全 文 ：中国环境科学 2015,35(3)：833~838 China Environmental Science

天蓝苜蓿锌胁迫下实时定量 PCR内参基因筛选
张德辉,孙亚丽,赵 亮,丑敏霞
*
(西北农林科技大学生命科学学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西
杨凌 712100)

摘要：选取 8个管家基因(h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、cyp、gapdh)作为候选内参基因,以不同浓度 Zn2+处理下接菌第 30d的天蓝苜蓿
(Medicago Lupulina L.)接种根为实验材料,筛选用于目的基因实时荧光定量 PCR分析的最佳内参基因.研究表明:候选内参基因平均表达稳
定性由高到低排序为:ef1>ubi>act>h2a>gapdh>cyp>18s>tub;在不同 Zn2+浓度胁迫下,最适内参基因组合各不相同:Zn2+=100mg/kg 时,最佳内
参基因组合为 tub (1.97)和 ef1 (2.06); Zn2+=200mg/kg时,最佳内参基因组合为 ef1 (1.41)和 ubi (2.51); Zn2+=300mg/kg时,最佳内参基因组合
为 ef1 (1.41)和 h2a (2.78); Zn2+=400mg/kg时,最佳内参基因组合为 ef1 (2.45)和 act (2.55).该研究可为重金属污染地天蓝苜蓿抗性基因和共
生基因的表达分析提供理论依据.
关键词：天蓝苜蓿；接种根；内参基因；实时荧光定量 PCR；锌
中图分类号：X53 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2015)03-0833-06

Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in Medicago Lupulina under zinc stress.
ZHANG De-hui, SUN Ya-li, ZHAO-Liang, CHOU-Min-xia* (College of Life Sciences, State Key Laboratory of Crop
Stress Biology in Arid Areas, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China). China
Environmental Science, 2015,35(3)：833~838
Abstract：Expression stability of candidate reference genes (h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、cyp、gapdh) was tested for
qRT-PCR during growth conditions under the different zinc stress. The roots of Medicago lupulina inoculated with
rhizobia were harvested in 30days as plant materials. Our results showed that the average expression stability of the eight
candidate reference genes from high to low was ef1>ubi>act>h2a>gapdh>cyp>18s>tub overall. Specifically, tub (1.97)
and ef1 (2.06) were better reference genes under the low Zn2+ concentration (100mg/kg); The genes ef1 (1.41) and ubi
(2.51) were the best genes under Zn2+ concentration (200mg/kg); Under Zn2+ concentration (300mg/kg), ef1 (1.41) and
h2a (2.78) were the most comparatively suitable genes; while ef1 (2.45) and act (2.55) were considered as the most
reliable reference genes under the high Zn2+ concentration (400mg/kg). In conclusion, All results provide the theoretical
foundation for gene expression study in Medicago lupulina under the different Zn2+ concentration.
Key words：Medicago Lupulina；the inoculated roots；reference gene；quantitative real-time PCR；Zn

土壤是人类赖以生存的主要资源之一,随着
工业经济的发展,土壤污染尤其是重金属污染尤
为突出
[1-2]
,而某些微生物、植物与微生物共生体
对重金属污染土壤的修复发挥着重要作用
[3]
.重
金属污染的土壤,氮素不足是限制植被恢复的关
键因子之一,因此提高重金属污染土壤中氮素水
平成为生态修复的首要工作
[4]
.豆科植物---根瘤
菌的共生体系因其卓越的固氮能力,常作为尾矿
地环境修复的先锋植物.
目前,许多国家都非常重视重金属耐性豆科
植物的选择和根瘤菌的研究以及利用豆科植物
根瘤菌共生体系进行重金属污染地修复的实践.
Piha 等
[5]
在 Sn 矿尾矿地进行植被重建的试验研
究显示,豆科植物具有良好的成活率和较好的生
长速度;他同时指出,耐性豆科植物可以与根瘤菌
共生而克服废弃地瘦瘠所带来的障碍.Jha 等
[6]
利
用豆科灌木修复石灰石采石场废弃地及 Smyth
等
[7]
利用豆科植物修复煤矿废弃地,所有这些实
践都是非常成功的.豆科植物分子水平抗性基
收稿日期：2014-06-20
基金项目：国家自然科学基金资助项目(31172252)
* 责任作者, 副教授, minxia95@126.com
834 中 国 环 境 科 学 35 卷

因、共生基因的筛选及其功能研究受到广泛关
注
[8-9]
.利用豆科植物---根瘤菌共生固氮作用在
重金属污染的尾矿废弃地土壤植被修复和生态
重建的研究也日趋成熟,这也为污染土壤重金属
控制和修复提供了较为完整的理论和实践基础.
近年来,对植物内参基因的筛选已有众多报
道
[10-12]
,但对豆科植物内参基因筛选只有花生、
黑吉豆等
[13-14]
少数报道.大多数内参基因筛选局
限在不同时期不同组织、生物胁迫以及非生物胁
迫中干旱和盐胁迫样本,对于豆科植物在重金属
胁迫下内参基因的筛选鲜有报道.然而对于这方
面的研究,将有助于对豆科植物抗性基因、共生
基因的表达研究.
实时定量 PCR(qRT-PCR)具有灵敏度高、定
量准确、特异性等特点,已广泛应用于基因的表
达分析
[15]
.利用 qRT-PCR 分析目的基因表达时,
一个好的内参基因可以消除 RNA 提取质量以及
反转录效率等所带来的背景误差
[16-17]
,因此筛选
特定背景下最适内参基因对目的基因表达分析
至关重要.
本研究选取选取 8 个管家基因作为候选内
参基因:组蛋白基因(Histone H2A,h2a)、肌动蛋白
基因 (Actin,act)、18S 核糖体 RNA 基因 (18S
ribosomal RNA,18s)、β-微管蛋白基因(Tubulin
beta chain,tub)、泛素蛋白基因(Ubiquitin,ubi)、延
伸因子-1α 基因(Elongation factor 1-alpha,ef1)、
3-磷酸甘油醛脱氢酶基因 (Glyceraldehyde-
3-phosphate dehydrogenase,gapdh)、亲环蛋白基
因(cyclophilin,cyp).管家基因编码蛋白不仅是细
胞器骨架基本组分(actin、tub)、真核生物染色体
基本结构蛋白(h2a)和广泛存在于原核和真核生
物中的胞浆蛋白(cyp),还参与生物体的基本代谢
过程(gapdh、ef1、ubi),因此,理论上管家基因在
生物体内都是稳定表达的.此外,18S 核糖体 RNA
调控合成独立于信使 RNA,因此核糖体 RNA 的
转录表达较为稳定,常被用作内参基因来校正目
的基因的表达.
本实验对不同 Zn
2+
浓度处理下天蓝苜蓿接
种根实验数据分析筛选最适内参基因组合,为重
金属污染土壤修复过程中抗性基因、共生基因的
表达分析提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 材料
供试天蓝苜蓿(Medicago Lupulina L.)种子
和苜蓿中华根瘤菌CCNWSX0020(Sinorhizobium
meliloti CCNWSX0020)(该菌具有良好的锌抗性)
均由本实验室提供.
1.2 方法
1.2.1 天蓝苜蓿种植及样品采集 天蓝苜蓿种
子脱皮,无菌水冲洗 6~8 次,95%(V/V)酒精浸泡
1min,30%(V/V))NaClO 处理 2min,最后用无菌水
冲洗 6~8次用于播种.播种前,每个花盆装入 200g
基质(蛭石与珍珠岩按体积比为 2:1 形式充分混
匀),121℃灭菌 1h;实验组加入不同浓度的硫酸锌
(Zn
2+
浓度:100, 200, 300, 400mg/kg)模拟锌污染.
光照培养:将花盆置于智能植物培养箱,培养箱参
数为:16h 光照/8h 黑暗,温度为(24±2)℃,湿度为
40%,光照强度为 4级.当幼苗长出第一片真叶,接
种根瘤菌 CCNWSX0020,期间无氮营养液
[18]
和
无菌水交替浇水,取接菌后 30d 天蓝苜蓿共生根
于液氮迅速冷冻后置于−80℃保存用于 RNA 提
取(每组样品重复 3次).
1.2.2 总 RNA 提取与 cDNA 合成 利用
RNAiso Plus 试剂盒(TaRaKa公司)提取 RNA,提
取流程按照说明书进行.对所提取的 RNA 进行
琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测(OD260/280=
1.8~2.0, OD260/230>2.0). 利 用 PrimeScript
®
RT
reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒(TaRaKa公
司)将提取的 RNA(0.5μg)按照说明书合成 cDNA
置于−20℃保存备用.
1.2.3 引物设计及其特异性检测 本研究选取
8 个功能不同的管家基因:h2a、act、18s、tub、
ubi、ef1、gapdh、cyp 作为候选内参基因.利用
Primer5.0 软件参考蒺藜苜蓿相关基因 cDNA 序
列设计引物.引物特异性检测:不同浓度 Zn 处理
样品 cDNA 等量混合,普通 PCR扩增候选内参基
因琼脂糖凝胶电泳检测并送上海英潍捷基公司
测序.qRT-PCR 分析溶解曲线.
1.2.4 荧光定量 PCR 分析及扩增效率检测 反
3 期 张德辉等：天蓝苜蓿锌胁迫下实时定量 PCR 内参基因筛选 835

转录产物 cDNA 稀释 10 倍,使用 SYBR
®
Primix
Ex Taq
TM
(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa公司)
用于 qRT-PCR 反应.各内参基因的荧光定量反应
在 CFX 96
TM
RealTime System(Bio-Rad)荧光定
量仪上进行.反应体系为 20μL,其中 SYBR
®
Primix
Ex Taq
TM
(2×)10μL,ddH2O 5.4μL,cDNA 模板 3μL,
上、下游引物(10mmol/L)各 0.8μL.反应程序为:
95 ℃预变性2min;95℃变性 5s;60℃退火 30s;72℃
延伸 30s;39 个循环.
引物扩增效率检测:所有样品 cDNA 等量混
合用于 PCR扩增,扩增产物稀释 10
4
后,依次稀释
5, 5
2
, 5
3
, 5
4
, 5
5
倍用于qRT-PCR扩增,制作标准曲
线并计算引物扩增效率.
1.2.5 Cycle threshold(Ct)值比较 对各候选内
参基因在所有样品中 Ct 值比较分析 ,通过
SigmaPlot 10.0软件作图,得出各候选内参基因在
样品中Ct值分布范围,反映各候选内参基因在综
合胁迫下平均表达水平.比较同一候选内参基因
在不同Zn
2+
浓度处理样品中Ct值变化,反映各候
选内参基因在不同样品中的相对表达量.
1.2.6 候选内参基因稳定性分析 通过在线评
估内参基因稳定性工具 (http://www.leonxie.
com/referencegene.php)分析候选内参基因的稳
定性
[19]
.该在线工具集合了 the comparativeΔCt
method
[20]
, BestKeeper
[21]
, NormFinder
[22]
和
geNorm
[23]
4 个稳定性评估软件;此外,该在线工
具对以上 4 个软件计算结果进行综合分析,得到
各候选内参基因综合排名.
1.2.7 评价候选内参基因最适数目 候选内参
基因最适数目通过geNorm软件计算基因的配对
变异值 Vn/n+1 确定内参基因的最适数目.利用
geNorm软件计算 n 个基因作为内参基因得出的
标准化因子与 n+1 个基因作为内参基因得出的
标准化因子的配对变异值 Vn/n+1.一般认为当
Vn/n+1<0.15 时,表明研究目的基因表达过程中使
用 n 个内参基因可以得到准确结果,没有必要引
入第 n+1 个内参基因.
2 结果与分析
2.1 引物特异性及扩增效率检测
凝胶电泳检测普通 PCR 扩增产物,结果显示:
只有特异性扩增条带,无其它杂带,且片段大小与目
的条带一致(测序结果与目的基因序列一致).
qRT-PCR 溶解曲线显示:只有单一主峰,没有其它
杂峰出现,说明所设计引物特异性良好.引物扩增效
率均在85%~100%.所设计引物符合实验要求(表1).
表 1 候选内参基因引物
Table 1 Primers used to amplify candidate reference
genes
基因 引物序列
扩增长
度(bp)
扩增效
率(%)
F: CGCCGTCCTTCAGTATCTCG
h2a
R: GGCAGCACACCACCATTAGC
171 94.24
F: GCCCTTCCACTTGCCATCCT
act
R: CACGAACAATCTCTCGCTCTGC
124 88.53
F: CCATAAACGATGCCGACCAG
18s
R: TTCAGCCTTGCGACCATACTC
112 95.32
F: ACAGCCTGAGCGGTGTTTAGAG
tub
R:GTGGGACATCACAGATACTGGACTT
139 93.18
F: CTCCATTTGCTGCTGCGTCTC
ubi
R: CCACCCCGAAGTCGCTACAC
257 93.16
F: ACCGAAGAGGGCATCAGATAAGC
ef1
R: ACCAGTCATAACACGACCAACAGG
100 86.32
F: TGGAAATCAATGGGAAGCAGG
gapdh
R: ATAGGTGAATCAGCAGATGGAGC
190 85.2
F: CTTCCACCGTGTGTTCCCTC
cyp
R: CAAGCCATTCCGTCTTAGCG
212 95.07

2.2 候选内参基因在样品中的平均表达水平

5
10
15
20
25
30
35
18s act cyp ef1 gapdh h2a tub ubi
平
均
表
达
水
平
(C
t
值
)
候选内参基因
图 1 候选内参基因平均表达水平
Fig.1 Average expression levels of candidate reference
genes
836 中 国 环 境 科 学 35卷

利用比较Ct值的方法评估各候选内参基因在所
有样品综合胁迫下平均表达水平(图 1).由图 1 可知,
综合胁迫下:18s 的Ct值最小,平均表达水平最高,cyp
的 Ct 值最大,平均表达水平最低;其它各候选内参基
因平均表达水平相差不大,Ct值集中在22~28.
2.3 候选内参基因在不同样品中相对表达量
由图 2 可知,同一候选内参基因在不同 Zn
2+
浓度处理下其表达水平各异,但随着 Zn
2+
浓度的
升高,Ct 值总体呈现上升趋势,候选内参基因表
达呈下降趋势.
21
21.5
22
22.5
23
23.5
24
24.5
25
25.5
0 100 200 300 400
平
均
基
因
表
达
水
平
(C
t
值
)
act ubi gapdh

23
24
25
26
27
28
29
0 100 200 300 400
h2a tub ef1
平
均
基
因
表
达
水
平
(C
t
值
)

28
28.5
29
29.5
30
30.5
31
31.5
32
32.5
33
0 100 200 300 400
cyp
Zn
2+
浓度(mg/kg)
平
均
基
因
表
达
水
平
(C
t
值
)


6
7
8
9
10
11
12
0 100 200 300 400
18s
Zn
2+
浓度(mg/kg)
平
均
基
因
表
达
水
平
(C
t
值
)

图 2 候选内参基因不同样品中相对表达量
Fig.2 Relative expression of candidate reference genes in different samples
2.4 所有样品中候选内参基因稳定性分析
表 2 所有样品中候选内参基因的表达稳定性
Table 2 Expression stability of candidate reference genes
in all samples
方法 排序
ef1 h2a ubi gapdh act cyp 18s tub
ΔCt
0.66 0.72 0.73 0.76 0.78 0.86 0.99 1.34
ef1 act ubi h2a cyp gapdh 18s tub
BestKeeper
0.397 0.429 0.434 0.459 0.658 0.694 0.789 1.221
ef1 gapdh h2a ubi cyp act 18s tub
NormFinder
0.255 0.353 0.415 0.499 0.587 0.6 0.792 1.245
act ubi ef1 h2a cyp gapdh 18s tub
geNorm
0.282 0.282 0.328 0.362 0.496 0.581 0.694 0.855
ef1 ubi act h2a gapdh cyp 18s tub
综合排名
1.32 2.45 2.78 3.13 4.12 5.23 7 8
利用在线评估工具分析所有样品中候选内
参基因的稳定性(表 2).由表 2 可知:18s 和 tub 是
最不稳定内参基因; the comparative ΔCt method,
BestKeeper, NormFinder 分析表明 ef1 是最稳定
的内参基因, h2a、ubi、act 是稳定性较好的内参
基因. geNorm 分析表明 act、ubi 是最稳定的内参
基因, ef1、h2a 是稳定性较好的内参基因.通过对
上述四个软件结果的综合分析进行综合排名(稳
定性由高到低 ):ef1>ubi>act>h2a>gapdh>cyp>
18s>tub.
2.5 候选内参基因在不同 Zn
2+
浓度胁迫下稳定
性分析
在线评估不同 Zn
2+
浓度胁迫下候选内参基
因稳定性,得到候选内参基因稳定性综合排名
3期 张德辉等：天蓝苜蓿锌胁迫下实时定量 PCR内参基因筛选 837

(表3). Zn
2+
<100mg/kg时, tub为最稳定内参基因,
ef1 是较好内参基因; Zn
2+
>200mg/kg 时, ef1 为最
佳内参基因, 18s、tub 为最不稳定内参基因.
对不同 Zn
2+
浓度处理下内参基因稳定性分
析表明:在低浓度(<100mg/kg)处理下,tub (1.97)
为最佳内参基因而中高浓度(>200mg/kg)胁迫
下,tub稳定性随 Zn
2+
浓度的升高变化较大(表 3).
据相关报道表明 Tubulin 蛋白与钙离子密切相
关
[24]
,在天蓝苜蓿与根瘤菌共生结瘤过程中,伴
随钙流、钙峰的形成
[25-26]
,随着 Zn 浓度的升高,
结瘤数目越来越少,当 Zn浓度达到 400mg/kg 时,
结瘤数几乎为 0,这与 tub 随 Zn浓度升高越来越
不稳定一致.因此当 Zn 浓度不足以对天蓝苜蓿
共生互作造成明显影响时可以使用 tub作为内参
基因,但在中高浓度下研究基因表达时应避免使
用 tub 作为内参基因.同时进一步说明筛选最佳
内参基因的必要性.
表 3 候选内参基因在不同锌浓度胁迫样品中稳定性
Table 3 Stability of candidate reference genes in different
zinc stress concentration
Zn
2+浓度
(mg/kg)
排序
tub ef1 act ubi gapdh h2a cyp 18s
100

1.97 2.06 2.34 3.44 4.12 5.18 6.09 8
ef1 ubi h2a act cyp tub gapdh 18s
200
1.41 2.51 2.78 3.35 3.66 5.18 6.74 8
ef1 h2a cyp ubi gapdh act tub 18s
300
1.41 2.78 3.16 3.46 3.66 3.83 7 8
ef1 act cyp ubi h2a gapdh 18s tub
400
2.45 2.55 2.66 2.78 3.46 4.12 6.44 8
注:各候选内参基因稳定性根据在线评估工具的综合分析进行排名
2.6 最适内参基因数目判定
越来越多的实验表明,使用 2 个或 2 个以上
内参基因校正目的基因表达可以保证结果准确
性
[27]
.利用 geNorm 软件判定本研究最适内参基
因数目,对所有样品或某一 Zn
2+
浓度处理样品分
析,V2/3 均小于 0.15(图 3).分析表明研究天蓝苜
蓿接种根 Zn 胁迫下基因表达分析时,选取两个
内参基因足以得到准确结果.
目前,对内参基因筛选大多使用 geNorm 单
一软件或两个软件结合
[28-30]
,这就不可避免带来
分析误差.本研究使用在线评估内参基因稳定性
工 具 , 该 工 具 不 仅 包 含 了 ΔCt method 、
BestKeeper、NormFinder、geNorm 分析软件而
且综合 4 个软件分析结果给出综合排名,避免了
单一软件分析带来的误差.

0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
配
对
变
异
系
数
(V
)
V2/3 V3/4 V4/5 V5/6 V6/7 V7/8
配对变异值
所有样品
100mg/kg
200mg/kg
300mg/kg
400mg/kg

图 3 geNorm软件评估最适内参基因数目
Fig.3 Evaluation of optimal number of reference genes
for normalization by geNorm
3 结语
本研究通过 the comparative ΔCt method、
BestKeeper、NormFinder、geNorm 分析软件以
及依据上述 4 个软件得出的结果综合分析,对 8
个候选内参基因进行稳定性排名.结果表明天蓝
苜蓿接种根在低浓度Zn
2+
处理下 tub是最稳定内
参基因,中高浓度胁迫下 ef1 是最佳内参基因,最
后根据不同 Zn
2+
浓度处理选择最适的内参基因
组合.这为研究重金属 Zn 污染土壤基因的表达
研究提供参考.
参考文献：
[1] Nriagu J O. Global metal pollution: Poisoning the Biosphere [J].
Environment, 1990,32(7):7-32.
[2] 朱永官,陈保冬,林爱军,等.珠江三角洲地区土壤重金属污染控
制与修复研究的若干思考 [J]. 环境科学学报, 2005,25(12):
1575-1579.
[3] Carrasco J A, Armario P, Pajuelo E, et al. Isolation and
characterisation of symbiotically effective Rhizobium resistant to
arsenic and heavy metals after the toxic spill at the Aznalcollar
838 中 国 环 境 科 学 35卷

pyrite mine [J]. Soil Biol. Biochem., 2005,37(6):1131–1140.
[4] Bradshaw D. Reclamations of land and ecology of ecosystem [M].
Cambridge:Cambridge University Press, 1987:53–74.
[5] Piha M I, Vallack H W, Reeler B M, et al. A low input approach
to vegetation establishment on mine and coal ash wastes in
semi-arid regions. .Ⅱ Lagooned pulverized fuel ash in Zimbabwe
[J]. Journal of Applied Ecology, 1995,32:382–390.
[6] Jha P K, Nair S, Gopinathan M C, et al. Suitability of rhizobia-
inoculated wild legumes Argyrolobium flaccidum, Astragalus
graveolens, Indigofera gangetica and Lespedeza stenocarpa in
providing a vegetational cover in an unreclaimed limestone
quarry [J]. Plant and Soil, 1995,177(2):139–149.
[7] Smyth C R. Native legume transplant survivorship and
subsequent seedling recruitment on unamended coal mine soils in
the Canadian Rocky Mountains [J]. Mountain Research and
Development, 1997,17(2):145–157.
[8] Chen H Y, Chou M X, Wang X Y, et al. Profiling of Differentially
Expressed Genes in Roots of Robinia pseudoacacia during
Nodule Development Using Suppressive Subtractive
Hybridization [J]. Plos. One, 2013,8(6):e63930.
[9] Chen T, Zhu H, Ke D. A MAP Kinase Kinase Interacts with
SymRK and Regulates Nodule Organogenesis in Lotus japonicus
[J]. Plant Cell, 2012,24(2):823–838.
[10] Scholtz J J, Visser B. Reference gene selection for qPCR gene
expression analysis of rust-infected wheat [J]. Physiological and
Molecular Plant Pathology, 2013,81:22–25.
[11] Zhu J F, Zhang L F, Li W F, et al. Reference gene selection for
quantitative real-time PCR normalization in Caragana
intermedia under different abiotic stress conditions [J]. Plos. One,
2013,8(1):e53196.
[12] Vega-Bartol J, Santos RR, et al. Normalizing gene expression by
quantitative PCR during somatic embryogenesis in two
representative conifer species: Pinus pinaster and Picea abies [J].
Plant Cell Rep., 2013,32(5):715–729.
[13] Reddy DS, Bhatnagar-Mathur P, Cindhuri KS, Sharma KK.
Evaluation and Validation of Reference Genes for Normalization
of Quantitative Real-Time PCR Based Gene Expression Studies
in Peanut [J]. Plos. One, 2013,8(10):e78555.
[14] Kundu A, Patel A, Pal A. Defining reference genes for qPCR
normalization to study biotic and abiotic stress responses in Vigna
mungo [J]. Plant Cell Rep, 2013,32(10):1647–1658.
[15] Park C M, Hong S Y, Seo P J, et al. Exploring valid reference
genes for gene expression studies in Brachypodium distachyonby
real-time PCR [J]. Bmc. Plant Biol., 2008,8:112.
[16] VanGuilder H D, Vrana K E, Freeman W M. Twenty-five years of
quantitative PCR for gene expression analysis [J]. Bio.
Techniques, 2008,44(5):619-626.
[17] Derveaux S, Vandesompele J, Hellemans J. How to do successful
gene expression analysis using Real-time PCR [J]. Methods,
2010,50(4):227-230.
[18] Vincent J M. The cultivation, isolation and maintenance of
rhizobia [M]. A Manual for the Practical Study of the
Root-Nodule Bacteria. Blackwell Scientific, Oxford, 1970:1–13.
[19] Xie F, Xiao P, Chen D, et al. miRDeepFinder: a miRNA analysis
tool for deep sequencing of plant small RNAs [J]. Plant Mol.
Biol., 2012,80(1):75–84.
[20] Silver N, Best S, Jiang J, Thein S L. Selection of housekeeping
genes for gene expression studies in human reticulocytes using
real-time PCR [J]. BMC Mol. Biol., 2006,7:33.
[21] Pfaffl M W, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians T P. Determination
of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes
and sample integrity: BestKeeper—Excel-based tool using
pair-wise correlations [J]. Biotechnol. Lett., 2004,26:509–515.
[22] Andersen C L, Jensen J L, Orntoft T F. Normalization of real-
time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based
variance estimation approach to identify genes suited for
normalization, applied to bladder and colon cancer data sets [J].
Cancer Res., 2004,64:5245–5250.
[23] Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. Accurate
normalization of real-time quantitative RT-PCR data by
geometric averaging of multiple internal control genes [J].
Genome Biol., 2002,3(7): RESEARCH0034.
[24] Serrano L, Valencia A, Caballero R, et al. Localization of the high
affinity calcium- binding site on tubulin molecule [J]. Journal of
Biological Chemistry, 1986,261(15):7076–7081.
[25] Felle H H, Kondorosi E, Kondorosi A, et al. Elevation of the
cytosolic free [Ca
2+
] is indispensable for the transduction of the
nod factor signal in alfalfa [J]. Plant Physiol., 1999,121(1):273–
279.
[26] Wais R J, Galera C, Oldroyd G, et al. Genetic analysis of calcium
spiking responses in nodulation mutants of Medicago truncatula
[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97(24):13407–13412.
[27] Nailis H, Coenye T, Van Nieuwerburgh F, et al. Development and
evaluation of different normalization strategies for gene
expression studies in Candida albicans biofilms by real-time
PCR [J]. BMC Molecular Biology, 2006,7(1):25–33.
[28] 李 冉,李建彩,周国鑫,等.水稻虫害诱导相关基因实时定量
PCR 中内参基因的选择 [J]. 植物学报, 2013,48(2):184–191.
[29] 苏晓娟,樊保国,袁丽钗,等.光定量 PCR 分析中毛果杨内参基因
的筛选和验证 [J]. 植物学报, 2013,48(5):507–518.
[30] Trond Løvdal, Cathrine Lillo. Reference gene selection for
quantitative real-time PCR normalization in tomato subjected to
nitrogen, cold, and light stress [J]. Analytical Biochemistry, 2009,
387:238–242.

作者简介：张德辉(1989-),男,山东武城县人,西北农林科技大学硕
士研究生,主要从事微生物资源与利用的研究.