全 文 ：第 24卷 第 2期
29 9 1 年 6月
实 验 生 物 学 报 Vo l . 2 4, N o . 2
A e t a B i o l o g ia e E x P e r im e n t a l i s S i n i e a J u n e 1 9 9 1
天蓝首楷单细胞培养植株再生
安利佳 . 张俊敏 李风霞 罗希明 何孟元 都 水
(东北师范大学生物系 , 长春 1 3 0 0 2 4)
迄今 , 人们对首猎属植物已经做了许多离
体培养的研究 。 除了首 蓓 ( M e d ica s o s a t `v a )的
组织 ( S a u n d e sr 等 , 1 9 7 2 ) 、 细胞 (M c C o y 等 ,
一9 7 7 )和原生质体培养 ( K a o 等 , 1 9 5 0 ) 再生植
株外 【` 一 3 1 , 至少还有 n 种首蓓属植物曾被 进行
过离体培养研究 [` 一 ’ } 。 天蓝首着 (M . 正“ p u正io a )
是一优良的豆科牧草 , J o h n s o n 等 ( 19 8 2 ) 对它
进行过原生质体培养 , 但未得到再生植株 t s ’ 。
关于天蓝 首着离体培养的其它研究 , 尚未见报
道 。 为了利用细胞工程技术对天蓝首蓓进行优
良品种的选育 , 我们对它进行了单细胞的分离
和培养 , 并得到再生植株 。 现 将 结 果报道如
下 :
材 料 和 方 法
天蓝首讼种了由东北师大草地研究所提供 。 种子
用浓硫酸浸泡 5 分钟后 , 再用 。 . 1% 升汞溶 液 灭菌 3
分钟 。 无菌水冲洗 4 次后 , 将种子接种在不含激素的
固体 M S 培养基上 。 种子萌发 3 天后切取 子叶和胚轴 。
外植体切成 1一 2 m m 的切段 , 接种在 人 y , 士齐养基 (表
1 )上诱导愈伤组织 。 愈伤组织诱导在暗培养中进行 ,
温度为 27 士 1℃ 。
由子叶和胚轴外植体诱导出的愈伤组织长到 5 m m
大小时 , 转入液体 A y , 培养基 (表 1 川 ,进行旋 转式振
荡培养 ( 1 2 0 r/ m ) 。 旬周换液一次 。 培养 四 周 后 , 用
4 0 0 门镍丝网过滤悬浮细胞液 , 倒置显微镜下 检 查和
统计不同细胞系的细胞密度 。 过滤后的县:浮细胞液静
置 1小时 , 待细胞完全沉淀后 , 倒 掉 1几釜青液 , 加入
A y
,
(表 l )或改良 K s p 培养基 1. 苦。 改良 K s p 士六养基采
用 K s p 基本培养基 , 其变 动 之 处 为 : 蔗搪 1 % 、 葡
萄搪 2 % 、 2 , 4一D l m ` / L 、 6一 B A o . 7 m ` / L 、 N人A
o
.
Z m g / L
。 当旨浮细胞液的细胞密度 调节到 1.0 个 /功 l
时 , 取 s m l 悬浮细胞液置于直径 s c m 的玻璃 培 养皿
衰 1 天蓝 , 抢单细脸培并和位株再生所用的培养`
培养基成分 ( m g/ L ) .
M gS O
一 7 H: 0
C a C I: Z H: 0
K N O ,
N H 一N O :
K H: P O -
甘氨酸
泛酸钙生物素
蔗 搪荀萄精
2
,
4一 D
6一 B A
N A人
IB A
G A
A y l A y Z yA
3
4 0 0
6 6 0
1 9 0 0
1 6 5 0
1 7 0
2
4 0 0
6 6 0
1 9 0 0
1 6 5 0
1 7 0
2
3 0 0 0 0 3 0 0 0 0
1
。
5
0
。
7
0
。
2
2
0
。
3 5
0
。
2
4 0 0 2 0 0 1 0 0
6 6 0 3 3 0 1 6 5
1 9 0 0 9 5 0 4 7 5
1 6 5 0 8 2 5 4 1 2
。
5
1 7 0 8 5 4 2
。
5
2 2 0
。
5
1 1 0
。
2 5
0
。
5 0
。
5 0
。
1 2 5
1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 2 0 0 0 0
2 0 0 0 0 1 0 0 0 0
l
0
。
7
.
0
。
7 0
。
2
0
。
2 0
。
2 1
l
P H S
。
8 5
.
8 5
。
8 5
。
8 5
。
8
. 微星元素和有机成分与 B 。 培养基相同 。
木文 2 9 9 0 年 4 月 1 0 日收 到。 1 9 9 0 年 1 2 月 。 日接受 。
. 现工作单位 : 辽宁师范大学生物系 , 大连 1 1 6 0 2 2 。
安利佳 张俊敏 李风艘
中进行静止的浅层液体培养 。 培养皿置于培养箱中进
行暗培养 , 温度为 27 士 1℃ 。 侮 隔 10 天加入 2一 3 m l
新鲜培养基 。
当愈伤组织长到 1一 Z m m 时 , 统计每盘培养皿中
形成愈伤组织块的数量 , 并将愈伤组织转入固体 A y3
培养基上进行增殖 。 当愈伤组织增殖到 4一 5 m m 时 ,
移入 人 f 培养基 (表 l) 上进行分化培养 。 当愈伤组织
分化出的幼苗长到 4一 s c m 高时 , 转到 A s 培养基 (表
1 )上使其生根 。 从愈伤组织增殖开始 , 以 后 的培养
过程均在光照条件下进行 , 采用自然光作为光源 , 并
以日光灯补充照明 , 光照强度为 1 5 0 0一 2 5 0 0 L ux , 每
天光照 14 小时 。 培养温度白天不高于 27 ℃ , 夜 间不
低于 18 ℃ 。
结 果
天蓝首信的子叶和胚轴 外 植 体 在 A yl 培
养基 (表 1 )中均可诱导出愈伤组织 。 愈伤组织
在 A y Z 液体培养基 (表 1 ) 中振荡培养 4 周后 ,
形成由大量游离细胞和少量细胞团组成的细胞
悬浮系 。 过滤后 , 来自子叶愈伤组织的细胞悬
浮系 (称 z 细胞 系 ) 细 胞 密 度为 1 . 2 x l o 2一
i
.
7 x l o
3 个 /m l , 来自胚轴愈伤组 织的细胞悬
浮系 (称 P 细 胞 系 ) 细 胞 密 度为 2 . 8 x l0 4一
3
.
3 x l o
` 个 /m l (表 2 ) 。 其中 , z 细 胞 系中单
细胞比例约占 98 . 9% , P 细胞系中单细胞比例
约占 9 7 . 4% , 其余的则是处于二细胞时期的小
细胞团 。 根据体积的大小和形状的不同 , 以 及
细胞质的浓厚程度 , 可将游离的单 细 胞 ( 图版
罗希明 何孟元 郝 水 24 卷
I
, 图 1 )大致分为三种类型 : a 、 较小的圆形
或椭圆形细胞 , 细胞质浓厚 , 几 乎 无 液 泡 ,
b
、 较大的长形细胞 、 长径约为 短径 的二倍 ,
细胞质较浓 ,液泡化程度较低 ; c 、 大而不规则
形细胞 , 细胞质较少 , 液泡较大 。 在 A y 3 (表
1 ) 或改 良 K s p 培养基中浅 层 液 体培养时 ,
a 和 b 类细胞均有分裂 , 。 类细胞未见分裂 。
a 类细胞分裂形成的二个细胞之间有明显的纽
凹 (图版 I , 图 2 ) , b 类细胞分裂形成的二个
细胞之间无溢凹 (图版 I , 图 3 ) 。 a 和 b 类细
胞均可经第二次分裂 ( 图版 工 , 图 4 )形成细胞
团 (图版 I , 图 51 ) 。 单细胞培养 4 周左右 时 ,
可形成 1一 2 m m 大小的愈伤组织 ( 图版 工 , 图
6 )
。 将愈伤组织移入固体 A y 3培养基上 , 2
周后可增殖到 s r曲。 大小 (图版 工 , 图 7 ) 。 将
增殖后的愈伤组织转入 A f 培养丛 (表 l ) 上 ,
1 周左右开始分化出芽 (图版 工 , 图 8 ) , 进而
发育成幼苗 (图版 I , 图 9 ) 。 将幼 苗 移 到 A s
培养基 (表 1 )中 , 5 天左右开始分 化 出根 ( 图
版 I , 图 1 0 ) 。 z 细胞系 培 养 在 A y 3 培养基
中 , 其愈伤组织诱导率为 4一 2 5 /盘 , 分化率为
6
.
7% , 培养在改 良 K SP 培养基中 , 愈伤组织诱
导率为 38 一 5 7 /盘 , 分化率为 18 . 9% 。 P 细 胞
系培养在 A y 3培养基中 , 愈伤组织诱 导 率为
8一 19 /盘 , 分化率为 1 2 . 6% , 培养在改良 K SP
培养基中 , 愈伤组织诱 导率 为 31 一 4 5/ 盘 , 分
化率为 3 9 . 4% (表 2 ) 。
衰 2
细胞 系
A y 3 和改良 K s p 培养` 对两种细饱不细自培养的形晌
愈伤组织来源
口}
一
Z
细胞密度 (个 / m l)
1
.
2 x l o :一 l 。 7 x I O,
单细胞培养基
A y 3
改良 K s P
A y 3
改良 K SP
愈伤组织诱导率 (盘 ) 分化率 (% )
胚 轴 P Z 。 8 x 1 0 `一 3 . 3 x 1 0 ,
4一 2 5
3 8一 5 7
8一 1 9
3 1一 4 8
6
。
7
1 8
。
9
1 2
。
6
3 9
。
4
在天蓝首偕单细胞培养中 ; 生物素 、 泛酸
钙和葡萄搪对细胞分裂 、 愈伤组织形成和分 化
有一定影响 (表 3 ) 。 在不含生物素 、 泛酸钙或
葡萄搪 的 A y 3一 l 、 A y 3一 2 、 A y 3一 3 培 养基
中 , 来自胚轴愈伤组织的 P 细胞系细胞分裂的
起始时间较之在 A y 3培养基中要有 所 延长 ,
并且细胞分裂频率以 及愈伤组织诱导率和分化
率都降低 。 在不含生物素 、 泛酸钙和葡萄糖的
A y 3一 4 培养基中 , P 细胞系细胞分 裂 的起始
时间明显延后 , 细胞分裂频率和愈伤组织诱导
率显著降低 , 并且未能从愈伤组织中分化出芽
(表 3 ) 。
2期 夭蓝首着单细胞培养植株再生 12 1
已经分化出幼芽的天蓝首蔚单细胞愈伤组 一定 准的赤霉素 , 、 ,工明 牡提高植株再 ’ 仁频率 ,
织 , 在不含赤霉素的分化培 养 峡中 , 多数幼芽 并且以赤霉素浓 度 1 m g / L 时 的效果 辰 好 (表
不能发育成植株 (表 4 ) 。 在分 化培养基中添加 4 ) 。
表 3 生物索 、 泛酸钙和蔺萄抽对 P 细胞系细胞培养的影晌
培养基编号 . 细胞分裂的起始时问 (天 ) 培养 7 夭时的细胞分裂频牢 ( % ) 愈伤 (J l爹只诱呀率 (盘 ) 分化率 ( % )
A y 3 2 3 2
.
1 8一 1 9 1 2 . 6
A y 3一 2 3一 4 2 2 . 5 4一 5 6 . 魂
A y 3一 2 2一3 2 4 . 6 0一 1 5 7 . 5
A y 3一 3 4 1 9
.
2 1一 9 3 . 1
A y 3一 4 5一 6 2 . 9 0一 2 0
.
A y 3
一 1 是去掉生物素的 A y 3 ; A y 3一 2 是去掉泛酸钙的 A y 3 , A y 3一 3 是去 }幸葡萄糖的 A y 3 , 蔗搪浓度为
3 % , A y 3
一 4 是去掉生物素 、 泛酸钙和葡萄糖的 A y 3 , 蔗糖浓度为 3 % 。
表 4 赤 . 宋对单细胞愈伤组织再生植株组率的影晌 ( % )
赤带素含星 ( m s/ L ) 0 0 . 5 1 2 4
Z 细胞系 2 . 4 9 5 7 . 5 3 4 . 2 2 7 . 3
P 细胞系 1 1 . 8 2 7 . 6 7 4 . 4 4 2 . 7 3 5 . 6
讨 论
在某些豆科植物的组织培养 `} , , 在同杆的
培养条件下 , 胚轴愈伤组织比子叶愈伤组织更
容易分化出植株〔“ 一 ’ ` ’ 。 我们的实验表明 , 天蓝
首藉胚 轴愈伤组织振 荡培养 4 周后 , 可得到细
胞密度较大的细胞 悬浮系 ( P 细胞系 ) , 而来 自
子叶愈伤组织 的细胞 旨浮系 ( z 细胞系 )细胞密
度较小 。 在单细胞培养中 , 两种外植体来源的细
胞系在愈伤组织诱导率方面 丛本接近 , 但 P 细
胞系的分化率要高于 z 细胞系 , 这说明天蓝首
楷胚轴愈伤组织较之子叶愈伤组织更适 于进行
单细胞培养 。
在豆科植物原生质休培养中 , 许多作者采
用了 K s p 培养基 [” ’ 2 一 ’ ` 〕。 在 天 蓝首荷单细胞
培养中采用 K s p 培养基 , 比采用成分比较简单
的 A y 3培养墓 , 在愈伤组织诱导率和分化率方
面都明显提高 。 因此 , K SP 培养墓也适于天蓝
首楷的单细胞培养 。 考虑到 K SP 培养 垫 中:含
有生物素 、 泛酸钙和葡萄搪 【8 ’ , 我们在天蓝首
猎单细胞培养中对这三种成分的作用进行了对
比实验 。 结果发现 , 在 A y 3 培养基中使用生 物
素 、 泛酸钙或葡萄糖 , 对细胞分裂 、 愈伤组织
诱导和分化有一 定的促进 作川 , 少卜且以这三种
成分同时·使用 时的效 果最好 。
W i l l i
a m s 等 ( 1 9 8 6 )的研 究表 IU」, 赤霉素对
兵豆愈伤组织的分化有促进 f )`川 〔’ 。 ’ 。 我们的实
验表明 , 天蓝首荷单细胞愈伤组织分化出芽以
后 , 转入 含有一定浓度赤霉素的培 荞从 「! , , 可
以 明显提高由幼芽发育成植株 !、勺频率 。 由此看
来 , 一 定浓度范田的赤霉素不仅义J’ 豆科植物愈
伤组织的分化有促进作川 , i雨且有利 j J: 芽的继
续发育 。
摘 要
采用了 改 良 K s p 和 A y 3 两 种 培 养 基 ,
对天蓝首活进行单细胞培养并得到再生植株 。
来自天蓝首蓓胚轴愈伤组织的细胞系 , 在单细
胞培养中的愈伤组织分化率明显高于来 自子叶
愈伤 组织 的细胞 系 。 改 良 K SP 培 养 从 较之
A y 3 培养从更利于天蓝首着单细胞培养 。 生物
素 、 泛酸钙和葡萄糖对细胞系的细胞分裂 、愈伤
组织诱导和分化有促进作用 。 赤毒素促进再生
幼芽向植株发育 。
关扭词 : 天蓝 , 摘 单细胞 再生植株
12 2安利佳 张俊敏 李风霞 罗希明 何孟元 郝 水 4 2卷
, 考 文 献
[ l 〕 S a un d e r s , J . W , a n d E . T . B i n g h a m ,
1 97 2
,
P r do u e t i o n o f a l f a l f a P l a n t s f r o m
e a ll u s e u l t u r e
.
C r o P S e i
.
12 : 8 0 4一 8 0 8 .
〔 2 〕 M e C o y , T . J . a n d E · T . B i n g h a m , 1 9 7 7 ,
R e g e n e r a t i o n o f d iP l o i d a lf a l f a P la n t s
f r o m e e l l s g r o w n i n s us P
e n s i o n e u l tu r e
.
P互a ” 才 S e i L e t t . 1 0 : 5 9一 6 6 .
[ 3 ] K a o
,
K
.
N
.
a n d M
.
R
.
M i e h a y l u k
,
1 9 8 0
,
P l a n t r e g e n e r a t i o n f r o m m e s o Ph y l l P r o
-
t o P l a s t s o f a l f a lf a
.
2
.
P f l a ” 之e n P杠y s io 艺·
96 : 1 3 5一 1 4 1 .
[ 4 ] A r e i o n i
,
5
. ,
M
.
R
.
D a v e y
.
,
A
.
V
.
P
.
d o s
S a n t o s a n d E
.
C
.
C o e k i r l g
,
1 9 8 2
,
S o m a t ie
e m b r y o g e n e s i s i n t i s s u e s f r o m m e s o p h y l l
a n d e e ll s u s P e n s i o n P r o t o P l a s t s o f M比 i-
e a g o e o e r u la a n d M
·
g Zu 才in o ` a · Z · P l艺a 炸-
z e ” p九y ` 10艺. 1 06 : 1 0 5一 1 1 0
[ 5 〕 J o h n s o n , L . B · , D . L . S t u te v i l le . , R . K .
H i g g i n s a n d H
.
L D o u g la s
,
1 9 8 2
,
P e e
-
t o l y a s e y 一 2 3 f o r i s o la t i n g m e s o p h y l l p r o -
t o P l a s t s f r o m s e v e r a I M 巴d i e a g o s p e e i e s
.
P l a ” t S e i L e t t . 26 : 1 3 3一 1 3 7 .
[ 6 〕 N a g a r a ja n , P · , J · S · M e K e n z i e a n d P . D .
W a l t o n
,
19 8 6
,
Em b r y o g e n e s i s a n d p l a n t ,
r e g e n e r a t i o n o f M e d i e a g o
s PP
.
i
r l t i s s u e
e u l t ur e
.
P l a ” t C e l艺 R e P o r t s , 5 : 7 7一8 0 ·
[ 7 〕 G i lm o u r , D . M · , M · R . D a v e y a n d E ·
C
.
C oc k i
n g
,
1 9 8 7
,
P l a
n t r e g e n e r a t i o n
f r o m e o t y l e d o n P r o t o P l a s t s o f w il d M e
-
d i e a g o s P e e i e s
.
P l a n t CS i e ” e e
.
48 : 1 0 7一
1 1 2
.
【8 〕 K a o , K . N , 1 9 7 7 , C h r o m o s o m a l b e h a v i o ur
i n s o m a t i e h y b r i d s o f s o y b e a n 一N ie o t i a n a
.
M o正e . G e 凡 . G e ” e t . 15 0 : 2 2 5一 2 3 0 .
〔 9 〕 K a m e y a , T , a n d J . W i d h o lm , 1 9 8 1 , P l a n t
r e g e n e r a t i o n f r o m h y p o e o t y l s e e t i o n o f
G 乙y e 汇” e s P e e i e s . P正a ” t S e 玄 L e t t . 21 : 2 8 9一
2 9 4
.
[ 1 0 〕 W i ll i a m s , D . J . , a n d A . M e H u g h e n , 19 8 6 ,
P la n t r e g e n e r a t i o
n o f t h e I e n s e u l i n a r is
M e d ik
.
( l e n t i l )
.
P l o 子了r C e ll
.
T is s u e a儿 d
O r g a摊 C u l t u r e . 7 : 1 4 9一 1 5 3·
〔 1 1〕 S a x e n a , P . K . a n d J . K i n g . 1 9 8 7 , M o r -
P h o g e n e s i s i n l e n t i l: P la n t r e g e n e r a t i o n
f r o m e a l l u s e u l t u r e s o f I e ” s C“ 乙i” a r玄s
M e d ik
.
v ia s o m a t i e e m b r y o g e n e s i s
.
P l a
矛1才
S C i己凡 e 己 . 5 2 : 2 2 3 一 2 2 7 .
【1 2〕 H a m m a t t , N · , H · K im · , M · R . D a v e y . ,
R
.
5
.
N e ls o n a 们d E
.
C
.
C o e k i n g
,
1 9 8 7
,
P l a n t r e g e
n e r a ti o
n f r o m e o t y l e d o n P r o t o
·
P la s t s o f G ly e i” e e a ” e s e e n s a n d G . e王a 炸·
d e s t i” a
.
P la
卜王t S e i e ” e e
.
48 : 1 2 9一 1 3 5 .
【1 3〕 {弓德 J亏 , 马秀 11卜、 王 超 、 陈 英 , 1 9 5 6 , 豆
科牧草百脉根原 ’ 卜质体和外植体植 株 的 再
生 。 刊一学通报 , 1 :0 7刊一了7 2 。
〔 14 〕 吕德扬 、 李凤叶 、 陈一明 、 陈英 , 19 87 , 多
变小冠花 (豆利一牧草 )原 产!几质体和外 植 休 胚
,
}犬体的形 JJ丈不11植株的 }{于` 1几。 实验生物学报 ,
2 0 : 3 1一 39 .
乞期 天蓝竹荷单细胞赚养杭株再生 2 1 3
P LA NR E TG E NR EA I T ON FR O M M ON C OE L L C U L TUR E S
OF ME DIA C G OP L U U L N jA
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z h a n g J u n 一 m i n , L i eF
n g一 x i a , L u o X i一 m i n g , H e M e n g 一 y u e n
a fl d H a o S h U i
( D e夕a r t川 e , , t o f B i o , 0 9夕 N o r th e a s t N o r m a l U 灯蔑, ,e r s i r y , C J: a ” g e h : : ,: 13 0 0 2 1 )
A B S T R A C T
C a l li w e r e i n i t i a t e d f r o m e x P la n t s o f e o t y l e
-
d o n a n d P lu m u l a r a x i s o f M e d ie a g o l u P u l i卜Z a o n
A y l m e d iu m
.
T w o e e ] 1 li
n e s w e r e o b t
a i n e d f r
o
m
t h e e a l il o f e o t y l e d o n a r d p l u m u la r a x i s i n Ii q u
-
i d A y z m e d i u m o 几 a r o t a r y s h a k (
·
r a t 一艺,〕 r p m ·
B o t h e e l l li
n e s w e r e a b le t o f o r m e a l l i t h
r o u g h
m o n o e e l l e u l t u r e s i n I i q u i d A y 3 o r m o d i f i e d
K S P m e d i u m
.
A f t e r t h e f u r t h e r g r o w t h o f e a l li
o n s o l id A y 3 m e d i u m t h e y w e r e t r a n s f e r r e d o n
-
t o A f m e d iu m f o r t h e t ll e P l a n t le t r e g e n e r a t io n
.
R e g e n e r a t e d P l a
n t ]
e t s w e r e e u l t 一盆r e 谈 o n A s m e -
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d iu m a
n d r o o t f o r m
a t i o n w a s i n d u e
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.
C e l l ] i
n e s
d e r i v e d f r o m e a l l i o f p l
u
m u la
r a x is h a d a h i g h e r
e e ll d e
n s i t y a n d r e g e ;l e r a t io l f r e q u e 仁 e y t h a n
t h a t d e r i v e d f r
o m e a ll i o f e o t y l e d o n
.
I n e o n t r a s t
t o A y 3 m e d i u m
.
m o d i f ie d K s p m e d 元姗 w a s
m
o r e f a v o u r a b l e f e r m o n o e e ll e u l t u r e s o f M叼 i-
e a g o l u P u l i
于谈a . B io t i n
.
e a l e i
u
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2 1 4安利佳 张俊敏 李风霞 罗希明 何孟元 郝 水 2 4卷
圈 版 说 明
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图 l来自天蓝菌偕胚轴愈伤组织的单细胞 。 x l 0 4
图 Z a 类细胞的第一次分裂 . x 3 08
图 3 b类细胞的第一次分裂 。 x 3 08
图 4a 类细胞的第二次分裂 。 “ 3 20
图 5 细胞团 。 x 3 8 0
图 6小愈伤组织 。 x o. 7
图 7 增殖中的愈伤组织 。 x 1. 7
图 8愈伤组织分化出芽 。 x 1. 7
图 9 幼苗的发育。 X 0. 5
图 10再生植株 。 x 0. 7
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2期 天蓝苗荷单细胞培养植株再生 125
图 版