全 文 ：第 33 卷 第 5 期
2 0 1 5 年 5 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 33 No． 5
May 2 0 1 5
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DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2015． 05． 019
白鲜皮提取物体外抗白念珠菌生物膜作用及相关基因的研究
谈潘莉，曹毅，夏永良
(浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006)
摘 要:目的:研究白鲜皮提取物在体外对白念珠菌生物膜及相关基因的影响。方法:M27 － A2 测定白鲜皮
提取物对白念珠菌的最小抑菌浓度(MIC);XTT法评价白鲜皮提取物对白念珠菌生物膜形成及细胞黏附的影响;
实时荧光定量 ＲT － PCＲ(qＲT － PCＲ)检测白鲜皮提取物作用后，ALS3、HWP1 基因表达情况。结果:白鲜皮提取
物对白念珠菌的 MIC为 128 μg /mL;对生物膜的 SMIC50 和 SMIC80 分别为 256 μg /mL和 512 μg /mL;与空白对照
组相比，不同浓度白鲜皮提取物(16 ～ 512 μg /mL)对培养 1、2、3、4 h 的白念珠菌细胞黏附均有明显抑制作用(P
＜0． 05);qＲT － PCＲ结果显示药物作用后 ALS3、HWP1 基因表达降低(P ＜ 0． 05)。结论:白鲜皮提取物对体外白
念珠菌生物膜有较明显的抑制作用，其机制可能通过抑制 ALS3、HWP1 等相关基因的表达，从而抑制 Ｒas /cAMP
通路的功能。
关键词:白鲜皮提取物;白念珠菌;HWP1;ALS3
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2015)05-1089-04
Study on Extraction of Cortex Dictamni Against Candida Albicans
Biofilms and Ｒelated Genes in Vitro
TAN Panli，CAO Yi，XIA Yongliang
(The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，Zhejiang，China)
Abstract:Objective:To study the effect of cortex dictamni on Candida albicans biofilm and related gene in vitro．
Methods:M27 － A2 was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC)of cortex dictamni against C． albi-
cans． XTT assay was performed to determine the effects of cortex dictamni on C． albicans biofilms formation and cell ad-
hesion． The real － time fluorescent quantitative ＲT － PCＲ (qＲT － PCＲ)was used to determine the difference of ALS3
and HWP1expression between the before and after cortex dictamni induction group． Ｒesults:MIC of cortex dictamni against
C． albicans was 128 μg /mL． SMIC50 and SMIC80 of cortex dictamni against C． albicans biofilms were 256 μg /mL and
512 μg /mL． Cortex dictamnifrom 16 μg /mL to 512 μg /mL show distinct inhibitive effects on adhesion to C． albicans cul-
tured for 1、2、3、4 h (P ＜ 0． 05);Ｒeal － time ＲT － PCＲ results showed that cortex dictamni treatment resulted in a strik-
ing down － regulation of ALS3 and HWP1 (P ＜ 0． 05)． Conclusions:Cortex dictamni was demonstrated to have potent ac-
tivity against C． albicans biofilms in vitro． These results indicated that inhibition of Cortex dictamni on biofilm formation
possibily depends on inhibiting the expression of ALS3，HWP1and other related genes，then down － regulating the Ｒas /
cAMP pathway function．
Key words:Extraction of cortex dictamni;Candida albicans;HWP1;ALS3
收稿日期:2015 － 01 － 15
基金项目:国家自然科学基金项目(81173271)
作者简介:谈潘莉(1980 －)，女，浙江湖州人，主管技师，硕士，研究
方向:病原生物学。
通讯作者:曹毅(1965 －)，男，浙江人，教授、主任医师，博士研究生
导师，博士，研究方向:皮肤科临床与科研。E-mail:
caoyi1965@ 163． com。
白念珠菌(Candida albicans)是一种常见的条件致病
菌，在机体免疫功能低下时，可引起黏膜和全身性的感
染［1］。该菌容易附着于生物组织与生物材料的表面，从而
形成一种由大量基质将其包裹的生物膜(biofilm)。生物膜
内白念珠菌比其悬浮菌更加耐药、难治，所致感染易复
发［2］。寻找抗真菌生物膜的药物是防治真菌病的关键。
中药白鲜皮是芸香科植物白鲜的根皮，具有祛风、燥
湿、清热、解毒等功效［3］。现代药理学研究表明白鲜皮具
有抗氧化、抗病毒、抗细菌、抗炎、抗肿瘤等多种活性。从白
鲜皮中可分离得到梣酮、白鲜碱和黄柏酮，其中白鲜碱
(Dictamnine)为其重要活性成分，具有抑制血小板聚集，松
弛血管，降低血压和抗菌的活性［4］。本研究就白鲜皮提取物
对白念珠菌生物膜形成及相关基因表达的影响进行了初步
研究，以期为白念珠菌生物膜的预防和治疗提供新的思路。
1 材料
1． 1 实验菌株
ATCC10231 购自中国科学院微生物研究所。
1． 2 实验药物及试剂
白鲜皮提取物:由浙江中医药大学中药制剂室制备成
流浸膏，含生药 1 g /mL;XTT 粉末:Sigma 公司;维生素 K3:
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Alexis公司;丙酮:蚌埠化学试剂厂;ＲPMI － 1640 培养基、
YPD培养基依据文献配制［5］。
2 方法
2． 1 白鲜皮提取物对白念珠菌生物膜影响
2． 1． 1 白鲜皮提取物对白念珠菌最小抑菌浓度(Minimal
inhibitory concentrations，MIC)值测定 采用国际上通用的
微量稀释法，即美国临床实验室标准化研究所(CLSI)M27
－ A2［6］。
2． 1． 2 白鲜皮提取物抑制白念珠菌生物膜生长的最小药
物浓度(Sessile Minimal inhibitory concentrations，SMIC)的测
定［5］ ①白念珠菌生物膜的制备将白念珠菌接种于 YPD
培养基中，35°C摇床过夜培养，收集菌体，用 ＲPMI － 1640
培养基稀释，调整菌液浓度为 1 × 106菌落形成单位 /毫升
(CFU /mL)。将 100μl该浓度菌液接种于 96 孔细胞培养板
中，37 ℃培养 24 h，使白念珠菌完全黏附于平底的 96 孔板
基底表面，形成白念珠菌生物膜的结构。倒置显微镜下初
步鉴定白念珠菌生物膜的形成。②生物膜形成后，弃去培
养基及悬浮菌，用 pH7． 4、0． 01 mol /L磷酸缓冲盐水(PBS)
洗 3 次，将药物按两倍稀释加到各孔中，继续培养 48 h。用
XTT 减低法检测抑制生物膜 50% (SMIC50)及 80%
(SMIC80)的药物浓度:XTT 用 0． 5 g /L 林格液稀释及 0． 22
μm孔径的滤器过滤除菌，分装后存放于 － 70 ℃冰箱备用。
临用前，加入维生素 K3(menadione，用丙酮稀释至终浓度
10 mmol /L)。取 XTT － menadione溶液 100 μL加到已形成
生物膜的培养孔中(menadione 在 XTT 中的终浓度为 1
μmol /L)。继续 37 ℃避光培养 2 h。在酶标仪波长 490 nm
处检测各孔光密度(Optical density，OD)值。另设阳性对照
孔(只加菌液与 XTT 溶液，不含药物)，阴性对照组(只加
XTT溶液)。每个药物浓度均设 8 组进行重复实验，取其平
均值。
2． 1． 3 白鲜皮提取物抗白念珠菌黏附作用的测定［7 － 8］
将 100 μL的菌液(1 × 106 CFU /mL)接种于 96 孔板中 37 ℃
培养，分别培养 1、2、3、4 h。弃去培养基及悬浮菌，用 PBS
洗 3 次，加入倍比稀释(终浓度为 16 ～ 512 μg /mL)的白鲜
皮提取物 100 μL。XTT减低法检测 490 nm波长处 OD值。
2． 2 白鲜皮提取物对白念珠菌生物膜相关基因影响
2． 2． 1 样品制备 将白念珠菌接种于 YPD 培养基中，35
℃摇床过夜培养，收集菌体，用 ＲPMI － 1640 培养基稀释，
调整菌液浓度为 1 × 106 CFU /mL，将 80 mL 菌液加入细胞
培养皿中，37 ℃静置黏附 90 min，弃上清液，用灭菌 PBS缓
冲液洗 3 次，向细胞培养皿中加入 27． 5 mL白鲜皮提取物，
使得其终浓度为 256 μg /mL，37 ℃继续静置培养 1 h，弃上
清液，用灭菌 PBS缓冲液洗 3 次，用生物被膜刮刀刮取细胞
培养皿底部细胞，收集离心，用 DEPC 水洗 1 次，离心并弃
上清备用。
2． 2． 2 ＲNA提取 取沉淀用 Novelase 消化液悬浮，室温
消化 10 min后，参照 Trizol 试剂(Invitrogen)说明书介绍的
步骤提取总 ＲNA，紫外分光光度法测定其 ＲNA浓度［9］。
2． 2． 3 实时荧光定量 ＲT － PCＲ(qＲT － PCＲ) 根据文献
报道的 ALS3、HWP1 基因序列［10］，采用 Primer Premier 5． 0
软件设计检测白念珠菌 ALS3 － mＲNA、HWP1 － mＲNA 和
18S － ＲNA 的 qＲT － PCＲ 引物(表 1)，各引物由上海 In-
vitrogen公司合成。
表 1 qＲT － PCＲ扩增引物序列
目的基因引物序列(5＇－ 3＇) 扩增长度
ALS3 F － TCCACTTCACAATCCCCATC 340bp
ALS3 Ｒ － CAGTAGTAGTAACAGTAGTAGTTTCATC
HWP1 F － TGGCTAGTGAAACCTCACC 150bp
HWP1 Ｒ － GTTGCATGAGTGGAACTGATTC
18S ＲNA － F TCTTTCTTGATTTTGTGGGTGG 348bp
18S ＲNA － Ｒ TCGATAGTCCCTCTAAGAAGTG
利用 cDNA synthesis kit for ＲT － PCＲ(TaKaＲa Biotech-
nology，Dalian，China)进行反转录。反应体系为 60 μL，反
应体系中加入 4 μg 总 ＲNA，采用 Light Cycler Ｒeal Time
PCＲ仪进行扩增，反应参数:95 ℃ 10 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20
s，72 ℃ 15 s 40 个循环。所有测试重复检测 3 次。每个循
环的荧光量由 LightCycler系统软件检测并计算出 threshold
cycle(CT值)。△CT值为目的基因的 CT值减去 18S ＲNA。
△CT值与目的基因的表达量呈负向关系，即△CT值越大，
目的基因的表达量就越低。
2． 3 统计学处理
采用 SPSS 19． 0 统计学软件进行检验，计量资料均用 珋x
± s表示，采用 t检验，方差分析，以 P ＜ 0． 05 作为差异有统
计学意义。
3 结果
3． 1 最小抑菌浓度
白鲜皮提取物对白念珠菌最小抑菌浓度(MIC)为 128
μg /mL。
3． 2 最小药物浓度
白鲜皮提取物抑制白念珠菌生物膜生长的最小药物浓
度(SMIC)随着药物浓度递增，其对白念珠菌生物膜的抑制
作用呈增强趋势，SMIC50 和 SMIC80 分别是 256、512 μg /
mL，见图 1。
图 1 不同浓度白鲜皮提取物对白念珠菌
生物膜作用(16 ～ 512 μg /mL)
3． 3 白鲜皮提取物对白念珠菌黏附功能的影响
与空白对照组相比，不同浓度白鲜皮提取物(16 ～ 512
μg /mL)对培养 1、2、3、4 h 的白念珠菌细胞黏附均有明显
抑制作用(P ＜ 0． 05)，见表 2。
3． 4 白鲜皮提取物对白念珠菌生物膜相关基因影响
256 μg /mL 白鲜皮提取物作用后，ALS3、HWP1 基因
△CT均高于药物作用前，两组比较差异有统计学意义(P
＜ 0． 05)。△CT值与目的基因的表达量呈负向关系，故药
物作用后 ALS3、HWP1 基因表达降低，见表 3。
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表 2 不同浓度白鲜皮提取物对白念珠菌生物膜 OD值的影响(n = 9，珋x ± s)
黏附时间
(h)
白鲜皮提取物浓度(μg /mL)
0 16 32 64 128 256 512
1 0． 61 ± 0． 11 0． 56 ± 0． 09* 0． 51 ± 0． 07* 0． 43 ± 0． 05* 0． 31 ± 0． 06* 0． 28 ± 0． 04* 0． 14 ± 0． 04*
2 0． 63 ± 0． 12 0． 58 ± 0． 08* 0． 54 ± 0． 05* 0． 45 ± 0． 03* 0． 33 ± 0． 07* 0． 27 ± 0． 05* 0． 18 ± 0． 05*
3 0． 64 ± 0． 10 0． 60 ± 0． 06* 0． 55 ± 0． 05* 0． 48 ± 0． 02* 0． 35 ± 0． 05* 0． 29 ± 0． 02* 0． 21 ± 0． 04*
4 0． 66 ± 0． 13 0． 62 ± 0． 05* 0． 57 ± 0． 05* 0． 50 ± 0． 03* 0． 39 ± 0． 04* 0． 30 ± 0． 06* 0． 25 ± 0． 02*
注:与空白对照组比较，* P ＜ 0． 05。
表 3 256 μg /mL白鲜皮提取物作用前后
ALS3、HWP1 基因△CT对比
组别
△CT值(珋x ± s)
ALS3 HWP1
作用前 4． 97 ± 1． 21 5． 21 ± 1． 89
作用后 8． 23 ± 2． 35 8． 88 ± 2． 21
t 3． 578 3． 652
P ＜ 0． 05 ＜ 0． 05
4 讨论
近年来，随着各种医源性生物材料如静脉插管、人工心
脏瓣膜、置换关节等应用的明显增加，与其相关的感染也日
益增加。研究表明，大部分医源性感染与体内植入的生物材
料有关，而白念珠菌是相关性感染的主要病原体之一［11］，其
容易黏附在医学植入材料表面形成一种不同于浮游菌的细
胞群体结构———生物膜，生物膜是病原微生物附着于活组织
或无活力组织表面的、由其自身产生的细胞外基质(ECM)
包裹的有结构的菌细胞群体，是相对于单个分散的悬浮状态
菌细胞而言的微生物的另一种独特生存形式，生物膜的形成
可明显降低其对抗菌药物的敏感性甚至产生耐药［12］。近年
来，由生物膜引起的微生物耐药情况明显增加，有报道指出
大约有 65%的人类感染与生物膜有关［13］。研究证明，与浮
游菌相比，形成生物膜后微生物的 MIC 和最低杀菌浓度
(Minimum Bactericidal Concentration，MBC)均增加 10 － 1000
倍，并且其耐药性随着生物膜的成熟而增强［14］。
本试验在前期研究的基础上采用定量检测白念珠菌生
物膜的最常用方法即 XTT 减低法进一步探讨白鲜皮提取
物对体外抗白念珠菌生物膜方面的影响，该方法在不破坏
生物膜的条件下能检测出生物膜中菌细胞的活性。近期研
究证实，白念珠菌标准株 ATCC10231 具有较强的形成生物
膜功能［15］。本试验所用即为此标准菌株。结果显示，白鲜
皮提取物对白念珠菌 MIC 为 128 μg /mL，对白念珠菌
SMIC50 与 SMIC80 分别为 256、512 μg /mL，有文献报道，降
低 50%生物被膜的活性需要的药物浓度为浮游态的 5 ～ 8
倍，为相应 MIC值的 20 ～ 2000 倍［16］由此可见，白鲜皮提取
物有较强的抗生物膜功能。
Chandra等［17］发现白念珠菌生物膜的形成分为 3 个阶
段:早期(0 ～ 11 h)，中期(12 ～ 30 h)和成熟期(38 ～ 72 h)。
早期的黏附尤为重要，随着培养时间的延长，生物膜逐渐发
育成熟。本实验结果显示，16 ～ 512 μg /mL 白鲜皮提取物
对白念珠菌的早期黏附有明显的抑制功能，呈浓度相关性，
提示其对白念珠菌生物膜的发育有明显的干预作用。提示
早期、足量使用白鲜皮提取物，对医学植入材料相关白念珠
菌生物膜的预防和治疗可能具有一定的作用。
ALS基因是编码白念珠菌细胞壁表明大分子糖蛋白的
一组基因，与白念珠菌细胞和宿主之间的黏附有密切关系，
其表达产物 Alsp 属糖磷脂酰肌醇依赖性细胞壁蛋白，即
GPI锚定蛋白，其 N端为信号肽，C端通过 GPI锚定于细胞
壁上。ALS基因家族至少包含 8 个基因，研究发现 ALS3 的
高表达能修复在活体内和体外白念珠菌模型上 bcr2(bio-
film and cell wall regulator)基因变异导致的生物膜形成障
碍［18］。Zhao［19］等构建 ALS3 的缺失突变株对口腔黏膜细
胞以及对血管内皮细胞的粘附力缺失，认为 ALS3 基因编
码重要的白念珠菌表面黏附成分，在体外白念珠菌生物膜
形成中发挥着重要的作用。HWP1 基因表达的产物 Hwp1p
属于 GPI锚定蛋白，表达于菌丝表面，是第一个已知的白念
珠菌生物膜形成所必需的细胞表面蛋白。Nobile［20］等发
现，Hwp1p还与 Als3p互补，促进白念珠菌菌丝之间的相互
黏附，而这种黏附对生物膜的形成至关重要。
q ＲT － PCＲ 实验结果显示，用 256 μg /mL白鲜皮提取
物作用后，ALS3、HWP1 表达均下降。从基因水平表明白鲜
皮提取物对白念珠菌生物膜的抑制作用。由于 ALS3、
HWP1 均受 Ｒas /cAMP 通路的调控［21 － 22］，我们推测，白鲜
皮提取物的抗被膜能力与抑制 Ｒas /cAMP 通路的功能有
关，有待进一步研究证实。
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DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2015． 05． 020
毛冬青总提取物的抗血栓作用及基于 ADP的机制研究
陈元元，熊天琴，赵玉民，廖嘉仪，林曦，谭庆龙，赵钟祥
(广州中医药大学，广东 广州 510006)
摘 要:目的:研究毛冬青总提取物的抗血栓作用。方法:采用家兔体外血凝块溶解实验，胶原 －肾上腺素小
鼠血栓实验，角叉菜胶小鼠血栓实验，FeCl3大鼠血栓形成实验，观察毛冬青提取物溶解血栓和抗血栓形成的作
用。结果:毛冬青总提取物的 0． 2 mg /mL浓度对体外形成的家兔血凝块有明显的溶解作用;毛冬青总提取物(1、
0． 5、0． 25 g /kg)剂量组均能减少胶原蛋白 －肾上腺素诱发血栓形成小鼠的死亡数，增加保护率;能减少角叉菜胶
诱导血栓形成小鼠的相对黑尾长度;毛冬青总提取物(195、97． 5、48． 75 mg /kg)各剂量组均减轻 FeCl3颈动脉血栓
模型大鼠的血栓的重量和内皮受损程度;降低 ADP诱导的血小板聚集率;降低 FIB的含量及抑制 P2Y12受体的表
达，对 APTT、TT、PT的表达几乎无影响;提高 cAMP的表达水平;减少 TXB2和 P －选择素的含量、不影响 6 － Keto
－ PGF1α的表达;并降低血小板胞浆 Ca
2 +平均荧光强度及抑制 GPⅡb /Ⅲa的表达。结论:毛冬青总提取物具有一
定的抗血栓的作用，能改善血管内皮的受损程度，具有保护血管内皮的作用，并通过影响 P2Y12受体 αGi 亚单位
和 βγ亚单位功能的表达，降低 P2Y12受体的含量，抑制血小板的聚集，最终抑制血栓的形成。
关键词:毛冬青总提取物;抗血栓;血小板;P2Y12受体
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2015)05-1092-05
Antithrombotic Activity of Ilex Pubescens Total Extract and
the Action of Mechanism Based on ADP
收稿日期:2015 － 01 － 09
基金项目:国家自然科学基金项目(81270054，30901954);广东省优秀青年教师培养计划项目(Yq2013045) ;广州市珠江科技新星专项
(2011J2200047)
作者简介:陈元元(1986 －)，女，山西临汾人，助教，硕士，研究方向:中药药效物质基础及作用机制。
通讯作者:熊天琴(1973 －)，女，四川新都人，教授，硕士研究生导师，博士，研究方向:中药药效物质基础及作用机制研究。