全 文 ：ISSN　 1007-7626
CN　 11-3870 /Q
中国生物化学与分子生物学报
Chin. J. Biochem. Mo l. Biol. 2000, V ol. 16, No. 2, 281～ 284
第 16卷第 2期
2000年　 4月
　联系人:韩平治 ,男 , 1964年 10月生 ,硕士 ,主管检验师
Tel: ( 0931) 8281797
收稿日期: 1999-05-21,修回日期: 1999-09-22
·研究简报·
赤豆子叶 β-半乳糖苷酶的纯化及其性质的研究
韩平治　孟延发 1)　丁进芳
(甘肃省临床检验中心 ,兰州 730000; 1)兰州大学生物系 ,兰州 730000)
Purif ication and Characterization of β-Galactosidases
from Adsuki Bean Cotyledons
HAN Ping-zhi, M EN G Yan-fa
1)
, DING Jing-fang
(Clinical Analyt ical Cen tre of Gansu Province, Lan zhou 730000; 1) Depar tment of B iology, Lanzhou University, Lan zhou 730000,Ch ina )
Abstract　 Theβ -galacto sidase A and B from Adsuki bean co tyledons w ere isolated by ammonium
sul fate f ractiona tion and DEAE-Sepharo se FF ion exchange chromatog raphy. The A form w as
further purified by CM-Sepharose FF ion exchange chromatog raphy and Sephadex G-150 gel fi l-
t ration. Purifiedβ -galacto sidase A show ed one protein band on PAGE. It w as also a sing le pro tein
band on SDS-PAGE and i ts Mr was 3. 3× 104 .Mr of A and B determined by g radient PAGE was
the same as 1. 4× 105 . It i s suggested that β -galactosidase A comprised four identical subunits.
The pI of β -galactosidase A and B estimated by isoelectric focusing PAGE were 7. 6 and 4. 6 re-
spectiv ely. The appa rent Km o f A and B w ere 2. 08 mmol /L and 2. 45 mmol /L ( ON PGal ) , 0. 75
mmol /L and 1. 24 mmol /L( PN PGal) , 44 mmo l /L and 25 mmol /L( lactose) . Thei r activ ation ener-
gies w ere 43. 9 k J/mo l and 34. 3 kJ /mol using ONPGa l as subst ra te. Their optimum pH all w ere
4. 0. Thei r optimum tempera tures w ere 50℃ and 55℃ respectiv ely. Stabi li ty ranges o f pH were
pH 4. 0～ 6. 0 and pH 3. 5～ 5. 0 separately. Ga lactose and lactose w ere reversibly competitiv e in-
hibitors. Ki for A w ere 6. 21 mmol /L ( galacto se) and 329 mmol /L ( lactcse) , Ki for B w ere 3. 93
mmol /L( galacto se ) and 169 mmol /L ( lactose) . Melibio se and raf finose w ere reversibly uncompet-
itiv e inhibi to rs against the enzymes. M etal ions and some chemical ag ents also show ed inhibition
against the enzymes.
Key words　β -Galacto sidase, Adsuki bean co tyledons, P. angularis Wigh t
中图分类号　 Q814. 1
　　β-半乳糖苷酶 ( EC3. 2. 1. 2)广泛存在于动植物
的组织中 ,如在杏仁、桃子、大豆、咖啡豆等植物 ,蜗
牛 ,哺乳动物的肠道中都有 β -半乳糖苷酶 . 同样 ,微
生物也能产生 β -半乳糖苷酶 ,俗称乳糖酶 .乳糖操纵
子学说的提出就是建立在对微生物 β -半乳糖苷酶研
究基础之上的 . 在过去的研究中 ,关于微生物、动物
来源的乳糖酶报道较多 [1 ] ,而对于植物来源的 β-半
乳糖苷酶研究报道却相对较少 [2 ] . 它可能降解多糖
中 β -构型半乳糖苷键 ,为种子生长发育提供必要的
能量来源 . 但目前对 β -半乳糖苷酶在植物中确切的
生理生化功能尚不清楚 . 为了进一步阐明该酶在植
物细胞或组织中的生理生化功能 ,必要的前提是将
该酶分离纯化 ,并对其性质进行研究 . 赤豆 ( Adsuki
bean, Phaseolus angularis Wigh t )属豆科 ,菜豆属 ,
蝶型花亚科 ,是一种可食用豆类 .我们分离纯化了赤
豆子叶 β -半乳糖苷酶 ,并将其基本性质进行了较为
深入研究 .
1　材料和方法
1. 1　材料和试剂
市售赤豆子表面消毒后 ,室温浸泡 36 h,在
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 2000. 02. 030
25℃通风暗培养 6～ 7 d,收集子叶作为提取 β -半乳
糖 苷 酶 的 材 料 . DEAE-Sepha ro se FF、 CM-
Sepharose FF均购自 Sigma公司 ;等电点标准蛋白
质、分子量标准蛋白质、两种电解质 Pharmaly te
pH3～ 10和 Sephadex G-150均为 Pha rmacia产品 ;
其它试剂均为国产分析纯 .
1. 2　方法
1. 2. 1　酶活性测定　反应体系由 2. 0 ml , 5 mmo l /
L ON PGal, 0. 2 ml , pH4. 0, 0. 1 mo l /L NaAc-HAc
缓冲液 , 0. 1 m l适当稀释的酶样组成 . 在 50℃准确
反应 15 min,加 1. 0 ml, 0. 2 mol /L碳酸钠溶液终止
反应 . 测定 420 nm处吸光度 . 据产物邻硝基酚
( ON P)释放量算出酶活性单位 .酶活性单位 U定义
为在规定条件下 ,每分钟催化生成 1 nmol ON P所
需酶量 . 酶比活性为每毫克蛋白质含有的活性单位
数 ( U /mg ) .
1. 2. 2　酶的纯化　除特别说明外 ,整个纯化过程在
0～ 4℃条件下进行 . ( 1)粗酶液的制备　赤豆子叶加
预冷的 2倍体积 (W /V )缓冲液 A( 0. 05 mol /L
Tris-HCl pH7. 0,内含 5%甘油和 1 mmol /L ED-
T A-Na2 ) . 匀浆 ,抽提 ,过滤 , 77 000 g冷冻离心 20
min,收集上清液即为粗酶液 . ( 2)硫酸铵分级沉淀
　粗酶液用固体硫酸铵 30%～ 75%饱和度分级分
离 ,收集沉淀 ,用缓冲液 A透析除盐 ,聚乙二醇 -
20 000浓缩至适当体积 . ( 3) DEAE-Sepha ro se FF
离子交换层析　按产品说明将树脂处理成 Cl-型 .
将上述酶液适量上到预先用缓冲液 A充分平衡好
的 DEAE-Sepharose FF柱 ( 2. 6 cm× 15 cm ) ,流速
0. 8 m l /min, 2. 4 ml /管 .先用缓冲液 A洗脱 ,后用 0
～ 0. 5 mol /L NaCl缓冲液 A直线梯度洗脱 .分离获
得具有 β -半乳糖苷酶活性的 2种酶 ,酶 A和 B.酶 A
用缓冲液 B ( pH5. 0, 0. 05 mmo l /L NaAc-HAc )透
析 ,然后浓缩至适当体积 . ( 4) CM-Sepharose FF离
子交换层析　按产品说明将树脂处理成 H+ 型 . 将
上步纯化的 A液加至预先用缓冲液 B充分平衡好
的 CM-Sepharose FF柱 ( 2. 6 cm × 15 cm ) ,流速
0. 8 m l /min, 2. 4 ml /管 .先用缓冲液 B洗脱 ,然后用
0～ 1. 0 mo l /L NaCl缓冲液 B直线梯度洗脱 ,收集
酶活性组分 ,用缓冲液 C( 0. 01 mol /L PBS pH6. 0,
含 0. 01 mo l /L NaCl )透析脱盐 ,浓缩至适当体积 .
( 5) Sephadex G-150凝胶过滤　按产品说明处理凝
胶 . 将上步酶液上预先用缓冲液 C平衡好的
Sephadex G-150柱 ( 1. 5 cm× 60 cm ) ,用缓冲液 C
洗脱 ,流速 0. 2 m l /min, 2. 0 ml /管 ,收集酶活性组
分 .
1. 2. 3　纯度鉴定　 PAGE采用不连续凝胶电泳 ,除
不含 SDS处 ,其余条件同 SDS-PAGE. SDS-PAGE
用 Laemmli的方法 [3 ] ,浓缩胶 3% ,分离胶 12. 6% .
1. 2. 4　分子量及 pI测定　分子量用 4%～ 30%梯
度 PAGE,按 Pha rmacia标准分子量蛋白使用说明
提供的方法 . pI用 Spielman的 IEF-PAGE方法 [4 ] .
1. 2. 5　蛋白质检测　蛋白质含量测定用 Low ry
法 [5 ] ,以牛血清白蛋白为标准 .
1. 2. 6　酶的其它性质测定　均按文献 [6 ]方法进
行 .
2　结　　果
2. 1　酶的分离纯化
粗酶液经硫酸铵 30% ～ 75%饱和度分级分离 ,
DEAE-Sepharose FF离子交换层析分离得到 2种
酶 ,依其洗脱先后顺序 ,分别称为 β-半乳糖苷酶 A
和 B( Fig. 1) ,我们将活性较高的酶 A再分别经
CM-Sepharose FF离子交换层析和 Sephadex G-150
分子筛层析进一步纯化 . 酶 B由于活性较低 ,未进
一步纯化 . 酶 A经过纯化 ,收率 2. 4% ,纯化倍数
67. 9( Table 1) . 纯化的酶 A在不连续 PAGE上显
示一条蛋白带 ,在不连续 SDS-PAGE也显示一条蛋
白带 ( Fig. 2) .
Fig. 1　 DEAE-Sepharose F F column ch romatog raph y of β-
g alactosidas e f rom Adsuki bean co tyledons
— — Activi ty ofβ-galactosidas e;— Abso rbance in 280 nm
2. 2　酶基本性质分析
纯化的酶 A经不连续 SDS-PAGE测得亚基 Mr
3. 3× 104 ,用 DEAE-Sepha rose FF离子交换层析分
离的酶 A和 B,经 4% ～ 30%梯度 PAGE测出全酶
分子量均为 1. 4× 105 .用 IEF-PAGE测得酶 A等电
点为 pH7. 6,酶 B等电点为 pH4. 6.
282 中国生物化学与分子生物学报 16卷
Table 1　 Purifica tion o f β -galacto sida ses fr om Adsuki bean co tyledons
Step Engyme
Protein
/mg
Act ivi ty /U
Specif ic act ivi ty
/U· mg- 1
Puri fication
factor
Recov ery
(% )
C rud e ex tration A& B 2007. 6 156300 77. 8 1. 0 100
30%— 75% ( N H4 ) 2 SO4 A& B 280. 7 91300 325. 3 4. 2 58. 4
DEAE-Sepharose
A
B
67. 7
44. 6
31296
15808
462. 4
354. 1
5. 9
4. 6
20. 0
10. 1
CM-Seph aros e A 2. 17 21310 2535. 5 32. 6 3. 5
Sephadex G-150 A 0. 7 3700 5285. 7 67. 9 2. 4
Fig. 2　 PAGE ( a) and SDS-PAGE( b ) of β-galactosidase A
pu rif ied f rom Adsuki bean
A: β-Galactosidase A; M: Marker
2. 3　酶动力学性质分析
2. 3. 1　 pH对酶活性的影响　在不同 pH, 50℃ ,测
定酶活性 ,反应体系同酶活性测定 . 结果表明酶 A
和 B在 pH4. 0时均表现出最高的相对活性 .将酶在
不同 pH缓冲液中 , 50℃处理 30 min,然后将反应体
系 pH调至 4. 0,测定酶活性 . 结果表明酶 A的酸碱
稳定范围在 pH4. 0～ 6. 0,酶 B在 pH3. 5～ 5. 0之
间 .
2. 3. 2　温度对酶活性的影响　反应体系同酶活性
测定 ,在不同温度测定酶活力 .结果表明在本实验条
件下 ,酶 A和 B的最适温度分别为 50℃和 55℃ . 上
述反应体系不变 ,将酶在不同温度处理不同时间 ,然
后在最适条件下测定酶活性 ,结果表明 ,酶 A和 B
在 40℃ ,不同时间处理时无活性丧失 . 50℃处理 45
min时 ,酶 A尚有 80%活性 ,酶 B有 85%活性 .
60℃处理 15、 30、 45 min,酶 A剩余活性分别为
62%、 37%和 25% ,而酶 B的剩余活性分别为 90%、
60%和 55% ,在 70℃处理时 ,酶 A活性迅速下降、
处理 15 min活性几乎全部丧失 ,而酶 B活力下降稍
缓 , 15 min时仍有 80%活力 , 30 min时活力仅为
5% , 45 min时活力几乎全部丧失 .
2. 3. 3　米氏常数 Km值测定　反应体系同酶活性
测定 ,以 ON PGal 0. 833～ 10 mmol /L, PN PGal 0. 1
～ 2. 0 mmol /L 和乳糖 8. 33～ 100 mmol /L ,用
Linew eaver-Burk作图法测定其表现 Km ,测得酶 A
的 Km 为 2. 08 mmo l /L ( ON PGal )、 0. 75 mmol /L
( PN PGal)和 44 mmol /L(乳糖 ) ,酶 B的 Km为 2. 45
mmol /L ( ON PGal )、 1. 24 mmol /L ( PN PGal )和 25
mmol /L(乳糖 ) .
2. 3. 4　酶促反应活化能的测定　反应体系同酶活
性测定 .分别在 20℃、 30℃、 40℃和 50℃下测定酶促
反应的最大反应速度 Vm ,以 lg Vm- 1 /T作图求得
酶 A的活化能为 43. 9 k J/mol,酶 B的活化能是
34. 3 k J /mol.
Fig. 3　 Linew eaver-Bu rk plot s ofβ-galactosidas e A
1: None; 2: 10 mmol· L- 1 raff inos e; 3: 2. 5 mmol· L- 1
melibiose; 4: 200 mmol· L- 1 lactose; 5: 10 mmol· L- 1g alac-
tos e
2. 3. 5　底物类似物对酶活性的影响　反应体系同
酶活性测定 .加入不同底物类似物 ,以不加任何类似
物为对照 . 结果表明半乳糖、乳糖、蜜二糖和棉子糖
对酶活性有不同程度的抑制作用 . 用 Linew eaver-
Burk作图法得出 ,半乳糖和乳糖为该酶的竞争性抑
制剂 ,而密二糖和棉子糖是反竞争性抑制剂 ( Fig 3,
4) . 酶 A的 Ki值的 6. 21 mmol /L(半乳糖 )和 329
283第 2期 韩平治等: 赤豆子叶 β -半乳糖苷酶的纯化及其性质的研究 　
mmol /L (乳糖 ) ,酶 B的 K i值为 3. 93 mmol /L (半
乳糖 )和 169 mmo l /L(乳糖 ) . 蔗糖、纤维素二糖、麦
芽糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和岩藻糖对酶
A和 B活性都没有明显的影响 .
Fig. 4　 Linew eav er-Burk plo ts of β-galactosidase B
1: None; 2: 2. 5 mmol· L- 1 melibios e; 3: 10 mmol· L- 1 raf-
finose; 4: 200 mmol· L- 1 lactose; 5: 10 mmol· L- 1galactose
2. 3. 7　一些化学试剂对酶活性的影响　以 25
mmol /L ON PGal为底物 ,加入不同化学修饰剂 ,以
不加者为对照 . 化学修饰剂 DTN B在 5 mmol /L
时 ,对酶活性无影响 ,而 N EM、 PCMB和 N BS对酶
活性有显著的影响 . Zn2+ 、 Cu2+ 、 Hg2+ 、 Ag+ 等金属
离子对酶活性有强烈的抑制作用 .
3　讨　　论
纯化的赤豆子叶 β-半乳糖苷糖 A天然分子量
为 140 kD,亚基分子量为 33 kD,推测酶 A由 4个
相同分子量的亚基组成 ,这与蓖麻 [7 ]、蚕豆 [8 ]和豇
豆 [9 ]β -半乳糖苷糖的组成有较大差别 . 我们从赤豆
子叶分离出 2种 β -半乳糖苷糖 , A和 B.酶 A的等电
点为 pI7. 6在中性范围 ,酶 B的等电点 pI在酸性范
围是 4. 6,也与文献报道不同 . 从酶动力学性质上
看 ,赤豆子叶 β -半乳糖苷糖在最适 pH、最适温度、酸
碱稳定性以及对人工合成底物 ON PGal和 PN PGal
的表观 Km等方面都与其它植物 β -半乳糖苷糖相
似 . 值得注意的是赤豆子叶 β -半乳糖苷糖 B比其它
植物 β -半乳糖苷糖具有更好的热稳定性和对乳糖底
物更高的亲和性 . 最适温度达 55℃ , 50℃处理 45
min仍然保留 85%活力 . 赤豆子叶 β -半乳糖苷糖 B
对乳糖的表观 Km值为 25 mmol /L,而牛奶中乳糖
浓度是 250 mmol /L ,这就使此酶用于工业化酶解
牛奶中的乳糖从而制造低乳糖饮品成为可能 . 低乳
糖饮品在我国尚无产品 . 以往的研究都以微生物来
源的 β-半乳糖苷糖为材料 ,还没有植物来源 β -半乳
糖苷糖应用于此工艺的研究报道 .植物来源的酶 ,不
用担心象使用微生物酶那样可能会造成食品的污
染 ,而且取材方便 ,又有较好的热稳定和酸碱稳定
性 ,所以进一步对赤豆子叶 β -半乳糖苷糖的固定化
和应用于牛奶软化工艺的研究有着广阔的前景 . 另
外 ,从抑制动力学性质分析表明 , Zn2+ 、 Cu2+ 、 Hg2+ 、
Ag+ 、 PCMB、 NBS和 N EM对赤豆子叶 β -半乳糖苷
糖 A和 B催化活性有强烈的抑制作用 ,提示巯基可
能与酶活性有关 .
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284 中国生物化学与分子生物学报 16卷