全 文 ：文章编号: 1004-0366( 2001) 01-0059-03
收稿日期: 2000- 05- 30
赤豆U-半乳糖苷酶固定化及其性质研究
韩平治1 , 丁进芳 1 , 孟延发 2
( 1. 甘肃省临床检验中心 ,兰州　 730000; 2. 兰州大学生物系 ,兰州　 730000)
摘　要: 　用阳离子修饰的 Sephadex G-100,经 BrCN活化 ,将部分纯化的赤豆 U-半
乳糖苷酶通过吸附和共价交联法固定化。固定化载体表现出较高的蛋白载量和酶活性
收率。固定化酶活性收率达 65% 。动力学性质研究表明 ,固定化酶酸碱稳定性、热稳定
性、存储稳定性和使用稳定性都比游离酶好。
关键词:　赤豆 ; U-半乳糖苷酶 ; 固定化酶
中图分类号:　 Q556　　　文献标识码:　 A
植物特别是豆类植物 ,含有丰富的U-半乳糖苷酶。根据研究 [1 ] ,用简单、便宜的方法就可
获得相对较高活性的U-半乳糖苷酶 ,赤豆U-半乳糖苷酶对乳糖表现出较高的亲和力 ,使该酶
用于工业化酶解牛奶中乳糖成为可能。目前 ,低乳糖饮品在我国尚无产品 ,也未见植物来源U-
半乳糖苷酶应用于此工艺的研究报道。植物来源的酶 ,不用担心象微生物酶那样可能会造成食
品的污染 ,而且取材方便 ,又具有较好的热稳定性和酸碱稳定性 ,所以对赤豆U-半乳糖苷酶的
固定化研究在牛奶工业上有着广阔的应用前景。我们用修饰的葡聚糖凝胶作载体 ,成功地实现
了赤豆U-半乳糖苷酶的固定化 ,并对其性质进行了研究。
1　材料和方法
1. 1　材料
市售赤豆表面消毒后 ,室温浸泡 36 h, 25℃通风暗培养 6～ 7 d,收集赤豆子叶作为提取
U-半乳糖苷酶的材料。 Sephadex G-100购自瑞典 Phamacia公司 , DEAE-Sepharose FF、邻硝
基苯基U-D-半乳糖苷 ( ON PGal)购自美国 Sigma公司。 其它试剂为国产分析纯。
1. 2　方法
( 1)酶活性测定　反应体系由 0. 2 mL, 5 mmol /L ON PGal, 0. 2 mL, pH4. 0, 0. 1 mol /L
NaAc-HAc缓冲液 , 0. 1 mL适当稀释的酶样或 0. 1 g固定化酶组成。在 50℃准确反应 15 min,
加 1. 0 m L, 0. 2 mol /L碳酸钠溶液终止反应。 测定 420 nm处吸光度。 据产物邻硝基酚
( ON P)释放量算出酶活性单位。酶活性单位 U定义为在规定条件下 ,每分钟催化生成 1 nmo l
ON P所需酶量。酶比活性为每 mg蛋白质含有的活性单位数 ( U /mg )。
( 2)酶的纯化　除特别说明外 ,整个纯化过程在 0～ 4℃条件下进行。①粗酶液的制备:赤
豆子叶加预冷的 2倍体积 (m /v )缓冲液 A( pH7. 0, 0. 05 mol /L Tris-HCl,内含 5%甘油和
1 mmol /L EDT A-Na2 )。匀浆 ,抽提 ,过滤 , 77 000 g冷冻离心 20 min,收集上清液即为粗酶液。
第 13卷　第 1期
2001年 3月 　　　　　　　　　　
甘肃科学学报
Journal of Gansu Sciences
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol. 13　 No. 1
Mar. 2001
DOI : 10. 16468 /j . cnki . i ssn1004 -0366. 2001. 01. 012
②硫酸铵分级沉淀:粗酶液用固体硫酸铵 30% ～ 75%饱和度分级分离 ,收集沉淀 ,用缓冲液 A
透析除盐 ,聚乙二醇 - 20 000浓缩至适当体积。③ DEAE-Sepharose FF离子交换层析:按产品
说明将树脂处理成 Cl-型。 将上述酶液适量上到预先用缓冲液 A充分平衡好的 DEAE-
Sepharose FF柱 ( 2. 6 cm× 15 cm ) ,流速 0. 8 mL /min, 2. 4 mL /tube。先用缓冲液 A洗脱 ,后用
0～ 0. 5 mol /L NaCl缓冲液 A直线梯度洗脱。分离获得具有U-半乳糖苷酶活性的 2种酶 ,酶
A和 B。 根据以前的研究 ,我们选择酶 B用于固定化研究。　　　　　　　　　　
　　 ( 3) 酶的固定化方法　① Sephadex G100阳离子化采用 Per terson方法 [2 ] ;②修饰
Sephadex G-100的活化按照文献方法 [3 ] ;③固定化酶的制备: 活化的修饰 Sephadex G-100
( 10 g ) ,加入适量部分纯化的赤豆U-半乳糖苷酶 ,室温搅拌 2 h , 4℃放置 1 d。然后用蒸馏水及
缓冲液 A洗涤 ,至洗涤液无酶蛋白 ,冷藏保存备用。
( 4)蛋白质含量测定　用 Low ry法 [4 ] ,以牛血清白蛋白为标准。
2　结果
表 1　两种载体固定化酶性能指标比较
固定化酶 总活性
U /g(干胶 )
蛋白浓度
mg /g (干胶 )
比活
U /mg
活性收率
%
非修饰凝胶 6 000 40 150. 00 11. 1
修饰凝胶 32 880 128 256. 80 65. 0
　　 ( 1)酶固定化情况　表 1比较了
经过修饰的 Sephadex G-100为载体
和 Sephadex G-100直接作载体将酶
固定化后各项参数比较 ,从表 1可见
修饰的 Sephadex G-100固定化酶活
性收率达 65% ,而不经修饰 Sephadex G-100固定化酶活性收率仅 11. 1%。
( 2)最适 pH及酸碱稳定性　用不同 pH( 2. 0～ 10. 0)的缓冲液 , 50℃ ,反应体系同酶活性
测定 ,以U-ON PGal为底物测定酶活性。 结果表明 ,固定化赤豆 U-半乳糖苷酶最适 pH5. 5,而
游离酶的最适 pH4. 0。将酶在不同 pH缓冲液中 , 50℃处理 30 min,然后将反应体系 pH调整
到 4. 0,测定酶活性。结果表明 ,固定化酶酸碱稳定范围在 pH4. 0～ 8. 0,游离酶酸碱稳定范围
在 pH3. 5～ 5. 0。
( 3)最适温度及热稳定性　在不同温度 ( 30℃～ 70℃ ) , p H4. 0,U-ON PGal为底物测定酶
活性。结果表明 ,在本实验条件下 ,固定化酶最适温度为 60℃ ,比游离酶的最适温度 55℃高
5℃。在以上反应体系条件下 ,将酶在不同温度处理不同时间 ,然后在 50℃测定酶活性。结果表
明 ,固定化酶 60℃时 45 min处理仍然有 90%活性 ,而游离酶仅剩 50%活性 ; 70℃时 45 min处
理 ,固定化酶尚有 70%活性 ,而游离酶几乎全部失活。
　　 ( 4)储存稳定性和操作稳定性　固定化酶和游离酶在无底物存在下 , 4℃保存 60 d,固定
化酶仍然有 90%活性 ,游离酶仅剩 62%活性。 以 U-ON PGal为底物和固定化酶在室温反应
2 h,然后过滤、洗涤 ,回收固定化酶 ,下次再用。经过 9次反复使用 ,固定化酶仍具有 75%剩余
活性。
3　讨论
寻找一种理想的酶固定化载体 ,固定化酶活性收率是一个很重要的指标。修饰 Sephadex
G-100固定化酶活性收率达 65% ,而未经修饰的 Sephadex G-100固定化酶活性收率仅
11. 1% 。这表明载体表面电荷增加了酶蛋白与载体的结合几率。固定化酶活性丢失 ,主要是由
于立体位阻效应造成。 1999年邱广亮 [5 ]用吸附和交联法固定化葡萄糖苷酶活性收率 63% ,与
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文献比较表明修饰 Sephadex G-100是固定化赤豆U-半乳糖苷酶良好载体。
固定化酶最适 pH增高 ,阳离子载体使酶的最适 pH偏碱 ,固定化酶酸碱稳定性范围增大 ,
这与 Rejikumar报道相符 [6 ]。酶经固定化后 ,最适温度增加 ,热稳定性明显提高。固定化酶贮存
稳定性也比游离酶好。 固定化酶经 9次反复使用 ,仍然保持 75%活性 ,这是游离酶无法实现
的。游离酶只能使用一次 ,不能与产物分离回收使用 ,使用效率低使生产成本增高 ,几乎无法应
用于工业化生产。通过酶的固定化 ,才能实现反复连续反应 ,产物与酶易分离 ,从而大大提高了
酶的使用效率和降低了生产成本 ,只有这样酶才能被应用于工业化生产。 以上以化学修饰
Sephadex G-100为载体 ,成功地实现了赤豆U-半乳糖苷酶的固定化 ,为植物 U-半乳糖酶工业
化应用提供了必备的理论基础和技术支持。
参考文献:
[ 1 ]　韩平治 ,孟延发 ,丁进芳 .赤豆子叶U-半乳糖苷酶纯化及其性质研究 [ J] .中国生物化学与分子生物学报 , 2000, 16( 1):
281～ 284
[ 2 ]　 Per terson E A, Sober H A. Ch romatograph y of Proteins I. Cellulose ion-ex change Adso rben ts [ J ] . Am Chem Soc
1956, 78: 751～ 755
[ 3 ]　华家柽 ,奚国良 ,易庆成编译 .实用蛋白质化学技术 [M ].上海:上海学科学技术出版社 , 1982. 451～ 452
[ 4 ]　 Low ry O H. Pro tein Measu rement w ith th e Folinph enol Reagen t [ J ] J Biol Ch em 1951, 193: 265～ 268
[ 5 ]　邱广亮 ,德力格尔 ,栗淑缓等 .磁性聚乙二醇载体固定化葡萄糖沉淀粉酶的研究 [ J] .生物化学与生物物理进展 , 1999,
26: 56～ 58
[ 6 ]　 Rejikumar S, Devi S. Imm obi lization ofU-Galactosid as es on to ploymeric sup po rts [ J ]. J Applied Poly Sci, 1995, 55:
871～ 878
IMMOBILIZATION AND CHARACTERIZATION OFβ-GALACTOSIDASE
FROM ADUKI BEAN
HAN Ping-zhi
1
, DIN G Jin-fang
1
, M EN G Yan-fa
2
( 1. Clinical Laboratory Centre of Gansu Province, Lanzhou 730000, China;
2.Dept of Biology , Lanzhou University , Lanzhou 730000, China )
Abstract: 　 Sephadex G-100 was modified into cationic carrier and activa ted by BrCn. U-
Galactosidase ( EC 3. 2. 1. 23) par tially purified f rom Adsuki Bean w as immobi li zed on modi-
fied Sephadex G-100 by means o f adsorption o f ions and crosslinked reaction. The carrier has
a high er protein-binding capaci ty and a higher yield of enzyme activi ty. Kinetic resul ts
show ed that the immobili zed enzyme activi ty at tained is maximum at 60℃ . The operationa l
pH range of the immobi li zed preparation was incereased. It show ed that the sto rage stabi li ty
o f immobilized enzyme w as bet ter than tho se of f ree enzyme. The results o f repeated experi-
ments suggested tha t the immobi li zed ex zyme could be reused.
Key words: 　 Adsuki bean; phaseolus angularis w igh t; U-Galactosidase; immobili zed en-
zymes
作者简介:
韩平治 ,男 ( 1964-) ,陕西省宝鸡市人 , 1997年毕业于兰州大学生物学系。 现任主管检验师 ,主要从事临床
化学检验与研究工作。
61第 13卷　　　　　　　　　　　　　韩平治等:赤豆U—半乳糖苷酶固定化及其性质研究