂酸
图1　12种酚酸对照品UV色谱图
注：1-莽草酸；2-没食子酸；3-龙胆酸；4-羟基苯甲酸；
5-绿原酸；6-香草酸；7-咖啡酸；8-丁香酸；9-对香豆酸；
10-阿魏酸；11-鞣花酸；12-肉桂酸
图2　12种酚酸酚酸对照品TIC图
1.3.5　样品溶液制备
精密称定赤小豆萌芽0~6 d样品粉末2.0 g，10
mL甲醇（体积分数75%）定容，25 ℃下超声提取60
min，过0.22 μm微孔滤膜，进样5.0 μL，分析。
1.4　LC/MS定性分析萌芽过程中黄酮类成分
1.4.1　仪器与试剂
液相色谱-质谱仪：赛默飞世尔科技公司
LCQ Advantage Max Mass Spectrometer System（LAM
20116）；检测器：Finnigan Surveyor UV-VIS Plus
Detector；Soft：Xcalibur Software；色谱柱：Agilent
ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，
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3.5-Micron）；天平：赛多利斯BS/BT系列（京制
00000246号，28390717）。
试剂同1.3.1。
1.4.2　黄酮对照品溶液制备
精密称量对照品牡荆素（1，0.80 mg），芦
丁（2，1.08 mg），杨梅素（3，1.27 mg），山奈
酚-3-O-芸香糖苷（4，0.89 mg），黄豆黄素（5，
0.96 mg），槲皮素（6，1.22 mg），山奈酚（7，1.11
mg），芒柄花素（8，0.98 mg），大豆苷（9，0.91
mg），牡荆素鼠李糖苷（10，1.16 mg），异牡荆素
（11，0.84 mg），柚皮苷（12，0.99 mg），大豆苷元
（13，0.76 mg），染料木素（14，0.96 mg），异鼠李
素（15，1.27 mg），染料木苷（16，1.17 mg），杨梅
苷（17，1.08 mg），异槲皮苷（18，1.04 mg），橙
皮苷（19，1.34 mg），山奈酚-3-O-葡萄糖苷（20，
1.05 mg），木犀草素（21，1.01 mg），芹菜素（22，
1.36 mg）和甲醇（体积分数75%）分别定容至1.5
mL。4 ℃下保存，作为单标储备溶液。
A组混合对照品储备液：将上述储备液配制成质
量浓度分别为：牡荆素28.07 μg/mL，芦丁37.89 μg/
mL，杨梅素44.5 6 μg/mL，山奈酚-3-O-芸香糖苷
31.23 μg/mL，黄豆黄素33.68 μg/mL，槲皮素42.81
μg/mL，山奈酚38.95 μg/mL，芒柄花素34.39 μg/mL。
B组混合对照品储备液：将上述储备液配制成质
量浓度分别为大豆苷27.58 μg/mL，牡荆素鼠李糖苷
105.45 μg/mL，异牡荆素25.45 μg/mL，柚皮苷90.00
μg/mL，大豆苷元23.03 μg/mL，染料木素29.09 μg/
mL，异鼠李素38.48 μg/mL。
C组混合对照品储备液：将上述储备液配制成质
量浓度分别为染料木苷43.33 μg/mL，杨梅苷40.00 μg/
mL，异槲皮苷38.52 μg/mL，橙皮苷49.63 μg/mL，山
奈酚-3-O-葡萄糖苷38.89 μg/mL，木犀草素37.41 μg/
mL，芹菜素50.37 μg/mL。
精密吸取A，B，C组混标储备液5.0 μL，过0.22
μm微孔滤膜，注入LC/MS，分析。对照品的色谱图及
TIC图，如图3~图5所示。
注：1-牡荆素；2-芦丁；3-杨梅素；4-山奈酚-3-O-芸香糖苷；
5-黄豆黄素；6-槲皮素；7-山奈酚；8-芒柄花素
图3　A组黄酮混合对照品色谱图（上）及TIC图（下）
注：9-大豆苷；10-牡荆素鼠李糖苷；11-异牡荆素；12-柚皮苷；
13-大豆苷元；14-染料木素；15-异鼠李素
图4　B组黄酮混合对照品色谱图（上）及TIC图（下）
注：16-染料木苷；17-杨梅苷；18-异槲皮苷；19-橙皮苷；
20-山奈酚-3-O-葡萄糖苷；21-木犀草素；22-芹菜素
图5　C组黄酮混合对照品色谱图（上）及TIC图（下）
1.4.3　样品溶液配制
精密称定赤小豆萌芽0~6 d样品粉末2.0 g，10
mL甲醇（体积分数75%）定容，25 ℃下超声提取60
min，过0.22 μm微孔滤膜，进样5.0 μL，分析。
1.4.4　色谱方法
流动相A：0.2%乙酸-水；流动相B：0.2%乙酸-
甲醇。
梯度洗脱条件：0~15 min，10%~30% B；15~20
min，30% B；20~30 min，30%~53% B；30~45 min，
53%~70% B；45~55 min，70% B；55~65 min，
70%~100% B；65~75 min，100% B。
流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL；检测波长：
280 nm；柱温：25 ℃。
1.4.5　质谱方法
毛细管温度（C）：320.00； Sheath Gas Flow：
60.00；Aux/Sweep Gas Flow：10.00；Source Type：
ESI；Source Voltage （kV）：4.50；Source Current
（μA）：80.00；Capillary Voltage（V）：-10.00。
2　结果与分析
2.1　FRAP还原力测定
试验结果如图6所示。赤小豆萌芽过程中，抗氧
化能力在0~1 d和4~5 d呈现两次上升趋势，并且在萌
芽第5天抗氧化能力最高。导致抗氧化能力变化的原
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因可能为酚酸类活性成分种类及含量的改变。
图6　赤小豆萌芽抗氧化活性
2.2　LC/MS对酚酸的定性试验结果
对照品分子量及保留时间见表1。通过提取赤小
豆萌芽中的准分子离子峰[M-H]-，与对照品比对保留
时间（tR）和分子量，确定有萌芽过程中含有这6种
酚酸类成分，分别为莽草酸（1），香草酸（2），对
香豆酸（3），阿魏酸（4），鞣花酸（5），肉桂酸
（6）。随着赤小豆萌芽过程（0~6 d）的进行，6种酚
酸随萌芽天数的变化分布情况如表2所示。
表1　鉴定的6种酚酸混合对照品的保留时间和分子量
编号 名称 分子式 保留时间(tR)/min [M-H]-
1 莽草酸 C7H10O5 2.0 172.7
2 香草酸 C8H8O4 15.5 166.8
3 对香豆酸 C9H8O3 21.3 162.7
4 阿魏酸 C10H10O4 23.7 192.7
5 鞣花酸 C14H6O8 31.5 300.7
6 肉桂酸 C9H8O2 34.6 147.0
表2　6种酚酸在萌芽过程中的分布情况
编号 名称 第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天
1 莽草酸 + + + + + + +
2 香草酸 - - - - + +
3 对香豆酸 + + - + + + +
4 阿魏酸 + + - - - - -
5 鞣花酸 + + - - - - -
6 肉桂酸 - + - + + + +
注: “+”表示检测出, “-”表示未检测出。
2.3　LC/MS对黄酮的定性试验结果
表3　鉴定的8种黄酮对照品的保留时间和分子量
编号 名称 分子式 保留时间/min [M-H]-
1 大豆苷 C7H10O5 21.08 415.10
2 染料木苷 C21H20O10 26.70 431.10
3 异槲皮苷 C21H20O12 29.99 463.09
4 芦丁 C27H30O16·3(H2O) 30.13 609.15
5 山奈酚-3-
O-芸香糖苷
C27H30O15 32.71 593.15
6 大豆苷元 C15H10O4 34.13 253.05
7 槲皮素 C15H10O7 35.42 301.03
8 染料木素 C15H10O5 36.80 269.05
表4　8种黄酮分布情况
编号 名称 第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天
1 大豆苷 - - - + + + +
2 染料木苷 - - - - + + -
3 异槲皮苷 + + + + + + +
4 芦丁 + + + + + + +
5 山奈酚-3-O-
芸香糖苷
+ + + + + + +
6 大豆苷元 - - + + + + +
7 槲皮素 + + - - - - -
8 染料木素 - - - - + + -
通过提取有效部位中的准分子离子峰[M-H]-，与
对照品比对保留时间（tR）和分子量，准确鉴定有效提
取物中含有8种黄酮类成分，主要成分为芦丁和异槲皮
苷，已鉴定黄酮类成分的保留时间、分子量和分子式
如表3所示。随着赤小豆萌芽过程（0~6 d）的进行，
黄酮类成分随萌芽天数的变化分布情况如表4所示。
3　结果与讨论
赤小豆萌芽过程中，抗氧化能力在0~1 d和4~5 d
呈现两次上升趋势，并且在萌芽第5天抗氧化能力最
高，萌芽第1天，酚酸种类迅速增加，导致抗氧化活
性提高，随着萌芽的进行，酚酸种类逐渐减少，与
此同时黄酮类成分种类增多，并且在第5天最多，并
进一步推测萌芽第5天发挥抗氧化活性的主要物质为4
种酚酸莽草酸、香草酸、对香豆酸、肉桂酸及7种黄
酮类成分大豆苷、染料木苷、异槲皮苷、芦丁、山奈
酚-3-O-芸香糖苷、大豆苷元、染料木素，其中异槲皮
苷、大豆苷元、染料木素、大豆苷、染料木苷为首次
从赤小豆及其萌芽中发现，结果为赤小豆萌芽作为抗
氧化功能食品及功能化妆品原料应用提供科学依据。
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