全 文 ：收稿日期:2010-01-05
doi:10.3969/j.issn.1006-9690.2010.04.015
南苜蓿 、天蓝苜蓿 、紫花苜蓿根茎叶中皂苷
含量的测定和比较
金　鑫
(太仓市安监局 ,江苏 太仓 215400)
摘　要　采用比色法测定南苜蓿 、天蓝苜蓿 、紫花苜蓿根茎叶中的皂苷含量。以齐墩果酸为标准品 ,利用香草醛 -
冰醋酸体系 , 在 545 nm处检测 , 浓度在 50 μg/mL～ 150 μg/mL范围内线性关系良好 ,其回归方程为 Y=0.0073X-
0.2178, 相关系数 R=0.999 4。本法简便 、快速 、准确 、可靠。实验结果表明 , 南苜蓿 、天蓝苜蓿 、紫花苜蓿三者中 ,
根中皂苷含量大于茎中和叶中皂苷含量 ,紫花苜蓿根中皂苷含量略高于其他两种苜蓿;叶中皂苷含量与茎中皂苷
含量无明显差异。
关键词　南苜蓿;天蓝苜蓿;紫花苜蓿;皂苷;比色法
中图分类号:S567　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-9690(2010)04-0057-04
SaponinsDeterminationinMedicagopolymorpha,
M.lupulinaandM.sativa
JinXin
(TaicangSafetySupervisionBureau, Taicang215400, China)
Abstract　ThecolorimetricmethodwasusedforquantificationoftotalsapoinsinMedicagopolymorpha
L., MedicagolupulinaL., MedicagosativaL., oleanolicacidwasusedasstandardcompoundandvanil-
lin-aceticacidwasusedasreagentofcolorablereaction.Thedetectionwavelengthwaschosenat545
nm.Linearrangeofconcentrationisbetween50 ～ 150μg/mLanditsregresionequationshowstobeY
=0.0073X-0.2178, R=0.999 4.Themethodissimple, rapid, sensitiveandaccurate.Experimental
resultsshowthatMedicagopolymorphaL., MedicagolupulinaL.andMedicagosativaL., Rootsaponins
contentgreaterthanstemsandleavesofsaponinscontent, MedicagosativaL.rootssaponinscontentwas
slightlyhigherthantheothertwo;Leavesandstemssaponinscontentnosignificantdiference.
Keywords　MedicagopolymorphaL., MedicagolupulinaL., MedicagosativaL.;Saponins;Colori-
metricmethod
　　皂苷是苜蓿中的主要次生代谢产物之一 ,也是
苜蓿中重要的生物及药理活性物质。在对苜蓿自身
生长及对环境的适应力方面 ,苜蓿皂苷具有抗草食
昆虫 、抗真菌及自毒作用[ 1, 2] ;在对人及动物的作用
方面 ,苜蓿皂苷具有降血脂[ 3] 、抗炎及抗癌作用 [ 4] ,
另外还有抗营养作用等对动物生长不利的方面 。系
统地研究这类成分的含量情况及其影响因素 ,不仅
对苜蓿生产及病虫害治具有重要意义 ,也是合理利
用苜蓿的重要基础 。
近年文献报道的皂苷含量测定方法主要有以下
几种 [ 5] 。
比色法(colorimetry)　是皂苷类成分分析测定
中历史较长 、应用较普遍的方法 。其原理是皂苷类
成分和一些显色试剂反应后显色 ,可在一定波长处
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第 29卷第 4期
2010年 8月 　　　　　　　　　　　　　 中 国 野 生 植 物 资 源ChineseWildPlantResources　　　　　　　　　　 　Vol.29 No.4Aug.2010
进行测量[ 6] 。常用的显色试剂有浓硫酸 、香草醛 -
浓硫酸 、香草醛 -冰醋酸 、香草醛 -高氯酸等。显色
反应虽然较灵敏 ,但显色试剂的专属性较差 ,因此比
色法通常用于总皂苷的测定[ 7 ～ 11] 。
分光光度法(spectrophotometry)。分光光度法
实际上是比色法的延伸 ,它不仅能测定有色物质 ,还
能精确测定含共轭结构和杂原子的有紫外吸收的无
色物质 ,也是一种成熟经典的分析方法。
薄层扫描法(TLCS)。薄层扫描法分离效能高 ,
所用仪器设备简单 ,操作简便并可同时作多样品的
平行分析。较前两种方法专属性和稳定性都有提
高 ,既可定性也可定量 。因此薄层扫描法在药物的
鉴别和中成药尤其是复方制剂中有效成分的分离分
析方面应用广泛 。康阿龙 [ 12]等采用薄层扫描法单
波长锯齿形扫描方式测定盾叶薯蓣中盾叶新苷和薯
蓣皂苷的含量 ,扫描波长为 510nm。
高效液相色谱法 (HPLC)。 HPLC法具有分离
效能比薄层层析高 ,分析速度快动化程度高 ,灵敏度
高等特点。目前用 HPLC法检测皂苷类成分的检测
器主要有紫外检测器 (UV)、蒸发光散射检测器
(ELSD)和示差拆光检测器 。 HPLC法根据仪所接
检测器的不同 ,可分为:高效液相 -紫外分光光度
(HPLC-UV)法 、高效液相 -蒸发光检测(HPLC-
ELSD)法 、高效液相 -荧光检测(HPLC-FD)法等 。
HPLC-UV法应用较多。 Yoshikawa等 [ 13]以 HPLC
法测定了从欧马栗中提取的七叶皂昔 Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ a、
Ⅱ b四个主要成分的含量 ,同时测定了日本马栗树
的成分和组成。
高效液相 -质谱联用法(LC/MS)。 LC/MS法
是近 10年发展成熟的分析技术 ,它集 HPLC的高分
离效能与串联质谱的高灵敏度 、高专属性的优点于
一体 ,并能够给出被测组分的分子量信息 。通过多
级串连质谱分析(MSn)还可得出被测物质的结构信
息 。仇峰[ 14]等用 LC/MS法测定大鼠血浆中大豆苷
元及其代谢物。
毛细管电泳法 (CE)。又称高效毛细管电泳
(HPCE),是最近几年来发展最快的分析方法之一 。
CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物 。
其特点高灵敏度 、高分辨率 、高速度 、样少 、成本低 。
在实际工作中 ,结合传统电泳的工作方式与色谱技
术的特点 ,形成以下几种分离模式:毛细管区带电泳
(CZE)、胶束动电毛细管电泳(MECC)、毛细管等
速电泳(CITP)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等
电聚焦电泳(CIEF)及近年刚刚兴起的毛细管电色
谱(CEC)。Emara等[ 15]在 60 mmol/L硼酸缓冲液 ,
pH10,分离电压 12 kV的条件下 ,用 HPCE成功地
分离并测定了 TrifoliumalesandrinumL.种子中的齐
墩果酸型三萜皂昔 。
此外还有超临界流体色谱法((SFC)、基体辅助
激光解吸电离飞行时间质谱法 (MALDI-TOF-
MS)、酶免疫测定法(EIA)等等 [ 16] 。
本实验建立比色法测定南苜蓿 、天蓝苜蓿 、紫花
苜蓿根茎叶中的皂苷含量。以齐墩果酸为标准品制
作标准曲线 ,利用香草醛 -冰醋酸体系 ,在 545 nm
处检测吸光值 。对比南苜蓿 、天蓝苜蓿 、紫花苜蓿根
茎叶中的皂苷含量的不同。
1　材料 、仪器与试剂
1.1　材料
南苜蓿 、天蓝苜蓿 、紫花苜蓿全草 ,采集于南京
师范大学仙林校区附近 ,经龚祝南教授鉴定分别为
豆科苜蓿属植物紫花苜蓿 、天蓝苜蓿和南苜蓿。
1.2　仪器
紫外可见分光光度计 Tu1800,北京普析通用仪
器有限公司;旋转蒸发仪 RE52-99,上海亚荣生化
仪器厂;超声波清洗器 ,江苏昆山电子仪器厂;电子
分析天平 ,上海精密科学仪器厂。
1.3　试剂及溶液的制备
95%乙醇(AR),甲醇(AR),香草醛(AR),冰醋
酸(AR),高氯酸(AR),正丁醇(AR),以上试剂均为
国产分析纯 。齐墩果酸对照品(纯度 >98%),江苏
联创医药有限公司提供 。
70%乙醇制备:95%乙醇和水以 70∶25的比例
混合 。
香草醛 -冰醋酸显色剂制备:香草醛 0.5 g溶
于 10 mL冰醋酸。
齐墩果酸标准液的制备:准确称取纯度 >98%
的齐墩果酸对照品 100mg,溶于甲醇中 ,定容于 100
mL容量瓶中 ,制成 1mg/mL的储备液。
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2　含量测定的方法学研究
2.1　测定波长的选择
以 70%乙醇回流提取适量紫花苜蓿粉末 ,提取
液浓缩至干 ,适量水再次溶解 ,以水饱和正丁醇少量
多次萃取 ,再次浓缩至干 ,以甲醇溶解 ,取上清液稀
释至适当浓度 ,取适量溶液于 10 mL具塞磨口试管
中 ,水浴挥干 ,精密加入 5%香草醛 -冰醋酸溶液
0.2 mL和高氯酸 0.8 mL, 摇匀 , 70℃水浴加热
15 min,冰水浴中冷却再各加入冰醋酸 5 mL,充分
振摇静止 10 min后 ,随行试剂作空白 ,用紫外扫描
仪在 200 ～ 700 nm范围做全程扫描 ,发现其最大吸
收波长在 545 nm左右 ,故选择 545 nm为含量测定
的吸收波长 。
图 1　苜蓿总苷吸收波长扫描
2.2　齐墩果酸标准曲线的制备
2.2.1　标准稀释溶液的制备
准确称取纯度 >98%的齐墩果酸对照品 100
mg,溶于甲醇中 ,定容于 100 mL容量瓶中。稀释制
备成为 50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL、125 μg/
mL、150 μg/mL的齐墩果酸标准稀释溶液。取 6支
比色管 ,对照管中加入 1 mL甲醇 ,其余各管依次加
入相应标记含量的齐墩果酸标准稀释溶液 1 mL。
将各管于 80℃水浴蒸干 ,加入香草醛 -冰醋酸溶液
0.2mL,高氯酸 0.8 mL。 70℃水浴 15 min,立即冰
浴冷却 ,冷却后加入冰醋酸 5 mL,静置 20 min。
2.2.2　吸光度的测定
以对照管中溶液做空白对照 ,用分光光度计在
545nm处 ,测定各管中溶液的吸光值 。
2.2.3　标准曲线的制作
以齐墩果酸标准稀释溶液浓度为横坐标 ,吸光
度为纵坐标 ,用 Excel绘制标准曲线 。
图 2　齐墩果酸标准曲线
得到回归方程:y=0.0073x-0.2178　R2 =0.999 4
2.3　重现性实验
按照样品前处理工艺制备样品紫花苜蓿 、天蓝苜
蓿 、南苜蓿地上部分各 1g,按照样品前处理工艺处理
后 ,吸取 1mL甲醇溶液 ,同法分别制备 5份 ,香草醛
-冰醋酸显色后测量吸光值 ,计算 RSD为 1.22%。
2.4　仪器精密度实验
取 “重现性实验”项下的同一份样品 ,测定吸光
值 ,平行 5次 。RSD=1.27%, 结果表明精密度良好。
2.5　样品溶液稳定性实验
取 “重现性实验 ”项下的同一份样品 ,每隔 10
min测定一次吸光值 ,结果表明 ,在前 20 min内 ,样
品吸光值有明显下降 ,在 20 min后 ,样品吸光值在
40 min内保持稳定。
2.6　加样回收率实验
精密量取 100 μg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL标准
储备液 1mL,分别加入 1 g紫花苜蓿粉末中 ,按照
2.1节法分别制备 3份 ,测定吸光度 ,计算加样回收
率 ,分别为 98.91%、98.64%、97.42%,说明该方法
符合要求 。
3　样品含量的测定
3.1　苜蓿样品的前处理
将干燥的南苜蓿 、天蓝苜蓿 、紫花苜蓿分为根茎
叶三部分 ,共九部分材料 。用粉碎机将其充分粉碎。
分别称取收集的九个样品各 1.0 g,放入圆底烧瓶
中。向圆底烧瓶中加入约 60 mL70%乙醇溶液 ,适
当浸泡 , 80℃水浴 ,回流提取 2 h,重复提取三次 ,合
并提取液 ,置于旋转蒸发仪中 ,蒸发浓缩至合适体
积 ,用水饱和正丁醇溶液少量多次萃取 ,萃取液至
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第 4期　　　　　　　　　金　鑫:南苜蓿 、天蓝苜蓿 、紫花苜蓿根茎叶中皂苷含量的测定和比较　　　　　　　　
80℃水浴锅蒸干后用甲醇重溶 ,定容至 50 mL容量
瓶中。
3.2　样品含量的测定
将九种样品提取液各取 1 mL加入相应标记的
比色管中。取 1mL甲醇加入试管中为做空白对照
管 。将所有比色管置于水浴锅中水浴蒸干。蒸干
后 ,分别加入香草醛 -冰醋酸溶液 0.2 mL,高氯酸
0.8mL。 70℃水浴 15min,立即冰水浴冷却 ,冷却后
加入冰醋酸 5 mL,静置 20 min。
以对照管中溶液做空白对照 ,用分光光度计在
545nm处 ,测定各管中溶液的吸光值 。
3.3　测定结果和含量计算
测得吸光度 ,带入回归方程 ,计算皂苷含量值。
计算结果如表 1:
表 1　三种苜蓿皂苷含量
根 茎 叶
南苜蓿 1.143% 0.591% 0.673%
天蓝苜蓿 1.214% 0.593% 0.623%
紫花苜蓿 1.390% 0.583% 0.656%
4　讨　论
据报道 ,可与皂苷发生显色反应的显色试剂有
数种[ 17] ,但从试验的稳定性 、重现性等方进行综合
考虑 ,本文选用了香草醛 -高氯酸为显色剂进行测
定 [ 18] ,采用的最佳实验条件为:加入待测试样后 ,水
浴蒸去溶剂 ,再加入 0.2mL新制的香草醛 -冰醋酸
溶液及 0.8 mL高氯酸试剂 ,在 7℃恒温水浴加热
15 min,立即冰水浴冷却至室温 ,冷却后加入冰醋酸
5 mL,静置 20min,在波长为 545nm处测定 ,利用齐
墩果酸标准曲线计算含量 [ 19] 。结果表明 ,在此实验
条件下进行的比色测定 ,显色灵敏度高 ,稳定性 、重
现性良好[ 20] 。
实验中采用多次测量取平均值的方法 ,增加了测
得含量值的精确度和可信度 。实验结果表明 ,南苜
蓿 、天蓝苜蓿 、紫花苜蓿三者中 ,南苜蓿根中皂苷含量
<天蓝苜蓿根中皂苷含量 <紫花苜蓿根中皂苷含量。
三种苜蓿茎 、叶中皂苷含量相差没有明显差异。
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